魏秀蓮，劉 瀅，劉雪連*，婁迎霞 ，張 樂，尹靖東

（1.北京市飼料監(jiān)察所，北京 100107；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

飼料中禁用促生長類抗生素給養(yǎng)殖業(yè)帶來了前所未有的挑戰(zhàn)，益生菌作為一類安全、綠色的促生長類抗生素替代品具有廣闊的應(yīng)用前景。國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，羅伊氏乳桿菌作為益生菌制劑添加于動(dòng)物飼料中具有抑制胃腸道病原菌繁殖、改善動(dòng)物免疫力、減少動(dòng)物發(fā)病率、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)動(dòng)物生長、降低耗料增重比等有益效果[1-6]。育雛期是蛋雞生產(chǎn)周期中至關(guān)重要的時(shí)期，雛雞的生長發(fā)育直接影響其后續(xù)生產(chǎn)性能的發(fā)揮。雛雞具有生長迅速、代謝旺盛、消化系統(tǒng)發(fā)育不健全、消化能力弱和抵抗力差等生理特點(diǎn)，改善蛋雛雞體質(zhì)對(duì)于蛋雞生產(chǎn)具有重要意義[7]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已把羅伊氏乳桿菌列入了《飼料添加劑品種目錄》。在羅伊氏乳桿菌產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，通常會(huì)將發(fā)酵液進(jìn)行離心，留下菌體制成凍干粉，上清液做排污處理，造成資源浪費(fèi)和環(huán)保壓力。羅伊氏乳桿菌在蛋雛雞上的應(yīng)用研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)旨在研究添加不同羅伊氏乳桿菌發(fā)酵物對(duì)蛋雛雞生長性能、器官指數(shù)及腸道形態(tài)的影響，以期為羅伊氏乳桿菌在蛋雛雞生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 主要試劑：羅伊氏乳桿菌DBNJP 分離自健康仔豬糞便，保藏于大北農(nóng)集團(tuán)飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；羅伊氏乳桿菌凍干粉：由羅伊氏乳桿菌DBN-JP 菌泥凍干制成（含羅伊氏乳桿菌活菌5.0×1010CFU/kg）；羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液：由羅伊氏乳桿菌DBN-JP 菌在MRS 培養(yǎng)基中37℃，發(fā)酵48 h 制成（含羅伊氏乳桿菌活菌5.0×1010CFU/L）；羅伊氏乳桿菌上清液：由羅伊氏乳桿菌DBN-JP 菌在MRS 培養(yǎng)基中37℃，發(fā)酵48 h 后，10 000 r/min 離心10 min 后，所得上清液經(jīng)121℃，滅菌15 min 制成；上述制劑均由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)用海蘭褐蛋雛雞由唐山玉田大北農(nóng)提供。試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼糧由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司提供。

主要儀器：酶標(biāo)儀（Epoch，Thermo）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（QuantStudio，賽默飛）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)地點(diǎn)在北京海華恒盛養(yǎng)殖場進(jìn)行，試驗(yàn)雞舍及配備的蛋雛雞養(yǎng)殖設(shè)備均由該養(yǎng)殖場提供。試驗(yàn)選取體重（36.17±0.14）g 的1 日齡海蘭褐蛋雛雞1 200 只，隨機(jī)分為4 組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50 只。其中，凍干粉組為：基礎(chǔ)飼料+羅伊氏乳桿菌凍干粉1 kg/t；發(fā)酵液組為：基礎(chǔ)飼料+羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液1 L/t；上清液組為：基礎(chǔ)飼料+羅伊氏乳桿菌上清液1 L/t；對(duì)照組：僅飼喂基礎(chǔ)飼料；采用3 層籠養(yǎng)的方式，預(yù)試期3 d，正試期39 d?；A(chǔ)飼糧參照NRC（1994），并結(jié)合《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 332004）配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。試驗(yàn)期間自由采食，飲水充足，日常雞舍管理方案和相關(guān)免疫程序依照雞場育雛場規(guī)范實(shí)行。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能 試驗(yàn)期間每天準(zhǔn)確記錄死淘只數(shù)和腹瀉只數(shù)；于蛋雛雞日齡8、15、22、29、36、43 日齡08:00 空腹稱重。稱重前一天20:00 斷料，飲水自由，以各重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)體重、耗料量、脛長，計(jì)算體重均勻度、平均日采食量、脛長均勻度、死淘率。

體重均勻度=[平均體重×（1±10%）的樣本數(shù)量/總抽測樣本數(shù)量]×100%

平均日采食量=試驗(yàn)期總采食量/試驗(yàn)期

平均日增重=（末重-初重）/天數(shù)

耗料增重比=平均日采食量/平均日增重

脛長均勻度=[ 平均脛長×（1±5%）的樣本數(shù)量/總抽測樣本數(shù)量]×100%

死淘率=死亡只數(shù)/總只數(shù)×100%

1.3.2 器官指數(shù) 于蛋雛雞43 日齡，每個(gè)重復(fù)挑選4 只接近平均體重的蛋雛雞進(jìn)行屠宰，屠宰前一天20:00 斷料，飲水自由。屠宰后，完整摘取試驗(yàn)雞的內(nèi)臟器官稱重，計(jì)算蛋雛雞器官指數(shù)。

器官指數(shù)=器官鮮重/活體重×100%

1.3.3 腸道形態(tài) 于蛋雛雞43 日齡，每個(gè)重復(fù)挑選10只接近平均體重的蛋雛雞進(jìn)行屠宰，屠宰前一天20:00斷料，飲水自由。分離十二指腸、空腸和回腸，分別取中段1.5～2 cm；用生理鹽水沖洗干凈后置于10%福爾馬林溶液中固定、密封，在4℃冰箱放置24 h，制作石蠟切片，H.E.染色，用光學(xué)顯微鏡及圖像處理系統(tǒng)測定腸道絨毛高度和隱窩深度，計(jì)算絨毛高度和隱窩深度比值（絨隱比）。

1.3.4 盲腸內(nèi)容物菌群 將含有大腸桿菌、乳酸桿菌和沙門氏菌目的片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別建立各菌群的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用實(shí)時(shí)熒光定量方法對(duì)所有樣本拷貝數(shù)進(jìn)行測定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同微生物的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用IBM SPASS Statistics 24 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），運(yùn)用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，以P＜0.05 判斷差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞生長性能的影響 由表2 可知，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液可以降低1～7 日齡以及29～35 日齡的蛋雛雞死淘率，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉和發(fā)酵液可顯著降低36～42 日齡蛋雛雞的死淘率；飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液可顯著提高15～21、29～35、1～42 日齡蛋雛雞的平均日增重；飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液可顯著降低1～42 日齡蛋雛雞的耗料增重比。

表2 羅伊氏乳桿菌對(duì)1～42 日齡蛋雛雞生長性能的影響

2.2 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞器官指數(shù)的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液可顯著提高腺胃指數(shù)；飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉可顯著提高盲腸指數(shù)，其他器官指數(shù)無顯著變化。

表3 羅伊氏乳桿菌對(duì)1～42 日齡蛋雛雞器官指數(shù)的影響 %

2.3 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞腸道形態(tài)的影響 由表4 可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液對(duì)十二指腸、空腸絨毛高度和絨隱比沒有顯著影響。

表4 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞小腸形態(tài)的影響

2.4 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞盲腸內(nèi)容物菌群的影響 由表5 可知，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、上清液、發(fā)酵液盲腸內(nèi)容物中的大腸桿菌數(shù)量顯著降低；添加羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液和上清液，盲腸內(nèi)容物中的沙門氏菌數(shù)量顯著降低，添加羅伊氏乳桿菌凍干粉對(duì)沙門氏菌數(shù)量影響不顯著；飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液，盲腸內(nèi)容物中乳桿菌數(shù)量顯著提高，添加上清液對(duì)盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量影響不顯著。

表5 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞盲腸內(nèi)容物菌群的影響 Lg（CFU/g）

3 討 論

3.1 羅伊氏乳桿菌對(duì)雛雞生長性能的影響 羅伊氏乳桿菌是一種專性異型發(fā)酵菌株，對(duì)動(dòng)物胃腸道酸堿環(huán)境具有較好的適應(yīng)能力。羅伊氏乳桿菌具有多種生物學(xué)功能，尤其在動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)節(jié)和促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育方面發(fā)揮重要作用[8-9]。羅伊氏乳桿菌可產(chǎn)生多種酶、氨基酸和維生素等對(duì)動(dòng)物有益的物質(zhì)，能夠促進(jìn)畜禽對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，改善動(dòng)物生長性能[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉可顯著提高15～21、29～35 日齡蛋雛雞的平均日增重，且可顯著提高1～42 日齡的平均日增重，降低料重比，降低蛋雛雞1～7、29～42 日齡的死淘率，這與邵洪偉等[12]、何穎等[13]、王晶等[14]、李文立等[15]、袁華根[16]的研究結(jié)果相似，說明在飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉具有提高蛋雛雞生長性能的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，與凍干粉組相比，發(fā)酵液組和上清液組對(duì)相同時(shí)期蛋雛雞的平均日增重、料重比、死淘率的影響差異不顯著，這說明在蛋雛雞飼糧中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、上清液、發(fā)酵液均具有提高蛋雛雞平均日增重，降低耗料增重比和死淘率的作用。在實(shí)際生產(chǎn)中，常將羅伊氏乳桿菌發(fā)酵上清液作為廢棄物排污，根據(jù)本研究結(jié)果，可探討是否可將羅伊氏乳桿菌發(fā)酵上清液作為提高蛋雛雞生長性能的產(chǎn)品進(jìn)行開發(fā)，合理利用資源，避免資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。

體重均勻度和脛長均勻度是蛋雞育雛期的重要指標(biāo)，根據(jù)海蘭褐商品蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，42 日齡體重均勻度、脛長均勻度達(dá)標(biāo)率對(duì)后期蛋雞的產(chǎn)蛋性能有重要影響[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液對(duì)1～42 日齡蛋雛雞的體重均勻度和脛長影響不顯著。

3.2 羅伊氏乳桿菌對(duì)雛雞器官指數(shù)的影響 蛋雛雞1～42日齡是內(nèi)臟器官發(fā)育的重要時(shí)期[18]，本研究結(jié)果表明，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉可以顯著提高蛋雛雞腺胃指數(shù)和盲腸指數(shù)，對(duì)其他器官指數(shù)如法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)等影響不明顯；本研究結(jié)果還表明，僅凍干粉組顯示盲腸指數(shù)顯著提高，添加發(fā)酵液組的盲腸指數(shù)凍干粉組和對(duì)照組相比變化不顯著，添加上清液組與對(duì)照組相比變化不顯著。盲腸是微生物的主要活動(dòng)場所，凍干粉組和發(fā)酵液組中更高的活菌數(shù)可能對(duì)盲腸指數(shù)提高起到重要作用；而凍干粉組比發(fā)酵液組盲腸器官指數(shù)更高，可能與凍干粉組的凍干保護(hù)劑對(duì)菌體具有保護(hù)作用，到達(dá)盲腸的活菌數(shù)更高而引起的；但因乳酸菌對(duì)器官指數(shù)影響的報(bào)道不多，具體原因還需更進(jìn)一步探討。

3.3 羅伊氏乳桿菌對(duì)雛雞腸道形態(tài)的影響 益生菌可通過促進(jìn)腸道發(fā)育，維護(hù)腸黏膜形態(tài)健康來提高蛋雛雞的生長性能[19]，小腸是家禽消化、吸收食物營養(yǎng)的主要場所，腸道結(jié)構(gòu)的完整性關(guān)系到動(dòng)物生長速度，小腸的腸絨毛高度、隱窩深度及其比值是衡量腸道發(fā)育的重要指標(biāo)[20-22]。Yihb 等[23]、Olsonjk 等[24]研究表明，給新生仔豬灌服羅伊氏乳桿菌具有促進(jìn)腸絨毛發(fā)育的作用。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在1～42 日齡蛋雛雞飼糧中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液對(duì)十二指腸、空腸絨毛高度、隱窩深度和絨隱比均沒有顯著影響，這可能與動(dòng)物品種和菌株差異性有關(guān)。

3.4 羅伊氏乳桿菌對(duì)盲腸內(nèi)容物菌群的影響 益生菌進(jìn)入消化道后，具有維持腸道菌群平衡，促進(jìn)有益菌生長的有益效果[25]。乳酸桿菌作為畜禽腸道主要的有益菌群，具有改善腸道功能，提高飼料消化率和生物效價(jià)作用，同時(shí)可以抑制腸道致病菌生長，提高機(jī)體免疫力[26-27]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉具有降低盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌、沙門氏菌數(shù)量，提高乳桿菌數(shù)量的有益效果，這與張亞蘭等[28]、張雷等[29]的研究結(jié)果類似，說明飼料中添加羅伊氏乳桿菌可通過調(diào)節(jié)腸道菌群來改善家禽的生產(chǎn)性能。本研究還發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液和上清液也具有降低雛雞盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌和沙門氏菌的作用，且與凍干粉組差異不顯著，這說明在抑制病原菌方面，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液、上清液具有類似效果。但相比于對(duì)照組，凍干粉組對(duì)盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量的影響更顯著，發(fā)酵液組次之，上清液乳酸桿菌數(shù)量也有上升趨勢，但差異不顯著，這可能與凍干粉和發(fā)酵液中羅伊氏乳桿菌活菌數(shù)更高有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果證明，在飼糧中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、上清液或發(fā)酵液具有提高蛋雛雞生產(chǎn)性能、降低死淘率、促進(jìn)雛雞腺胃、盲腸器官發(fā)育、調(diào)節(jié)盲腸內(nèi)容物腸道菌群的有益效果，綜合比較，凍干粉組效果最好。