邵順成，閆背背，張?zhí)炻?，?鵬，鄒詩凡，李新海，馮登偵

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750000）

綿羊的生殖活動(dòng)受下垂體、丘腦、性腺軸等相關(guān)激素的相互調(diào)節(jié)，各種激素對(duì)綿羊的生殖活動(dòng)起到至關(guān)重要的作用。促黃體素（LH）可促進(jìn)卵泡發(fā)育和排卵，其對(duì)卵巢發(fā)育的作用由促黃體素受體（Luteinizing Hormone Receptor,LHR）介導(dǎo)，LHR的表達(dá)隨著排卵前卵泡的發(fā)育而逐漸增加，綿羊LHR基因在多種組織和器官中表達(dá)，其可以促進(jìn)母羊卵泡的發(fā)育和成熟[1]。LHR 是G 蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptor,GPCR）超家族糖蛋白受體中的一員，該家族包含眾多膜蛋白家族，這些受體可感應(yīng)各種信號(hào)分子，激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路[2-3]。近年來，學(xué)者發(fā)現(xiàn)LHR基因影響多種動(dòng)物的繁殖性能，如LHR基因第11 外顯子的3 個(gè)SNPs 與牛的繁殖性狀有關(guān)[4]；Yu 等[5]人發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦牛LHR基因的錯(cuò)義突變可能會(huì)改變LHR基因區(qū)域的結(jié)構(gòu)，降低LH 的活性，通過直接和間接機(jī)制增強(qiáng)胚胎發(fā)育，故該基因與母牛的超排卵性狀有一定的關(guān)聯(lián)性；LHR在鴨子的性腺中表達(dá)，尤其是在卵泡顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中高表達(dá)，并且LHR表達(dá)與鴨的產(chǎn)蛋量之間存在正相關(guān)，故LHR基因在促進(jìn)產(chǎn)蛋方面發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[6]，且研究發(fā)現(xiàn)LHR基因SNPs 與人類的多囊卵巢癥、卵巢相關(guān)疾病有一定的關(guān)聯(lián)性[7-8]，因此研究該基因的多態(tài)性關(guān)聯(lián)可能有助于更好地了解相關(guān)生殖系統(tǒng)類疾病。綿羊LHR基因位于3 號(hào)染色體上，有11 個(gè)外顯子，其對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育排卵起重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，甘加藏羊在發(fā)情間期LHR 在子宮表達(dá)量最高，尤其在宮腺體細(xì)胞、肌層平滑肌、細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞中分布最多，LHR基因?qū)Ω始硬匮虻姆敝称鸬搅苏{(diào)控作用[10]。FecB基因已被證實(shí)可以影響綿羊的排卵率和產(chǎn)仔數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)攜帶FecB基因母羊的卵巢和卵巢卵泡中，LHR的表達(dá)水平相對(duì)較高[11-12]，大多學(xué)者認(rèn)為在卵巢中高表達(dá)的LHR會(huì)延遲優(yōu)勢(shì)卵泡的凋亡，從而增加排卵數(shù)量。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以寧夏5 個(gè)綿羊群體為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將LHR基因作為影響綿羊繁殖性能的候選基因，探究LHR基因4 個(gè)SNP 位點(diǎn)在5 個(gè)群體中的多態(tài)性并與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為揭示綿羊高繁殖力調(diào)控提供分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 采集5 個(gè)綿羊群體共768 只綿羊的耳組織，其中有產(chǎn)羔數(shù)記錄的599 只（表1）。實(shí)驗(yàn)羊群均為母羊，來自寧夏宇泊科技有限公司。所有羊只均采用頸靜脈采血，檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。同時(shí)記錄各群體母羊的產(chǎn)羔季節(jié)、胎次與產(chǎn)羔數(shù)。

表1 實(shí)驗(yàn)羊群信息

1.2 基因組DNA 提取 綿羊血液樣本使用血液/ 組織DNA 磁珠法提取試劑盒對(duì)DNA 進(jìn)行提取，DNA 質(zhì)量利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 引物設(shè)計(jì) Mass ARRAY Assay Design 3.1 軟件用于設(shè)計(jì)LHR基因4 個(gè)位點(diǎn)的單堿基延伸引物和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序。

1.4 數(shù)據(jù)處理 使用Microsoft Excel 2016 軟件對(duì)綿羊LHR基因的4 個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率、基因頻率、期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）、多態(tài)信息含量（PIC）和有效等位基因數(shù)（Ne）等進(jìn)行計(jì)算，并進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)。用SPSS 25.0 軟件程序中一般線性模型完成5 個(gè)綿羊群體各基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析，其中產(chǎn)羔數(shù)/產(chǎn)羔次數(shù)為每只羊的最終產(chǎn)羔數(shù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液DNA 檢測(cè)結(jié)果 利用NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)5 個(gè)綿羊群體羊只的DNA 純度、濃度和完整性。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所提取的DNA 單個(gè)樣品濃度都在50 ng/μL 以上，且OD260nm/OD280nm比值都在1.8～2.0 范圍內(nèi)。電泳條帶清晰，其條帶見圖1。

圖1 綿羊部分基因組DNA 電泳圖

2.2LHR基因多態(tài)性分析 通過觀察圖2 基因分型結(jié)果可知，LHR基因rs401906902 位點(diǎn)在雜一代、雜二代、橫交一代和灘寒羊4 個(gè)群體中有AA、AT、TT 3種基因型，在杜泊羊群體中有AA、AT 2 種基因型；rs398733991 位點(diǎn)在杜泊羊、雜一代、橫交一代和灘寒羊4 個(gè)群體中有CC、CT、TT 3 種基因型，在雜二代群體中有CC、CT 2 種基因型；rs424328324 位點(diǎn)在5個(gè)群體中有AA、CA、CC 3 種基因型；rs410734874位點(diǎn)在5 個(gè)群體中有AA、TA、TT 3 種基因型。

2.3LHR基因4 個(gè)位點(diǎn)在5 個(gè)綿羊群體中的群體遺傳學(xué)分析LHR基因rs401906902 位點(diǎn)在5 個(gè)群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)。rs398733991 位點(diǎn)在灘寒羊群體中表現(xiàn)為中度多態(tài)，在杜泊羊、雜一代、雜二代和橫交一代4 個(gè)群體中表現(xiàn)低度多態(tài)。rs424328324、rs410734874 2 個(gè)位點(diǎn)在5 個(gè)群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)。經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)分析，rs401906902、rs398733991、rs410734874 3 個(gè)位點(diǎn)在5 個(gè)群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，表明這3 個(gè)位點(diǎn)在5 個(gè)群體中已趨于穩(wěn)定。rs424328324 位點(diǎn)除橫交一代群體外，在其他群體處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，說明這3 個(gè)群體可能不受群體選育措施的影響，處于群體遺傳平衡狀態(tài)，詳情見表2。

表2 LHR 基因4 個(gè)位點(diǎn)的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.4LHR基因4 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 對(duì)LHR基因4 個(gè)位點(diǎn)的不同基因型與5 個(gè)群體的產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明rs410734874 位點(diǎn)在橫交一代群體中與產(chǎn)羔數(shù)有一定的關(guān)聯(lián)性，其中TT 型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TA 型，說明rs410734874 位點(diǎn)適用于橫交一代綿羊群體多羔性狀的選育。rs401906902、rs398733991、rs424328324 3 個(gè)位點(diǎn)各基因型之間產(chǎn)羔數(shù)差異均不顯著，不適用于綿羊多羔性狀的選育，詳見表3。

表3 LHR 基因4 個(gè)位點(diǎn)各基因型產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

促性腺激素受體由FSHR 和LHR 組成，在許多組織中都可以檢測(cè)到它們的表達(dá)，在顆粒細(xì)胞中，F(xiàn)SH 的刺激對(duì)于LHR 表達(dá)至關(guān)重要，但FSHR 僅與FSH 結(jié)合，而LHR 可以與LH 和人絨毛膜促性腺激素（hCG）相結(jié)合，LHR基因的啟動(dòng)子包含特異性蛋白1（SP1），類固醇生成因子1 和AP-2 的結(jié)合位點(diǎn)，在這些結(jié)合位點(diǎn)中，據(jù)報(bào)道SP1 結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于激活cAMP 誘導(dǎo)的LHR轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要[13-14]。Pakarainen 等[15]人發(fā)現(xiàn)在敲除小鼠的LHR基因后，高劑量的FSH 也不能誘導(dǎo)小鼠卵泡的發(fā)育和排卵，所以該基因?qū)β殉差惞檀技に氐漠a(chǎn)生和卵泡的成熟至關(guān)重要。近年來，學(xué)者加大對(duì)綿羊LHR的研究，如寸靜宇[16]等發(fā)現(xiàn)小尾寒羊LHR基因的3個(gè)位點(diǎn)（g.75747421A＞C、g.75748150A＞G、g.75741060A＞C）與小尾寒羊各胎產(chǎn)羔數(shù)呈顯著性相關(guān)，并且LHR基因在多羔群體卵巢與下丘腦的表達(dá)均極顯著高于單羔群體。因此研究綿羊LHR基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析對(duì)綿羊的繁殖性能具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)利用Sequenom Mass ARRAY?SNP 技術(shù)對(duì)LHR基因4 個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)rs401906902 位點(diǎn)在5 個(gè)群體間表現(xiàn)為低度多態(tài)，說明該位點(diǎn)在5 個(gè)綿羊群體中具有較小的選擇潛力，但值得注意的是該位點(diǎn)TT 基因型在雜二代群體的產(chǎn)羔數(shù)均高于其他群體，在實(shí)驗(yàn)基地中雜交群體母羊平均產(chǎn)羔數(shù)高于4 只的較少見，故TT 基因型可能是該群體母羊產(chǎn)多羔的遺傳標(biāo)記，但因該基因型在雜二代群體中數(shù)量較少，是否會(huì)真的影響綿羊的繁殖性能需進(jìn)一步深入研究。rs398733991、rs424328324 2 個(gè)位點(diǎn)各基因型與產(chǎn)羔數(shù)表型數(shù)據(jù)均無顯著關(guān)聯(lián)，說明這2 個(gè)位點(diǎn)可能不是影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的優(yōu)勢(shì)位點(diǎn)。但王翔宇等[17]發(fā)現(xiàn)LHR基因rs424328324（g.75741060A＞C）位點(diǎn)在魯中肉羊第4 胎CC 型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA 型和CA 型，認(rèn)為增加g.75741060A＞C 位點(diǎn)C 的頻率，可以增加魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，因遺傳因素和環(huán)境因素不同，具有不同遺傳背景的綿羊的繁殖能力具有差異性[18-19]。rs410734874 位點(diǎn)在橫交一代群體中與產(chǎn)羔數(shù)有一定的關(guān)聯(lián)性，TT 型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TA型（P＜0.05），其中TT 基因型個(gè)體平均產(chǎn)羔數(shù)比TA型個(gè)體高0.49 只，說明rs410734874 位點(diǎn)適用于橫交一代綿羊群體多羔性狀的選育，但橫交一代群體數(shù)量較少，故后期應(yīng)加大檢測(cè)力度，以充分的證據(jù)去證明該位點(diǎn)的確會(huì)影響綿羊的繁殖性能。并且本課題組前期以杜泊羊、灘羊、小尾寒羊、灘寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)LHR基因的相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)s410734874 具有較高的多態(tài)性，并且灘羊的A 突變極顯著高于灘寒羊，而灘羊本來繁殖率較低，這進(jìn)一步證實(shí)該基因可能影響綿羊的繁殖性能[20]。

4 結(jié) 論

本研究表明：rs410734874 位點(diǎn)在橫交一代群體中與產(chǎn)羔數(shù)有一定的關(guān)聯(lián)性，其中TT 型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TA 型，說明rs410734874 位點(diǎn)適用于橫交一代綿羊群體多羔性狀的選育；rs401906902、rs398733991、rs424328324 3 個(gè)位點(diǎn)各基因型之間產(chǎn)羔數(shù)差異均不顯著，不適用于綿羊多羔性狀的選育。本研究為進(jìn)一步尋找控制綿羊多羔性狀的分子遺傳標(biāo)記位點(diǎn)提供參考。