黎明明，李 璐，解新安，李 雁

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate, EGCG）是一種從綠茶中提取的具有極強(qiáng)抗氧化能力和清除自由基能力的茶多酚單體，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗炎、抗腫瘤等功效[1]。但是EGCG的生物利用率卻很低，人體攝入茶多酚后，由于其易被氧化分解的特性，只有少量的EGCG能順利達(dá)到小腸從而被人體有效吸收，此外兒茶素間也會發(fā)生一定程度的結(jié)合，這些因素共同導(dǎo)致了EGCG的低生物利用率[2]。辛烯基琥珀酸酐淀粉（OSA淀粉）同時具有親水性和疏水性，以及一定的抗氧化性，使其不僅在水環(huán)境中能較好地控制生物活性化合物的釋放[3]，而且能與被運(yùn)載物很好地有機(jī)結(jié)合，在有效控釋目標(biāo)物的同時也能發(fā)揮自身的抗氧化性。因此，OSA淀粉被廣泛應(yīng)用于各種生物活性化合物的運(yùn)載體系。

目前對淀粉-多酚復(fù)合物的制備多采用高溫加熱糊化法[4]。Wang等[5]將阿魏酸溶于氫氧化鉀溶液并在80 ℃下與玉米淀粉糊混合作用1 h，得到阿魏酸-高直鏈玉米淀粉復(fù)合物，抗氧化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)合物具有一定的抗氧化能力，但此法加熱時產(chǎn)生的高溫可能導(dǎo)致復(fù)合物熱降解與酚類化合物氧化[6]。也有學(xué)者用較為新穎的方法對EGCG進(jìn)行包埋，如Patel等[7]將水溶性的纖維素衍生物聚合物以一定濃度滴到 EGCG 溶液中，后經(jīng)過冷凍干燥制備出運(yùn)載量25%（w/w）的多酚聚合物玻璃粉末，并具有較強(qiáng)的抗氧化能力。以上這些技術(shù)提高了 EGCG 的利用率和使用范圍，但EGCG的包埋率仍然較低，且處理方法較為復(fù)雜，成本經(jīng)濟(jì)消耗比較高[8]。

高壓均質(zhì)技術(shù)能在短時間內(nèi)通過高壓剪切力作用于目標(biāo)物體上，淀粉類物質(zhì)通過高壓均質(zhì)，能破壞淀粉分子的有序長鏈結(jié)構(gòu)及其分子平均粒徑大小和晶型[9]。Cui等[10]用高壓均質(zhì)法制備了稻米淀粉-脂肪酸復(fù)合物，并研究高壓均質(zhì)對其結(jié)構(gòu)變化及與消化率之間的關(guān)系。結(jié)果表明，經(jīng)過高壓均質(zhì)制備的淀粉-脂肪酸復(fù)合物為具有更高程度的短程有序結(jié)構(gòu)的V型多晶型物，并且結(jié)晶度、有序結(jié)構(gòu)度和熱穩(wěn)定性均得到提高。Sentandreu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與巴氏殺菌果汁中總類胡蘿卜素的生物可及性相比，經(jīng)過高壓均質(zhì)的樣品的生物可及性提高了五倍，表明粒徑減小對促進(jìn)消化酶作用具有積極效果，并且在消化過的樣品膠束中檢測到環(huán)氧類胡蘿卜素的含量明顯增加，從而得出高壓均質(zhì)能提高果汁中類黃酮的生物可及性的結(jié)論。高壓均質(zhì)不僅能從結(jié)晶度、粒徑等物理結(jié)構(gòu)層面改變樣品體系的理化性質(zhì)，而且有增加體系穩(wěn)定性與樣品生物活性的潛力[12]。將高壓均質(zhì)技術(shù)運(yùn)用到構(gòu)建淀粉-多酚復(fù)合物體系，對增加淀粉對多酚的包埋率及提升多酚的生物活性有重要意義。

綜上所述，為了簡化操作步驟，節(jié)約成本，同時減少高溫對于復(fù)合體的影響，本文以EGCG與OSA玉米淀粉為原料，通過加熱、高壓均質(zhì)以及先均質(zhì)后加熱三種方式制備EGCG-OSA復(fù)合體，測定其抗氧化性，表征理化性質(zhì)，為EGCG在淀粉-多酚復(fù)合物制品中的廣泛應(yīng)用提供理論及技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

OSA玉米淀粉 佛山市南海華昊華豐淀粉有限公司；無水乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；DPPH試劑 上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ABTS試劑 Bomei公司；EGCG 源葉生物有限公司。

Vertex 70型傅里葉變換紅外光譜儀 布魯克公司；Mastersizer 3000型激光粒度分析儀 Malvern公司；EVO MA 15型掃描式電子顯微鏡 ZEISS公司；Ulitma型X射線多晶粉末儀 Rigaku公司；MCR502模塊化智能型高級流變儀 安東帕公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OSA玉米淀粉與EGCG復(fù)合體的制備

1.2.1.1 加熱糊化法 稱取3 g OSA淀粉和0.3 g EGCG（淀粉干基的 10%）均勻分散于150 mL蒸餾水中。后將混合物懸浮液進(jìn)行95 ℃水浴30 min。冷凍干燥后將樣品研磨并過100目篩，置于干燥器保存，待用。記為復(fù)合物Ⅰ型。

1.2.1.2 高壓均質(zhì)法 準(zhǔn)確稱取3 g的OSA淀粉和0.3 g EGCG，加入150 mL蒸餾水，將混合乳液置于高壓均質(zhì)機(jī)中。處理參數(shù)：常溫，壓力為100 MPa，處理次數(shù)為5次[13]。冷凍干燥后將樣品研磨并過100目篩，置于干燥器保存，待用。記為復(fù)合物Ⅱ型。

1.2.1.3 先均質(zhì)后加熱法 在高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后（條件同上）將樣品進(jìn)行95 ℃水浴30 min。冷凍干燥后將樣品研磨并過100目篩，置于干燥器保存，待用。記為復(fù)合物Ⅲ型。

1.2.2 紅外光譜測定 用天平稱取3 mg的樣品與100 mg溴化鉀粉末，混合均勻后在干燥環(huán)境下于瑪瑙研缽中研磨至顆粒狀，在壓片機(jī)中進(jìn)行30 s的壓片后裝片，選用空白溴化鉀片作為空白對照，通過Vertex 70型傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測試，波數(shù)掃描范圍為 450~4000 cm?1[14]。

1.2.3 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）測定 采用銅靶 Cu，掃描范圍為 3~45°，步長 0.02°，發(fā)散狹縫、防散射狹縫、接受狹縫的設(shè)置分別為1.0、1.0、0.3 mm。用Ulitma型X射線多晶粉末儀測量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用MDI Jade 5.0軟件進(jìn)行分析[15]。

1.2.4 黏度測定 利用MCR502高級旋轉(zhuǎn)流變儀測定復(fù)合體及OSA玉米淀粉的黏度。將樣品用去離子水溶解并制備成4%淀粉漿后，95 ℃下在水浴中連續(xù)攪拌糊化20 min，用移液槍將樣品滴在流變儀的平板的凹槽內(nèi)，用紙刮去多余的樣品溶液后進(jìn)行測量。測定條件：測試溫度為25 ℃，初始取點(diǎn)為每秒10次，最終取點(diǎn)為每秒1次，間隙500 mm，剪切速率為 0.1~100 s?1[16]。

1.2.5 分子粒徑測定 用Mastersizer 3000型激光粒度分析儀對OSA玉米淀粉與三種復(fù)合體進(jìn)行粒度分布測定，先將樣品用去離子水溶解并制備成濃度為5 mg/mL的待測液，后清洗一次儀器并初始化儀器調(diào)整其吸光度達(dá)到70%以上，將樣品用移液槍滴入樣品槽，根據(jù)激光衍射法，每次進(jìn)行三次測定并取平均值，經(jīng)軟件自動處理數(shù)據(jù)分析得出粒徑分布[17]。

1.2.6 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀測 用牙簽分別蘸取少量EGCG-OSA 淀粉復(fù)合體或OSA淀粉并用雙面膠固定在鋁墊上，用洗耳球吹去多余粉末，噴金，標(biāo)號，用EVO MA 15型掃描式電子顯微鏡進(jìn)行觀測[18]。

1.2.7 抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH自由基清除率測定 取4.00 mg DPPH固體粉末，用無水乙醇配制成濃度為0.200 mmol/L的DPPH溶液，備用[19]。取5 mg三種復(fù)合體溶于5 mL水中，配制成1 mg/mL濃度的樣品溶液，備用。將三種復(fù)合體溶液與 DPPH溶液等體積混合并且搖勻，編號，常溫下置于避光環(huán)境中30 min后，測量其吸光度。之后保持常溫下避光保存，每隔10 d取樣測定吸光度。將測量數(shù)據(jù)按下列公式進(jìn)行計(jì)算，得到復(fù)合體的DPPH自由基清除率[20]。

式中，A0為DPPH乙醇溶液在517 nm處的吸光值；Ai為三種復(fù)合體溶液與DPPH自由基作用后吸光度值；Aj為三種復(fù)合體與無水乙醇混合后的吸光度值。

1.2.7.2 ABTS自由基清除率測定 用天平稱取96.0 mg ABTS固體粉末與16.6 mg過硫酸鉀固體粉末，用去離子水溶解并定容至25 mL[21]；將兩種溶液等體積比混合，于室溫下避光環(huán)境中靜置15 h，作為儲備液。用去離子水稀釋儲備液，使其在734 nm波長處的吸光度值為（0.700±0.02）。取5 mg三種復(fù)合體溶于5 mL水中，配制成1 mg/mL濃度的樣品溶液，備用[22]。用移液槍吸取0.2 mL待測液并滴入裝有3.8 mL ABTS工作液的試管中,于避光環(huán)境中混合6 min后，在734 nm波長下測量其吸光度。將所得數(shù)據(jù)按下列公式計(jì)算[23]。

式中，A0為ABTS工作液吸光度值；Ai為ABTS自由基與樣品溶液反應(yīng)后的吸光度值；Aj為樣品溶液與乙醇混合后的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)至少做3個平行，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖，P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析

由圖1可得，和OSA玉米淀粉相比較，三種復(fù)合物的制備過程中并沒有引入新的化學(xué)鍵和基團(tuán)，因此吸收峰的位置與種類幾乎沒有改變。707 cm?1處是淀粉的特征吸收峰，2930 cm?1為C-H特征伸縮振動，3000~3700 cm?1代表不同種類的羥基特征峰，其中3400 cm?1附近是-OH伸縮振動峰[24]。EGCG與OSA淀粉分子內(nèi)和分子間所產(chǎn)生的氫鍵會使電子云密度降低，從而伸縮振動頻率降低[25]，波數(shù)為1564、1644、1721 cm?1的三個位置分別表示RCOO-的不對稱伸縮振動吸收特征峰、水的彎曲振動特征峰和酯羰基C=O的伸縮振動吸收峰，由圖可以看出，與OSA玉米淀粉相比，三種復(fù)合體的這三個吸收峰強(qiáng)度均明顯降低，說明EGCG中的-OH基與OSA玉米淀粉中的-OH基發(fā)生了締合、疊加，包埋后分子間形成了更多的羥基，產(chǎn)生了更多的氫鍵[26]，從而改變了特征峰峰型。

圖1 OSA玉米淀粉和三種復(fù)合體的FTIR圖Fig.1 FTIR chart of OSA corn starch and three EGCG-OSA complexes

2.2 XRD分析

淀粉顆粒包含結(jié)晶區(qū)域和非晶區(qū)域。晶體區(qū)域具有相對致密的結(jié)構(gòu)，非晶區(qū)主要由直鏈淀粉分子和直鏈淀粉的分叉結(jié)構(gòu)形成，而既有結(jié)晶區(qū)又有非結(jié)晶區(qū)的結(jié)構(gòu)稱為半結(jié)晶結(jié)構(gòu)，由含有直鏈淀粉的無定形區(qū)域和以支鏈淀粉為主要化合物的結(jié)晶區(qū)域組成，且可以通過廣角X射線衍射來確定其相對結(jié)晶度[27]。根據(jù)衍射峰的位置不同，主要分為A型、B型和C型。

從圖2可以看出，OSA玉米淀粉在17°會有特征衍射峰，形成B型結(jié)晶[28]，而與EGCG通過不同方法復(fù)合后，其結(jié)晶峰位置并沒有發(fā)生改變，但衍射峰的形狀發(fā)生一定改變，且17°的衍射峰強(qiáng)度有所減弱，結(jié)晶度減小，這可能是由于在復(fù)合時，高溫作用與均質(zhì)剪切力對原OSA玉米淀粉的結(jié)晶區(qū)產(chǎn)生了一定的破壞。

圖2 OSA玉米淀粉與三種復(fù)合體的XRD圖Fig.2 XRD chart of OSA corn starch and three EGCG-OSA complexes

2.3 三種復(fù)合體的流變學(xué)特性分析

EGCG-OSA玉米淀粉復(fù)合體與OSA玉米淀粉黏度隨剪切速率的變化曲線如圖3所示?？梢娖漯ざ染S著剪切速率的增加而降低，呈現(xiàn)出剪切變稀的特性，為假塑性流體[9]。與EGCG復(fù)合后，由于EGCG的羥基與OSA玉米淀粉都具有一定的持水性，以及EGCG與OSA玉米淀粉之間形成的氫鍵，造成了黏度的降低；除了形成氫鍵作用外，還有EGCG的疏水基團(tuán)苯環(huán)與OSA玉米淀粉的疏水長鏈發(fā)生疏水相互作用，使得體系的斥力降低，表觀上呈現(xiàn)出黏度降低的現(xiàn)象[2]。

圖3 OSA玉米淀粉與三種復(fù)合體的剪切速率與表觀黏度關(guān)系曲線Fig.3 Relationship between shear rates and apparent viscosity of OSA corn starch and three complexes

三種復(fù)合物粘度相比于OSA淀粉均有所下降，而其中經(jīng)過高壓均質(zhì)所得復(fù)合體的下降幅度比加熱法制備的復(fù)合體更大，據(jù)此推測，經(jīng)過高壓剪切作用后EGCG能與OSA玉米淀粉更好的締合，產(chǎn)生更多的分子間相互作用。

2.4 三種復(fù)合體的粒徑分布

由圖4可得，與原OSA玉米淀粉相比，采用加熱法制備的復(fù)合體平均粒徑明顯增大，這是糊化使淀粉顆粒體積增大并且與EGCG分子結(jié)合后的結(jié)果。糊化的OSA玉米淀粉通過毛細(xì)管作用誘導(dǎo)EGCG分子進(jìn)入其網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu)，之后通過分子間氫鍵使EGCG被牢牢吸附在OSA玉米淀粉孔中[29]；采用高壓均質(zhì)和先高壓均質(zhì)后加熱法所制備復(fù)合體的平均粒徑要明顯小于原OSA玉米淀粉，這是由于均質(zhì)剪切的作用，淀粉顆粒被切割成更小的個體，使得平均粒徑明顯減小，其中采用先均質(zhì)后加熱糊化制備的復(fù)合體粒徑呈雙峰分布，這是由于經(jīng)過加熱糊化，一部分顆粒由于糊化膨脹與毛細(xì)管作用，使其體積增大，因此其平均粒徑比僅采用均質(zhì)法制備的復(fù)合體要大。

圖4 OSA玉米淀粉與三種復(fù)合體的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution diagram of OSA corn starch and three complexes

由Mastersizer 3000軟件分析得出OSA玉米淀粉、復(fù)合物Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型的平均粒徑分別為18.3、27.6、5.4、8.5 μm，與圖4 中的結(jié)果一致。

2.5 三種復(fù)合體的微觀形貌

圖5 A是OSA玉米淀粉的SEM圖，可看出OSA玉米淀粉為較規(guī)則的橢圓形或圓形顆粒，其球面結(jié)構(gòu)表面有凹陷，分為多個褶皺曲面，每個褶皺面中間都有明顯的棱狀線條性結(jié)構(gòu)。圖5B和5C分別為經(jīng)過高壓均質(zhì)與加熱制備的復(fù)合體微觀形貌，可以看出，經(jīng)過高壓均質(zhì)的復(fù)合體被切割成大小不一形狀不規(guī)則的顆粒；而經(jīng)過加熱的復(fù)合體變得破裂、扭曲、表面粗糙且互相粘連，表明加熱處理使淀粉內(nèi)部發(fā)生糊化，結(jié)晶結(jié)構(gòu)遭到破壞[30]。三種復(fù)合體經(jīng)過研磨后顆粒形態(tài)均被破壞，有部分片狀EGCG顆粒粘附在受損的淀粉顆粒表面，表面有深淺不一的凹陷、空隙和裂縫等特征，顆粒在形態(tài)上的變化可能是由于受到研磨中的摩擦力和沖擊作用的影響，其中經(jīng)過先高壓均質(zhì)后加熱的復(fù)合體（圖5D）表面有圓形孔狀結(jié)構(gòu)，可能是高壓剪力與高溫互相作用的結(jié)果[31]。

圖5 OSA玉米淀粉和三種復(fù)合體的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of OSA corn starch and three EGCG-OSA complexes

2.6 抗氧化性測定

2.6.1 DPPH自由基清除率 從圖6可以看出，在儲藏30 d后，未經(jīng)包埋的EGCG自由基清除率從97.56%下降到41.35%，這是由于未經(jīng)過包埋的EGCG暴露在氧氣與光中，因其易氧化的特性，很快失去了大量的活潑氫，使其DPPH自由基的清除能力也在短時間內(nèi)急劇下降。而用加熱法制備的復(fù)合體自由基清除率從92.8%下降到88.36%，用高壓均質(zhì)制備的復(fù)合體自由基清除率從93.45%下降到88.75%，而用先高壓均質(zhì)后加熱法制備的復(fù)合體自由基清除率從93.47%下降到89.63%。說明OSA玉米淀粉與EGCG復(fù)合之后，EGCG被包埋于改性淀粉內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀封閉環(huán)境中，減小了與外界的氧氣、光的接觸，有效地減緩了其被氧化的速率[32]，另一小部分未被包埋的EGCG位于復(fù)合體的表面，易于被氧化，造成了抗氧化性的下降[33]。

圖6 EGCG與各復(fù)合體的DPPH自由基清除率隨貯藏時間的變化Fig.6 Scavenging rate of DPPH free radicals of EGCG and each complex varies with time

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，用先高壓均質(zhì)后加熱與高壓均質(zhì)制備得出的復(fù)合體的DPPH自由基清除率均高于加熱制備的復(fù)合體，可推測高壓剪切力有助于復(fù)合體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具備更高的包裹性，使更多的EGCG分子被OSA玉米淀粉包埋，進(jìn)入其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

2.6.2 ABTS自由基清除率 由圖7可以看出，在常溫下儲藏30 d后，未經(jīng)包埋的EGCG因暴露而使其ABTS自由基清除率呈現(xiàn)出急劇下降的趨勢，由99.50%下降到60.72%。而三種復(fù)合體的ABTS自由基清除率在儲存期內(nèi)均沒有明顯變化，表明復(fù)合包埋對EGCG活性有良好的保護(hù)作用。另外，用高壓均質(zhì)與先高壓均質(zhì)后加熱制備的復(fù)合體的清除率均稍高于加熱法的復(fù)合體，其中用先均質(zhì)后加熱制備的復(fù)合體擁有最高的ABTS自由基清除率（99.20%），其下降的幅度也最?。?0 d后仍達(dá)到98.66%），這與DPPH自由基清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，因此，用先高壓均質(zhì)后加熱糊化制備的復(fù)合體不僅有較高的抗氧化能力，并且其對EGCG的保護(hù)性也最強(qiáng)。

圖7 各復(fù)合體的ABTS自由基清除率隨貯藏時間的變化Fig.7 ABTS free radical scavenging rate of each complex varies with days

3 結(jié)論

以O(shè)SA玉米淀粉與EGCG為原料，采用加熱、高壓均質(zhì)以及先高壓均質(zhì)后加熱的方法制備了三種淀粉-多酚復(fù)合體，以探究高壓均質(zhì)對EGCG-OSA淀粉復(fù)合體的影響。

對三種復(fù)合體的抗氧化性研究發(fā)現(xiàn)，三種復(fù)合體均有較高的抗氧化性，對EGCG起到了很好的保護(hù)作用。經(jīng)過高壓均質(zhì)制備的復(fù)合體相較于加熱法制備的復(fù)合體有更高的抗氧化性，自由基清除率下降的幅度也較小，其中先高壓均質(zhì)后加熱制備的復(fù)合體在30 d后DPPH清除率達(dá)到89.63%，ABTS自由基清除率達(dá)到98.66%，在復(fù)合體中最高。

傅里葉紅外光譜與X射線衍射的結(jié)果表明，EGCG與OSA玉米淀粉通過分子間的氫鍵發(fā)生了一定程度的締合，沒有新化學(xué)鍵與官能團(tuán)的產(chǎn)生。而流變性研究表明經(jīng)過高壓均質(zhì)的復(fù)合體黏度下降的幅度更大，并且分子粒徑有所減小。

據(jù)此推測，EGCG與OSA淀粉主要通過分子間氫鍵與疏水作用相締合，而與加熱作用相比，高壓均質(zhì)作用能使EGCG與OSA玉米淀粉形成更穩(wěn)定的復(fù)合體，產(chǎn)生更多的氫鍵與疏水作用，綜合來說，通過先高壓均質(zhì)后加熱制備的復(fù)合體有最高的抗氧化性以及儲藏穩(wěn)定性，其綜合效果最好。本研究為EGCG在淀粉類食品的加工及生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。