程世超

(濟(jì)南職業(yè)學(xué)院，山東濟(jì)南 250000)

納米醫(yī)學(xué)是致力于納米材料醫(yī)學(xué)應(yīng)用的科學(xué)領(lǐng)域[1]。近年來，作為治療和診斷試劑，納米材料得到了飛速發(fā)展，與此同時(shí)，靶向給藥的納米給藥系統(tǒng)也取得了重大進(jìn)展[2-3]。因此，為了預(yù)測納米材料在生物體內(nèi)的活動(dòng)規(guī)律，必須了解納米材料在生物界面上發(fā)生的相互作用。納米材料一旦與生物液體接觸并相互作用，就會(huì)暴露在活躍的生物分子(如酶、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸等)中，納米材料表面會(huì)吸附一層或多層蛋白并形成冠狀結(jié)構(gòu)，從而將原納米材料轉(zhuǎn)化為具有生物成分的納米材料，該冠狀結(jié)構(gòu)即所謂的蛋白質(zhì)冠狀結(jié)構(gòu)(蛋白冠)[4-5]。蛋白冠主要由蛋白質(zhì)組成，其他生物分子如糖、核酸和脂類也可能存在，但迄今為止研究甚少[6]。關(guān)于納米材料和血漿蛋白之間相互作用的首次研究是在1996年進(jìn)行的[7]，直到2007年，Lynch等[8]引入了蛋白冠的概念。一旦蛋白冠形成，納米材料的合成屬性被一種新的生物屬性所取代，自身的物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)特性會(huì)受到蛋白冠的影響。有研究表明，納米材料周圍蛋白冠的性質(zhì)和組成可能影響其生物學(xué)特性。因此，蛋白冠的表征和分析是理解蛋白冠形成機(jī)制和功能的關(guān)鍵一步。蛋白冠組成和結(jié)構(gòu)的分析技術(shù)可分為原位法和非原位法。非原位分析技術(shù)要求將蛋白冠-納米材料復(fù)合物從生物環(huán)境中分離出來，即在體外分離和鑒定蛋白。相反，原位分析技術(shù)直接提供了納米材料在生理環(huán)境中分散時(shí)蛋白冠的相關(guān)信息。筆者對納米材料蛋白冠表征方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。首先，介紹了蛋白冠的形成和組成，然后討論了目前應(yīng)用廣泛的蛋白冠的非原位分析技術(shù)。其次，介紹了當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)的蛋白冠原位分析技術(shù)。最后，討論了蛋白冠的分析技術(shù)在體內(nèi)研究的差距、挑戰(zhàn)和未來展望。

1 蛋白冠的形成和組成

納米材料進(jìn)入血液后，會(huì)由于自身高表面能而吸附蛋白，形成蛋白冠。根據(jù)相對親和力的不同，可將蛋白冠分為硬蛋白冠和軟蛋白冠[9]。納米材料表面首先吸附親和力強(qiáng)的蛋白，形成與納米材料表面緊密結(jié)合的硬蛋白冠；然后親和力弱的蛋白吸附在硬蛋白冠外層，不直接與納米材料表面接觸，形成松散結(jié)合的軟蛋白冠。吸附在納米材料上的蛋白質(zhì)處于一個(gè)連續(xù)的解吸/吸附過程。蛋白質(zhì)之間的親和競爭對納米材料表面的吸附是蛋白冠的組成隨時(shí)間變化的原因[10]。

血漿由約4 000種蛋白質(zhì)組成，其中一些蛋白質(zhì)含量比較高[11]，但其與蛋白冠中的相對含量并不一致[12]。當(dāng)納米材料在血漿中孵育時(shí)，約有不同含量的125種蛋白質(zhì)吸附在納米材料表面[13]。這些蛋白質(zhì)大多參與相同的細(xì)胞過程，即補(bǔ)體激活，病原體識(shí)別和凝血。免疫球蛋白G、血清白蛋白、纖維蛋白原、凝聚素和載脂蛋白通常存在于暴露于血漿后的大多數(shù)納米材料的蛋白冠中。盡管在功能上具有相似性，但這些蛋白質(zhì)對納米材料的影響會(huì)受到物理化學(xué)性質(zhì)的調(diào)控。此外，生物環(huán)境如孵化時(shí)間、溫度、pH值和疾病等也會(huì)影響蛋白冠的組成。

2 蛋白冠的非原位分析技術(shù)

非原位分析技術(shù)要求將蛋白冠-納米材料復(fù)合物從生物環(huán)境中分離出來，即在體外分離和鑒定蛋白。由于納米材料的分離會(huì)導(dǎo)致軟蛋白冠的丟失，引起分析結(jié)果不準(zhǔn)確，因此，從血液中分離蛋白冠-納米材料復(fù)合物是在體內(nèi)模型中研究蛋白冠的主要難點(diǎn)之一。納米材料給藥后，離心制備血漿并回收。此時(shí)，蛋白冠-納米材料復(fù)合物需要純化并從未結(jié)合的血漿蛋白中分離。對于磁性納米材料，可采用磁分離方法分離蛋白冠，并精確梯度去除蛋白冠，在離心過程中盡量減少破壞松散結(jié)合的蛋白質(zhì)。如Sakulkhu等[14]采用非原位分析技術(shù)分離超順磁氧化鐵蛋白冠-納米材料復(fù)合物。體內(nèi)相互作用后，基于納米材料磁性和不同的表面電荷，采用高磁場梯度磁反應(yīng)從大鼠血漿中進(jìn)行分離。對于非磁性納米材料，可采用尺寸排除色譜(SEC)結(jié)合膜超濾分離蛋白冠-納米材料復(fù)合物。例如從血漿中回收蛋白冠-金納米材料復(fù)合物，可以通過SEC從未結(jié)合蛋白中分離，然后進(jìn)行膜超濾，從而研究納米材料的大小和形狀在體內(nèi)對蛋白冠的影響[15]。此外，在體內(nèi)試驗(yàn)中回收的脂質(zhì)體納米材料也可以通過SEC結(jié)合膜超濾從過量的血漿蛋白中分離出來。Hadjidemetriou等[16]在對血液進(jìn)行分離后發(fā)現(xiàn)，納米材料在體內(nèi)比體外吸附蛋白質(zhì)的種類更多。蛋白冠顯著降低了MoAb -脂質(zhì)體納米材料的靶向能力。

后續(xù)的蛋白質(zhì)鑒定方法與體外試驗(yàn)使用的方法大致相同(見表1)。納米材料表面蛋白冠可以通過可視化方法進(jìn)行觀察，如原子力顯微鏡(AFM)[17]，透射電子顯微鏡(TEM)[18]和掃描電鏡(SEM)[19]等。Chong等[20]利用AFM檢測了氧化石墨烯(GO)和還原氧化石墨烯(rGO)納米材料對血漿蛋白質(zhì)的吸附。牛血清白蛋白在與GO孵育過程中形成復(fù)雜的聚集體。蛋白質(zhì)分布和顆粒形態(tài)可以用AFM觀察。研究發(fā)現(xiàn)，吸附蛋白質(zhì)分布的差異與顆粒結(jié)構(gòu)和孵育時(shí)間有關(guān)。此外，Ge等[21]觀察了血液蛋白在碳納米管(CNTs)的不同結(jié)合形態(tài)。用AFM測量單個(gè)CNT上每種蛋白質(zhì)的分子數(shù)，發(fā)現(xiàn)CNTs與蛋白質(zhì)芳香族殘基的π-π堆積驅(qū)動(dòng)吸附是CNTs吸附能力的關(guān)鍵，CNTs表面的蛋白層厚度約為2.5 nm。

表1 蛋白冠表征非原位分析技術(shù)

蛋白質(zhì)定量分析可用于評價(jià)蛋白質(zhì)吸附在納米材料上的絕對含量。有研究通過結(jié)合BCA蛋白定量分析法和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)對金屬基納米材料進(jìn)行定量，可以測定每個(gè)納米顆粒上的蛋白含量[22]。此外，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是基于蛋白質(zhì)的分子量對不同分析范圍的蛋白質(zhì)吸附量進(jìn)行定量的方法。從生物流體中分離蛋白冠后，其組成可以在體外確定，通過胰蛋白酶消化等步驟進(jìn)一步檢測電泳分離的蛋白。SDS-PAGE與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[23]結(jié)合常用來鑒定和定量分析納米材料表面吸附的蛋白。

此外，等溫滴定量熱法[24]可用于評價(jià)納米材料與蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)度和吸附動(dòng)力學(xué)。圓二色譜[25]、傅里葉變換紅外光譜[26]和核磁共振[27]可用于測定蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。這些傳統(tǒng)的非原位分析技術(shù)被用來表征蛋白質(zhì)冠的結(jié)構(gòu)和理化參數(shù)。

3 蛋白冠的原位分析技術(shù)

與非原位分析技術(shù)不同，原位分析技術(shù)不需要對蛋白冠進(jìn)行分離，可以在復(fù)雜的環(huán)境中直接檢測蛋白冠相關(guān)信息。該技術(shù)可能更適合生物流體中蛋白質(zhì)冠的表征。Pattipeiluhu等[28]研究了使用一種類似磷脂的雙功能無偏光親和標(biāo)記探針I(yè)KS02原位捕獲脂質(zhì)體的蛋白冠。研究發(fā)現(xiàn)，離心分離得到的蛋白組成與光親和法有明顯不同，離心分離法中人血清白蛋白和補(bǔ)體3含量較高，而光親和法中載脂蛋白含量較高。此外，在細(xì)胞存在的情況下，一種基于非光學(xué)的原位分析方法可用來定量檢測納米材料上吸附的蛋白冠[29]。在這種方法中，納米材料用19F標(biāo)記，然后用19F擴(kuò)散順序核磁共振檢測擴(kuò)散系數(shù)。研究表明，納米材料在體內(nèi)水和粒徑的變化可以用來顯示其聚集、降解和蛋白質(zhì)吸附等行為。此外，熒光相關(guān)光譜[30]和高速暗場顯微鏡[31]也可用來原位檢測生物流體中的納米材料-蛋白冠復(fù)合物的水合粒徑。

除水合粒徑外，其他有關(guān)蛋白冠的信息也可以通過原位技術(shù)進(jìn)行分析。在高度復(fù)雜的分散體和生物環(huán)境中，流式細(xì)胞術(shù)與微流控技術(shù)相結(jié)合可用于檢測代表納米材料表面生物識(shí)別的分子信息[32]。該方法以特異性物質(zhì)的高親和力為基礎(chǔ)，結(jié)合量子點(diǎn)(QD)在所有波長范圍的吸收截面高、發(fā)射帶寬窄、亮度高、光穩(wěn)定性高和易于修飾等特殊特性，將QD-抗體復(fù)合物滴定至蛋白冠-納米材料復(fù)合物，直至與靶點(diǎn)全部結(jié)合，然后測定散射和熒光。此外，通過原位熒光共振能量轉(zhuǎn)移可以研究QD的蛋白質(zhì)吸附行為，包括親和力和吸附取向[33]。通過該方法發(fā)現(xiàn)InP@ZnS QDs不同的手性影響了蛋白質(zhì)的親和力和吸附取向。通過微流控平臺(tái)和電阻測量裝置，可以實(shí)時(shí)原位監(jiān)測和研究蛋白冠的形成[34]。該方法能夠?qū)?dòng)態(tài)環(huán)境中的流體流動(dòng)進(jìn)行精確控制，可用于模擬真實(shí)的生物環(huán)境。微流控技術(shù)與共聚焦激光掃描顯微技術(shù)相結(jié)合也可用于研究蛋白冠形成的時(shí)間演化[35]。

目前對蛋白冠的研究大多基于硬蛋白冠，這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的基于從生物介質(zhì)中分離納米顆粒的非原位分析技術(shù)未能完全檢測出軟蛋白冠的成分并闡明其生物學(xué)意義。最近，原位分析技術(shù)被用于研究軟蛋白冠。例如，利用低溫透射電鏡和同步輻射圓二色譜分析弱結(jié)合蛋白，揭示軟蛋白冠原位形成的分子基礎(chǔ)[36]。此外，原位點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)也被用于鑒別二氧化硅和聚苯乙烯納米顆粒的軟蛋白冠和硬蛋白冠[37]。研究表明，軟蛋白冠和硬蛋白冠的區(qū)別在于蛋白質(zhì)結(jié)合強(qiáng)度不同。雖然有一小部分蛋白只存在于軟蛋白冠中，但軟蛋白冠和硬蛋白冠中的大部分蛋白組成相同。軟蛋白冠主要通過其動(dòng)態(tài)特性調(diào)節(jié)納米材料與細(xì)胞的相互作用。

此外，相關(guān)研究還開發(fā)了基于納米材料特殊蛋白的原位檢測技術(shù)，這有助于確定靶向特異性細(xì)胞受體和內(nèi)化途徑等生物學(xué)作用。Gianneli等[38]報(bào)道了一種通過石英晶體微天平測量生物流體中蛋白冠-納米材料復(fù)合物受體識(shí)別的定量方法。采用適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w和QCM“三明治”生化分析形式，對表面暴露的轉(zhuǎn)鐵蛋白識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行定量，轉(zhuǎn)鐵蛋白的數(shù)量與納米材料的大小和表面化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。

4 總結(jié)與展望

目前關(guān)于蛋白冠的表征技術(shù)有很多種，包括較為成熟的非原位分析技術(shù)，可用于表征如蛋白冠-納米材料復(fù)合物的大小、形貌，蛋白冠的定性定量分析等；還包括在生物流體等復(fù)雜環(huán)境中用于檢測蛋白冠性質(zhì)的原位分析技術(shù)。但這些技術(shù)仍存在一些局限性。首先，這些技術(shù)中的大多數(shù)沒有考慮到蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。事實(shí)上，蛋白冠-納米材料復(fù)合物的形成可以影響蛋白質(zhì)分子的高級結(jié)構(gòu)，而蛋白結(jié)構(gòu)的改變會(huì)進(jìn)一步影響納米材料的物理化學(xué)性質(zhì)及其生物效應(yīng)。其次，對蛋白冠形成過程的分析還缺乏一個(gè)合適的相互作用動(dòng)力學(xué)模型。合理的動(dòng)力學(xué)模型有助于研究蛋白冠的形成及生物學(xué)效應(yīng)。但這是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，因?yàn)榇罅康姆肿訁⑴c蛋白冠的形成，并且這一過程是動(dòng)態(tài)過程，并在短時(shí)間內(nèi)完成。最后，目前對蛋白冠性質(zhì)的分析表征主要是在體外進(jìn)行。然而，生物體內(nèi)含有多種生物分子，并且具有一定的特異性。由于其復(fù)雜的環(huán)境，體內(nèi)蛋白冠形成的準(zhǔn)確表征比體外表征更加困難。因此，開發(fā)合適的體內(nèi)蛋白冠表征技術(shù)是未來研究的重點(diǎn)。