王明霞，梅 超，宋倩娜，王慧杰，吳雙艷，馮瑞云

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太原 030031）

馬鈴薯（Solanaceae tuberosum L.）是茄科茄屬，1 年生雙子葉植物，在山西乃至全國范圍內(nèi)大面積栽種，是一種良好的經(jīng)濟(jì)作物[1]。馬鈴薯是山西省部分地區(qū)主要脫貧產(chǎn)業(yè)，是保障山西省糧食安全及精準(zhǔn)扶貧的重要產(chǎn)業(yè)。因此，選育優(yōu)良馬鈴薯品種對我國農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要作用[2]。溫度是影響作物生長發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)的重要環(huán)境因素，低溫脅迫是嚴(yán)重影響作物生長的非生物脅迫之一，因此，如何提高作物耐低溫脅迫能力是目前研究熱點(diǎn)之一[3]。馬鈴薯喜冷涼環(huán)境，不耐霜凍，0 ℃以下的低溫凍害和0 ℃以上的低溫冷害都會使馬鈴薯植物生長受到一定抑制。長期低溫會對苗期馬鈴薯植株發(fā)育造成損害，嚴(yán)重時會造成馬鈴薯結(jié)薯量下降甚至絕收[4]。馬鈴薯葉片在-4 ℃低溫下至少還可以存活5 d，具有一定的抗寒性[5]。馬鈴薯種間差異大，抗低溫脅迫能力具有一定差異。因此，選育抗寒能力較強(qiáng)的優(yōu)良馬鈴薯品種對減少凍害風(fēng)險(xiǎn)及促進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)提質(zhì)、增收十分必要。

細(xì)胞作為植物體最基本的單位，低溫脅迫發(fā)生時，首先發(fā)生冷害的部位是細(xì)胞膜系統(tǒng)，植物細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜先后遭到破壞，進(jìn)而造成植株損害和死亡[6]。低溫脅迫會引起植物膜系統(tǒng)、細(xì)胞滲透壓、正常生理代謝和保護(hù)酶系統(tǒng)等發(fā)生一系列改變。研究表明，一些植物長期在低溫逆境中形成抗寒能力，如通過改變植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶活性等方式抵御低溫脅迫[7]。脯氨酸是一種親水性溶劑，低溫條件下植物體內(nèi)脯氨酸積累量越多，植物耐寒性越強(qiáng)，可緩解細(xì)胞因低溫脅迫植物脫水造成的滲透脅迫[4，8]。李飛等[9]研究表明，馬鈴薯抗寒性與脯氨酸含量具有一定相關(guān)性，低溫馴化馬鈴薯品系耐寒性強(qiáng)的品種脯氨酸含量高于耐寒性較弱的馬鈴薯品系。許娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種馬鈴薯受到低溫脅迫后，SOD、POD、CAT 等生理指標(biāo)呈上升趨勢，但當(dāng)?shù)蜏孛{迫時間延長以后，各個生理指標(biāo)升降趨勢不一致。楊惠菊等[11]通過馬鈴薯苗期耐寒指標(biāo)相關(guān)性分析得出，可溶性糖與過氧化物酶活性呈顯著相關(guān)性。

為了進(jìn)一步綜合分析不同品種馬鈴薯耐寒性強(qiáng)弱，本研究以并薯6 號、克新1 號、費(fèi)烏瑞它、晉薯16 號、冀張薯12 號和大西洋等脫毒組培苗為對象進(jìn)行低溫脅迫處理，通過測定不同品種馬鈴薯組培苗中過氧化氫酶、過氧化物酶活性及可溶性糖、脯氨酸含量等生理生化指標(biāo)，并采用隸屬函數(shù)法對其抗寒性進(jìn)行綜合評價(jià)[12-15]，以期為抗寒性馬鈴薯品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料并薯6 號脫毒組培苗（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院與太原市惠禾經(jīng)貿(mào)有限公司選育）、克新1 號脫毒組培苗（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所選育）、費(fèi)烏瑞它脫毒組培苗（國外引進(jìn)示范品種，低溫敏感）、晉薯16 號脫毒組培苗（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院高寒區(qū)作物研究實(shí)驗(yàn)室選育）、冀張薯12 號脫毒組培苗（河北省高寒研究所選育）、大西洋脫毒組培苗（國外引進(jìn)示范品種）等6 個馬鈴薯品種，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯基因編輯實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

參照黃先群等[16]的研究方法對材料進(jìn)行處理，并略作改動。將供試材料組培苗在MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)28 d 后，選取生長狀態(tài)良好，長勢一致的脫毒組培苗用于試驗(yàn)。對6 個不同品種馬鈴薯進(jìn)行低溫脅迫處理，試驗(yàn)在低溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，采用4 ℃和-4 ℃共2 個溫度處理48 h，光照強(qiáng)度為2 500 lx左右，光照時間為12 h/d，每個處理重復(fù)3 次。-4 ℃處理組的馬鈴薯試驗(yàn)材料，低溫處理之前進(jìn)行為期5 d 的低溫馴化，馴化溫度為4 ℃。將常溫25 ℃作為對照處理，光照強(qiáng)度為2 500 lx 左右，光照時間12 h/d，設(shè)置3 次重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

低溫脅迫處理后，取整株馬鈴薯組培苗用液氮研磨混勻后放入1.5 mL 離心管中，存放于-80 ℃超低溫冰箱中儲藏備用。POD、CAT 活性以及Pro、可溶性糖含量均采用生工Sangon Biotech 試劑盒測定。

1.4 采用隸屬函數(shù)法綜合分析馬鈴薯耐寒性

與抗寒性呈正相關(guān)的指標(biāo)參數(shù)如下。

與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的指標(biāo)參數(shù)如下。

式中，U（Xij）表示各指標(biāo)的隸屬度值，該數(shù)值的范圍在0～1，Xij中字母i 指的是不同品種的馬鈴薯，j 代表不同測定指標(biāo)。將每個品種馬鈴薯的所有指標(biāo)累加，求其平均數(shù)，平均數(shù)越大耐寒性越強(qiáng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理，采用GraphPad Prism 制作柱狀圖，采用SPSS 19.0 進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對馬鈴薯生理指標(biāo)的影響

2.1.1 對游離脯氨酸（Pro）含量的影響 表1 和圖1 結(jié)果表明，低溫脅迫后，各品種馬鈴薯的脯氨酸含量整體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與對照組相比，均呈現(xiàn)增加。4 ℃時各品種馬鈴薯的脯氨酸含量存在顯著性差異，表現(xiàn)為并薯6 號的脯氨酸含量最大，其次依次是冀張薯12 號和晉薯16 號；-4 ℃時各品種馬鈴薯脯氨酸含量表現(xiàn)為冀張薯12 號＞晉薯16 號＞克新1 號＞并薯6 號＞大西洋＞費(fèi)烏瑞它，與4 ℃相比，并薯6 號和費(fèi)烏瑞它的降幅較大，且二者之間存在顯著性差異（P＜0.05），并薯6 號的脯氨酸含量較大，冀張薯12 號和晉薯16 號的脯氨酸含量之間差異不顯著，但是顯著高于其他4 個品種（P＜0.05）。并薯6 號在4 ℃時脯氨酸含量最高，其次依次是冀張薯12 號和晉薯16 號，具有較高的抗脅迫能力，冀張薯12 號和晉薯16 號在-4 ℃時脯氨酸依然保持較高水平，且二者之間不存在顯著性差異，但是顯著高于其他馬鈴薯品種（P＜0.05），表明其耐低溫能力更強(qiáng)?？诵? 號在低溫脅迫后脯氨酸含量也保持較高水平，從而抵抗低溫脅迫，大西洋在低溫脅迫后脯氨酸含量增加趨勢相對較穩(wěn)定但脯氨酸含量處于較低水平，不利于其抵抗低溫脅迫，費(fèi)烏瑞它-4 ℃時的脯氨酸含量較4 ℃時脯氨酸含量降幅較大且脯氨酸含量處于較低水平，抗低溫脅迫能力較差。

2.1.2 對可溶性糖含量的影響 可溶性糖是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。由表1 和圖2 可知，處理前并薯6 號的可溶性糖含量最高，其次依次是冀張薯12 號和大西洋，費(fèi)烏瑞它和克新1 號的可溶性糖含量相對較少。4 ℃處理后，不同品種馬鈴薯可溶性糖含量整體呈現(xiàn)增加的趨勢，說明了低溫脅迫下，6 種不同品種馬鈴薯在4 ℃條件下通過可溶性糖的合成與積累來抵抗低溫；此時，并薯6 號的可溶性糖含量最高，但是相較于對照組有少量的下降，其原因可能是由于此溫度未能達(dá)到對該品種馬鈴薯脅迫的水平，還未啟動應(yīng)對低溫脅迫的生理機(jī)制；其余品種中的可溶性糖含量較對照組均有不同程度的增加，其中，大西洋和費(fèi)烏瑞它的可溶性糖含量增幅較大，但費(fèi)烏瑞它的可溶性糖含量仍較低。-4 ℃時，6 個不同品種馬鈴薯的可溶性糖含量繼續(xù)增加，說明在-4 ℃時各個品種的馬鈴薯仍能通過合成更高濃度的可溶性糖來抵抗低溫；此時，6 個不同品種馬鈴薯的可溶性糖含量大小表現(xiàn)為并薯6 號＞冀張薯12 號＞晉薯16 號＞克新1 號＞大西洋＞費(fèi)烏瑞它，并薯6 號和克新1 號較4 ℃時的可溶性糖含量增幅較大，其次是冀張薯12 號和晉薯16 號，大西洋和費(fèi)烏瑞它的增幅不明顯。并薯6 號在未處理時與低溫處理后可溶性糖含量均處于最高水平，具有一定的抗脅迫能力，冀張薯12 號與晉薯16 號在4、-4 ℃時可溶性糖含量表現(xiàn)出持續(xù)升高且維持在較高水平，具有較高的抗低溫脅迫能力，其次是大西洋和克新1 號，-4 ℃時費(fèi)烏瑞它的可溶性糖含量最低，表明其抵抗低溫脅迫的能力較低。

2.1.3 對CAT 活性的影響 CAT 具有清除植物體內(nèi)過氧化氫的能力，是植物耐寒性鑒定的一個重要指標(biāo)。從圖3 和表2 可以看出，處理前冀張薯12 號的CAT 活性最高，其次是大西洋，費(fèi)烏瑞它的CAT活性最低。4 ℃處理后，6 種馬鈴薯的CAT 活性均呈現(xiàn)增加趨勢，此時晉薯16 號的CAT 活性最高，并薯6 號與晉薯16 號不存在顯著性差異，費(fèi)烏瑞它的CAT 活性仍為最低。-4 ℃處理后，除并薯6 號CAT 活性較4 ℃有小幅度降低外，其余品種馬鈴薯組織CAT活性均呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢，冀張薯12 號CAT 活性最高，其次是晉薯16 號，顯著高于其余4 個品種（P＜0.05），大西洋與克新1 號CAT 活性存在顯著性差異，且大西洋CAT 活性顯著高于克新1 號（P＜0.05）。低溫脅迫可增強(qiáng)6 個不同品種馬鈴薯組織CAT酶活性，冀張薯12 號與晉薯16 號在4、-4 ℃均具有較高的CAT 酶活性，不同品種馬鈴薯的CAT 酶活性對低溫脅迫響應(yīng)的方式存在差異。

表2 不同溫度下6 種馬鈴薯組織中保護(hù)酶活性變化

2.1.4 對過氧化物酶（POD）活性的影響 從圖4可以看出，POD 可以清除植物體內(nèi)過氧化物，可作為植物抗氧化能力的一個重要指標(biāo)。未處理之前，晉薯16 號的POD 活性最高，冀張薯12 號與晉薯16 號之間不存在顯著性差異，其次是大西洋，并薯6 號和克新1 號的POD 酶活性較低，費(fèi)烏瑞它的POD 酶活性最低。4 ℃處理后，克新1 號與并薯6 號的酶活性明顯增加，晉薯16 號和費(fèi)烏瑞它的POD酶活性出現(xiàn)小幅增加，冀張薯12 號和大西洋POD酶活性出現(xiàn)小幅降低。-4 ℃處理后，冀張薯12 號、大西洋、晉薯16 號的POD 活性較對照處理明顯增強(qiáng)并達(dá)到峰值，表明低溫誘導(dǎo)可顯著增強(qiáng)POD 活性，增強(qiáng)上述3 個品種馬鈴薯耐低溫脅迫能力，并薯6 號和費(fèi)烏瑞它的POD 酶活性與對照組相比出現(xiàn)了下降，難以更有效地清除組織內(nèi)過氧化物來適應(yīng)低溫環(huán)境。低溫可使供試的6 個不同品種的馬鈴薯POD 酶活性出現(xiàn)增強(qiáng)，但是，不同品種馬鈴薯的POD 活性對低溫脅迫響應(yīng)的方式不同。

2.2 馬鈴薯抗寒品種綜合評價(jià)

植物抗寒性是一個比較復(fù)雜的過程，用某個單一指標(biāo)評價(jià)植物的耐寒性十分局限，采用多個指標(biāo)綜合評價(jià)更能相對準(zhǔn)確全面地反映植物的耐寒性[17]。參照王麗等[18]的研究方法，采用隸屬函數(shù)法對低溫脅迫下各品種馬鈴薯各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，評價(jià)6 種馬鈴薯的抗寒性，可相對準(zhǔn)確地反映植物抗寒的整體表現(xiàn)。

本研究采用隸屬函數(shù)的方法，對Pro 含量、可溶性糖含量、CAT 活性、POD 活性4 個冷脅迫響應(yīng)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了綜合分析，結(jié)果顯示（表3），6 個不同品種馬鈴薯耐寒性依次為冀張薯12 號＞并薯6號＞晉薯16 號＞克新1 號＞大西洋＞費(fèi)烏瑞它。

表3 不同品種馬鈴薯耐寒性綜合評價(jià)

3 結(jié)論與討論

植物細(xì)胞中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物抵御冷脅迫中起著十分重要的作用，本研究選取了游離脯氨酸和可溶性糖2 個滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)作為6 個不同品種馬鈴薯脫毒組培苗抗寒性的指標(biāo)。低溫脅迫時，植物可通過合成并積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)降低水勢，減少水分的散失從而提高耐寒能力。本研究結(jié)果顯示，低溫處理?xiàng)l件下，6 種馬鈴薯的脯氨酸和可溶性糖含量均有所增加，體現(xiàn)了對低溫脅迫的抗性[10]。不同品種馬鈴薯對低溫脅迫的響應(yīng)有所不同，即脯氨酸和可溶性糖積累量的峰值出現(xiàn)時間不一致。低溫脅迫后，馬鈴薯幼苗組織游離脯氨酸的升降趨勢與白淼等[19]研究結(jié)果一致。馬英等[20]研究認(rèn)為，低溫脅迫發(fā)生時，細(xì)胞滲透物積累量多的植物耐寒性相對較強(qiáng)，反之耐低溫能力較弱。本研究中，并薯6 號、冀張薯12 號、晉薯16 號在低溫脅迫條件下脯氨酸和可溶性糖含量均處于較高水平，表明這3 個馬鈴薯品種耐寒性相對較強(qiáng)。

CAT 和POD 這2 種抗氧化酶在植物體內(nèi)十分關(guān)鍵，可以對其體內(nèi)活性氧自由基進(jìn)行有效的去除，以此來提高植物抵抗非生物脅迫即低溫脅迫[19]。本研究表明，低溫脅迫條件下，馬鈴薯的酶促防御系統(tǒng)啟動并活化，CAT 活性和POD 活性較對照組均出現(xiàn)不同程度的增加，4 ℃低溫脅迫時，耐寒品種冀張薯12 號、并薯6 號、和晉薯16 號的CAT 活性顯著高于不耐寒品種，這與秦文斌等[21]研究結(jié)果一致。-4 ℃低溫處理后，冀張薯12 號的2 種酶活性仍然保持最高水平，晉薯16 號的2 種酶活性也比較高，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐寒性。本研究結(jié)果顯示，低溫脅迫后，6 個馬鈴薯品種POD 活性整體上呈現(xiàn)先上升再下降或持續(xù)上升趨勢，未呈現(xiàn)一定的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，這與丁紅映等[22]研究結(jié)果一致。

植物耐低溫脅迫能力是多基因調(diào)控的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，僅靠酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等某個單一指標(biāo)不能全面地評價(jià)6 種馬鈴薯抗寒性[20]。隸屬函數(shù)分析法是一種常用的植物抗逆性綜合評價(jià)方法，此法運(yùn)用模糊數(shù)學(xué)原理對植物抗逆性進(jìn)行綜合評價(jià)，目前已成功應(yīng)用于馬鈴薯、高原喬木、葡萄等多種植物的抗逆性綜合評價(jià)[18-19]。本研究采用隸屬函數(shù)法對6 個不同品種馬鈴薯脫毒組培苗的4 種抗寒相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行耐寒性綜合分析，得到耐寒性量化結(jié)果，6 個參試馬鈴薯耐寒性強(qiáng)弱排序依次為冀張薯12 號＞并薯6 號＞晉薯16 號＞克新1 號＞大西洋＞費(fèi)烏瑞它。