盛雨婷，生林山，陸峻一，趙愛(ài)菊，李夕梅

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東省旱作技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省耐鹽作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用工程技術(shù)研究中心，山東青島 266109；2.東營(yíng)青農(nóng)大鹽堿地高效農(nóng)業(yè)技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究院，山東東營(yíng) 257000；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北石家莊 050035）

小麥（Triticum aestivum L.）是我國(guó)第二大口糧作物，在保障國(guó)家糧食安全方面發(fā)揮著重要作用[1]。隨著水資源日益短缺和土壤鹽漬化日趨嚴(yán)重，小麥生產(chǎn)面臨嚴(yán)重威脅[2]。干旱會(huì)導(dǎo)致小麥光合能力下降、代謝不均衡，最終抑制小麥生長(zhǎng)[3]。鹽脅迫會(huì)引起小麥細(xì)胞離子毒害、光合性能下降、生長(zhǎng)發(fā)育停滯，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量[4]。因此，抗旱耐鹽小麥新品種的培育對(duì)保障小麥生產(chǎn)具有重要意義。

眾所周知，抗旱耐鹽指標(biāo)的鑒選對(duì)抗旱耐鹽品種的選育具有重要指導(dǎo)意義。胚芽鞘長(zhǎng)度、莖稈內(nèi)可溶性碳水化合物、葉片相對(duì)含水量、拔節(jié)期葉面積指數(shù)、根系干質(zhì)量等形態(tài)指標(biāo)均與小麥抗旱性關(guān)系密切[5-9]；超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等酶活性、丙二醛（MDA）含量、葉綠素含量及熒光參數(shù)、蛋白質(zhì)和核酸含量、滲透調(diào)節(jié)能力等生理生化指標(biāo)也與小麥抗旱性有著較為密切的關(guān)系[10-14]。發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗存活率、胚芽鞘長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗高、第一片葉的生長(zhǎng)速度、苗鮮質(zhì)量、春季分蘗數(shù)等形態(tài)指標(biāo)可以作為小麥耐鹽性鑒定的有效指標(biāo)[15-17]；K+/Na+比、K+通量、液泡膜和液泡Na+/H+變化、質(zhì)膜和液泡膜H+-ATPase 活性、細(xì)胞膜透性、葉綠素含量、氣孔導(dǎo)度、SOD 酶活性、多胺含量、游離脯氨酸含量、羥脯氨酸含量、糖蛋白中糖分含量、甜菜堿含量等生理生化指標(biāo)也可以作為鑒定小麥耐鹽性的重要指標(biāo)[18-24]。由于小麥抗旱性和耐鹽性均是多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，在衡量小麥抗旱耐鹽性時(shí)需要將多種指標(biāo)結(jié)合起來(lái)進(jìn)行綜合評(píng)定，比如隸屬函數(shù)法[25]。

小麥旱鹽脅迫下形態(tài)及生理生化性狀的變化都受基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，目前，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物抗逆相關(guān)研究中。LIU 等[26]利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，14 560 個(gè)基因在小麥干旱脅迫前后發(fā)生差異表達(dá)；ZHANG 等[27]以小麥幼苗根系為研究材料，在全基因組水平上鑒定到36 804 個(gè)鹽脅迫前后差異表達(dá)的基因。

有研究指出，干旱時(shí)土壤水分蒸發(fā)會(huì)導(dǎo)致地表鹽分不斷積累，使得地表土壤水分減少、鹽分濃度增加，因此，干旱和鹽害往往同時(shí)發(fā)生[28]。翁亞偉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，旱鹽復(fù)合脅迫下，小麥幼苗的生物量、葉面積、葉綠素?zé)晒夂蛢艄夂纤俾实染@著下降；華智銳等[30]研究發(fā)現(xiàn)，小麥胚芽鞘長(zhǎng)度、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均隨旱鹽交叉脅迫的加劇而呈下降趨勢(shì)，而SOD、POD 和CAT 活性先上升后下降。目前，旱鹽復(fù)合脅迫對(duì)小麥影響的研究已有報(bào)道，但小麥抗旱性與耐鹽性相關(guān)性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以173 個(gè)小麥品種（系）為材料，采用20%PEG溶液（模擬干旱）和150 mmol/L NaCl 溶液（模擬鹽害）分別處理種子，并于芽苗期測(cè)定其相對(duì)胚芽鞘長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗高、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)鮮質(zhì)量，利用綜合隸屬函數(shù)法計(jì)算各品種（系）的抗旱耐鹽能力，然后結(jié)合高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析抗旱性與耐鹽性的相關(guān)性，以期豐富小麥抗旱耐鹽性相關(guān)研究，為小麥抗旱、耐鹽性品種選育提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

青麥6 號(hào)、德抗961、濟(jì)南17、濟(jì)麥229、魯麥21、煙農(nóng)24 等173 份小麥品種（系）[31]用于小麥抗旱耐鹽形態(tài)鑒定指標(biāo)數(shù)據(jù)的測(cè)定，抗旱耐鹽小麥品種青麥6 號(hào)（國(guó)審麥2016027）用于旱、鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2 基于形態(tài)指標(biāo)的小麥抗旱耐鹽相關(guān)性分析

小麥材料的萌發(fā)與處理、抗旱耐鹽形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定均采用文獻(xiàn)[31]的試驗(yàn)方法；然后采用文獻(xiàn)[32]的方法計(jì)算小麥?zhǔn)苊{迫下的相對(duì)抗旱或耐鹽系數(shù)；隨后利用Microsoft Excel 2007 對(duì)所得相對(duì)抗旱（耐鹽）系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；再采用隸屬函數(shù)值進(jìn)行品種（系）各發(fā)芽指標(biāo)的抗旱和耐鹽性綜合評(píng)定，參考文獻(xiàn)[31]進(jìn)行；最后利用SPSS 22.0 軟件計(jì)算抗旱性與耐鹽性之間的相關(guān)系數(shù)，參考文獻(xiàn)[31]。

1.3 小麥旱、鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

青麥6 號(hào)小麥幼苗的培養(yǎng)參考ZHANG 等[27]的方法進(jìn)行，隨后分別采用20%PEG 溶液和0.3%NaCl 溶液對(duì)其進(jìn)行模擬干旱和鹽脅迫處理，脅迫發(fā)生48 h 后葉片取樣并迅速置于液氮中，取出后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ哉ＩL(zhǎng)條件的幼苗葉片作對(duì)照，每處理3 次生物學(xué)重復(fù)。RNA 的提取、建庫(kù)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因組比對(duì)、表達(dá)水平分析、GO功能富集分析等均參考ZHANG 等[27]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種（系）小麥抗旱形態(tài)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析及抗旱性綜合評(píng)價(jià)

從圖1 可以看出，旱脅迫下不同小麥品種（系）相對(duì)胚芽鞘長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗高的隸屬函數(shù)值主要集中在0～0.49，分別占總數(shù)的73.99%、75.72%、99.42%；相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)鮮質(zhì)量的隸屬函數(shù)值主要集中在0.30～1.00，分別占總數(shù)的91.91%、93.64%。116 個(gè)小麥品種（系）（占總數(shù)的67.05%）的抗旱性綜合隸屬函數(shù)值在0.30～0.49；分別有27（15.61%）、23 個(gè)（13.29%）小麥品種（系）的抗旱性綜合隸屬函數(shù)值在0.20～0.29 和0.50～0.59，二者相差不多；分別只有2（1.16%）、5 個(gè)（2.89%）小麥品種（系）的抗旱性綜合隸屬函數(shù)值在0～0.19 和0.60～0.79。

2.2 不同品種（系）小麥耐鹽形態(tài)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析及耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

由圖2 可知，鹽脅迫下不同小麥品種（系）相對(duì)胚芽鞘長(zhǎng)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)鮮質(zhì)量的隸屬函數(shù)值主要集中在0.30～1.00，分別占總數(shù)的81.50%、89.02%、92.49%；相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗高的隸屬函數(shù)值主要集中在0～0.49，分別占總數(shù)的80.92%、89.60%。98 個(gè)（占總數(shù)的56.65%）小麥品種（系）的耐鹽性綜合隸屬函數(shù)值在0.30～0.49；57 個(gè)（32.95%）小麥品種（系）的耐鹽性綜合隸屬函數(shù)值在0.50～0.59；分別只有8（4.62%）、10 個(gè)（5.78%）小麥品種（系）的耐鹽性綜合隸屬函數(shù)值在0.20～0.29 和0.60～0.79。

2.3 小麥抗旱性、耐鹽性各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由表1 可知，干旱脅迫下相對(duì)胚芽鞘長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗高、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)鮮質(zhì)量隸屬函數(shù)值兩兩間相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值在0.04～0.36；各指標(biāo)隸屬函數(shù)值與抗旱綜合隸屬函數(shù)值間的相關(guān)系數(shù)在0.49～0.70，且均達(dá)極顯著水平。鹽脅迫下相對(duì)胚芽鞘長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗高、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)鮮質(zhì)量隸屬函數(shù)值兩兩間相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值在0.06～0.21；各指標(biāo)隸屬函數(shù)值與耐鹽綜合隸屬函數(shù)值間的相關(guān)系數(shù)在0.46～0.56，且均達(dá)極顯著水平。相對(duì)鮮質(zhì)量、相對(duì)胚芽鞘長(zhǎng)、相對(duì)苗高在旱鹽2 種脅迫下隸屬函數(shù)值相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.50、0.52、0.63，且均為極顯著水平；抗旱、耐鹽綜合隸屬函數(shù)值間的相關(guān)系數(shù)為0.43，且達(dá)極顯著水平。

表1 小麥抗旱性、耐鹽性各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

2.4 小麥干旱、鹽脅迫響應(yīng)差異表達(dá)基因及功能注釋的比較分析

從圖3 可以看出，與非脅迫處理相比，脅迫處理下共鑒定到3 311 個(gè)上調(diào)和4 712 個(gè)下調(diào)表達(dá)基因（變化倍數(shù)≥2，F(xiàn)DR 值＜0.01）。其中，干旱脅迫特異上調(diào)基因數(shù)為1 717 個(gè)，鹽脅迫特異上調(diào)基因數(shù)為650 個(gè)，旱鹽共上調(diào)基因數(shù)為944 個(gè)；干旱脅迫特異下調(diào)基因數(shù)為2 901 個(gè)，鹽脅迫特異下調(diào)基因數(shù)為209 個(gè)，旱鹽共下調(diào)基因數(shù)為1 602 個(gè)。隨后，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能富集分析，顯著富集的前20 個(gè)亞類(lèi)結(jié)果顯示，旱鹽上調(diào)基因富集亞類(lèi)相同的有18 個(gè)（圖4-A、B），旱鹽下調(diào)基因富集亞類(lèi)相同的有19 個(gè)（圖4-C、D），均包括分子功能（molecular_function）、生物學(xué)過(guò)程（biological_process）、代謝過(guò)程（metabolic process）、催化活性（catalytic activity）等功能亞類(lèi)。

3 結(jié)論與討論

3.1 采用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)小麥的抗旱性和耐鹽性

隸屬函數(shù)法屬于模糊評(píng)價(jià)函數(shù)的概念[25]，可基于多個(gè)指標(biāo)對(duì)小麥抗旱、耐鹽性進(jìn)行全面而客觀的評(píng)價(jià)[31，33-34]。本研究將每個(gè)小麥品種（系）各指標(biāo)抗旱或耐鹽指標(biāo)的隸屬函數(shù)值相加并取平均值，避免了使用單一指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)的不準(zhǔn)確性，評(píng)價(jià)結(jié)果更加科學(xué)、可靠。

3.2 基于形態(tài)指標(biāo)的抗性鑒定結(jié)果小麥抗旱性和耐鹽性的相關(guān)性

張會(huì)麗[35]應(yīng)用主成分分析和隸屬函數(shù)法對(duì)36 個(gè)玉米品種（系）的生理和農(nóng)藝性狀指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，部分耐鹽堿性強(qiáng)的品種（系）其抗旱性也較強(qiáng)，但部分抗旱性強(qiáng)的品種（系）則對(duì)鹽堿脅迫較為敏感，總體而言，抗旱性和耐鹽堿性存在一定的相關(guān)性。本研究基于173 個(gè)小麥品種（系）形態(tài)指標(biāo)的抗旱、耐鹽性數(shù)據(jù)，采用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)小麥的抗旱耐鹽性后進(jìn)行相關(guān)性分析。鑒于統(tǒng)計(jì)學(xué)上認(rèn)為，相關(guān)系數(shù)r 的取值范圍是-1≤r≤1。當(dāng)0＜r≤1時(shí)，成正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)r=0 時(shí)，不相關(guān)；當(dāng)-1≤r＜0時(shí)，成負(fù)相關(guān)關(guān)系。r 的絕對(duì)值越大，相關(guān)程度越高。一般認(rèn)為，0.8≤|r|＜1，存在極強(qiáng)相關(guān)性；0.6≤|r|＜0.8，強(qiáng)相關(guān)；0.4≤|r|＜0.6，中度相關(guān)；0.2≤|r|＜0.4，弱相關(guān)；0＜|r|≤0.2，極弱相關(guān)性，或認(rèn)為不相關(guān)。本研究結(jié)果認(rèn)為，旱/鹽脅迫下各形態(tài)指標(biāo)間均為弱/極弱相關(guān)性，但是其與綜合抗旱/耐鹽性間的相關(guān)性達(dá)到中度及以上（相關(guān)系數(shù)為0.46～0.70）；相對(duì)胚芽鞘長(zhǎng)、相對(duì)鮮質(zhì)量?jī)芍笜?biāo)在旱鹽2 種脅迫間為中度正相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)分別為0.52 和0.50），相對(duì)苗高在旱鹽2 種脅迫間為強(qiáng)正相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)達(dá)0.63）。鑒于綜合隸屬函數(shù)最能客觀評(píng)價(jià)品種（系）的抗旱耐鹽性，本研究發(fā)現(xiàn)，抗旱、耐鹽綜合隸屬函數(shù)值間的相關(guān)系數(shù)為0.43，因此，本研究認(rèn)為小麥的抗旱耐鹽性間為中度正相關(guān)關(guān)系。因此，可以對(duì)篩選出的抗旱性（耐鹽性）突出的小麥品種（系）進(jìn)行耐鹽性（抗旱性）鑒定，有望篩選到同時(shí)適用于旱地、鹽堿地的既抗旱又耐鹽的小麥品種（系）。

3.3 基于轉(zhuǎn)錄測(cè)序結(jié)果小麥抗旱性和耐鹽性的相關(guān)性

干旱、鹽脅迫48 h 小麥葉片高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，干旱、鹽脅迫共上調(diào)基因數(shù)（944 個(gè)）分別占旱（2 661 個(gè)）、鹽（1 594 個(gè)）脅迫上調(diào)基因總數(shù)的35.48%和59.22%，干旱、鹽脅迫共下調(diào)基因數(shù)（1 602 個(gè)）分別占干旱（4 503 個(gè)）、鹽（1 811 個(gè)）脅迫下調(diào)基因總數(shù)的35.58%和88.46%。說(shuō)明小麥中很多基因是旱、鹽脅迫雙重響應(yīng)的，在小麥抗旱、耐鹽性中均發(fā)揮作用。如Tamyb59 在PEG 和鹽處理下均呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)，該基因的過(guò)表達(dá)能夠同時(shí)提高轉(zhuǎn)基因小麥的抗旱性和耐鹽性[36]；TaHsfA6f 受高溫、脫水、鹽分、低溫和多種激素的誘導(dǎo)表達(dá)，且擬南芥超表達(dá)株系較野生型株系表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱性與耐鹽性[37]。上述這些說(shuō)明小麥抗旱、耐鹽性的內(nèi)在遺傳機(jī)制有一定共性。差異表達(dá)基因的GO 功能富集結(jié)果顯示，干旱、鹽脅迫上調(diào)基因顯著富集前20 個(gè)亞類(lèi)相同的有18 個(gè)，干旱、鹽脅迫下調(diào)基因顯著富集前20 個(gè)亞類(lèi)相同的有19 個(gè)。進(jìn)一步說(shuō)明小麥在應(yīng)對(duì)干旱、鹽脅迫逆境中，很大程度上采用了相似的調(diào)控機(jī)制。藏金萍[38]利用IR64/Binam 和特青/Binam 2 個(gè)導(dǎo)入系群體對(duì)水稻抗旱性、耐鹽性進(jìn)行分析，分別鑒定到5、3 個(gè)抗旱性QTL 與耐鹽性QTL 相互重疊的基因組區(qū)域。鑒于不同作物間生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)脅迫的相似性，結(jié)合本研究結(jié)果，初步認(rèn)為小麥抗旱性、耐鹽性之間確實(shí)存在一定相關(guān)性，對(duì)抗旱、耐鹽共響應(yīng)基因進(jìn)行有效的遺傳操縱，或者對(duì)抗旱性、耐鹽性QTL 重疊區(qū)進(jìn)行有效的選擇，有可能培育出既抗旱又耐鹽的小麥新品種。

3.4 展望

鑒于芽苗期是小麥旱、鹽脅迫最為敏感的時(shí)期，以及工作量等現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，本研究主要基于173 個(gè)小麥品種（系）芽苗期形態(tài)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行了小麥抗旱性、耐鹽性間的相關(guān)性分析，為了使研究結(jié)果更加科學(xué)合理可信，應(yīng)該結(jié)合生理生化指標(biāo)、成株期鑒定指標(biāo)及產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，但是本研究結(jié)果對(duì)小麥抗旱耐鹽性研究仍有一定的指導(dǎo)意義。