林炎鴻，張夢雅，曾 健△

1.廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院(聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室/福建省移植生物學(xué)重點實驗室,福建福州350025；2.福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院(聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室,福建福州 350025

兒童進(jìn)行性脊髓性肌肉萎縮癥(SMA)是一種以脊髓前角運動神經(jīng)元退行性病變?yōu)橹饕卣鞯某Ｈ旧w隱性遺傳病，該病的疾病基因為運動神經(jīng)元生存基因1(SMN1)，位于5號染色體長臂1區(qū)3帶，含9個外顯子(1、2a、2b、3～8)。修飾基因SMN2與SMN1高度同源：在編碼區(qū)只有1個堿基的差別[1]。有研究表明，約95%的SMA患者SMN1基因存在純合性缺失[1]。全長SMN蛋白由294個氨基酸殘基組成，其相對分子質(zhì)量為38×103，主要由SMN1基因編碼。SMA患者的臨床嚴(yán)重程度與SMN蛋白水平存在密切相關(guān)性。有研究表明，SMN蛋白在真核生物中廣泛表達(dá)，并參與了多種細(xì)胞的生物學(xué)過程[1]。最早并被深入研究的是SMN蛋白在小核核糖核蛋白(snRNP)組裝過程中的功能。snRNP的正確組裝是RNA剪接復(fù)合體形成的必要前提。然而，關(guān)于SMN蛋白依賴的snRNP的組裝及剪接缺陷是否與SMA的表型相關(guān)仍不清楚。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠和斑馬魚的SMA模型中，部分基因發(fā)生了剪接異常[2-3]。SMN蛋白缺陷是否會引起廣泛性的剪接異?；蛟斐赡承╆P(guān)鍵基因或重要信號通路的可變剪接異常，從而導(dǎo)致SMA發(fā)生？本文通過分析SMN1基因純合性缺失型患者與SMN1基因拷貝數(shù)正常對照組外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)譜，初步研究SMN蛋白對相關(guān)基因可變剪接的影響，并分析差異可變剪接參與的生物學(xué)過程及代謝通路，為全面了解SMN蛋白的生理功能和SMA的發(fā)病機制提供線索。

1 資料與方法

1.1一般資料 SMA患者組5 例(BR1、 BR2、BR3、BR4、 BR5)，其中男4例，女1例，年齡1 ～ 23歲。SMA患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合SMA臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)SMN1基因檢測結(jié)果顯示純合性缺失。正常對照組5例(ZC1、ZC2、ZC3、ZC4、ZC5)，納入標(biāo)準(zhǔn)為SMN1基因拷貝數(shù)為2。采用Trizol(美國 Invitrogen 公司)法提取總 RNA，-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA測序。樣品交由基于Illumina測序平臺的北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行建庫和測序。本研究通過聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，取材前受試者或其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2差異可變剪接的識別 對測序獲得的原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，即去除少量帶有測序接頭、去除含N(N表示無法確定堿基信息)及測序質(zhì)量較低的reads，再檢查測序錯誤率及GC含量分布情況，以獲得后續(xù)分析所需要的clean reads。使用HISAT2軟件將clean reads與參考基因組進(jìn)行快速精確的比對，獲取clean reads在參考基因組上的定位信息[4]，通過分析比對結(jié)果，尋找外顯子間的結(jié)合位點。對RNA-seq的基因表達(dá)值先后對測序深度和基因長度進(jìn)行校正，并用FPKM表示。使用rMATS軟件對可變剪接事件進(jìn)行相關(guān)定量及差異分析，對有生物學(xué)重復(fù)的樣品行差異可變剪接分析[5]。每個可變剪接事件分別對應(yīng)2個剪接異構(gòu)體，分別對其進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計，并通過校正得到表達(dá)量，然后再計算外顯子保留剪接體在2個剪接體總表達(dá)量中的比值，比值即為結(jié)果文件中的患者組和正常對照組，最后行差異顯著性分析(FDR<0.05)，從而篩選新引入和缺失的可變剪接。

1.3可變剪接顯著差異基因的基因功能(GO)和代謝通路(KEGG)分析 主要分析外顯子跳躍(SE)和內(nèi)含子保留(RI)剪接變異事件。采用clusterProfiler軟件對差異顯著的SE和RI基因行GO和KEGG富集分析注釋[6]，以發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因參與的生物學(xué)過程和代謝通路。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 先對原始read count進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和對測序深度的校正，然后通過統(tǒng)計學(xué)模型等方法行多重假設(shè)檢驗校正，得到FDR值。GO富集和KEGG富集均以P< 0.05作為為差異富集的閾值。

2 結(jié) 果

根據(jù)各樣本所有基因的FPKM值計算組內(nèi)及組間樣本的相關(guān)系數(shù)(r2)，結(jié)果顯示，組內(nèi)樣本間的r2均大于0.9(圖1)，提示實驗的生物學(xué)重復(fù)性滿足后續(xù)的分析要求。

2.1差異可變剪接基因的識別 發(fā)生SE類型可變剪接事件的基因數(shù)為11 677個，其中顯著性差異基因數(shù)為218個(FDR<0.05)；發(fā)生RI類型可變剪接事件的基因數(shù)為2 576個，其中顯著性差異基因數(shù)為54個(FDR<0.05)。

2.2顯著差異可變剪接的GO注釋 差異SE基因的GO 注釋主要富集于核糖核蛋白復(fù)合物生物發(fā)生、各類RNA(如ncRNA、mRNA、rRNA)的處理、剪接和代謝過程及核轉(zhuǎn)運的生物過程；細(xì)胞組分的定位主要在核孔、中心體、各類運輸泡膜、剪接體復(fù)合物和線粒體基質(zhì)中；其主要分子功能為RNA/DNA催化活性、泛素相關(guān)酶活性及核糖核蛋白復(fù)合物結(jié)合活性(圖2)。以上數(shù)據(jù)提示SMN蛋白對SE基因可變剪接的影響主要存在4個方面：(1)核糖核蛋白組裝；(2)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和翻譯；(3)線粒體穩(wěn)態(tài)維持；(4)與泛素-降解通路。圖3顯示差異RI基因主要富集的生物學(xué)過程為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)、泛素依賴蛋白分解調(diào)控及乙?；{(diào)控等生物過程。細(xì)胞組分的定位主要在囊泡膜和蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等，其主要分子功能為蛋白激酶B結(jié)合活性、泛素特異性蛋白酶/水解酶/連接酶活性和氧化還原酶活性等。以上數(shù)據(jù)提示SMN蛋白對RI基因可變剪接的影響主要存在4個方面：(1)蛋白/氨基酸乙?；{(diào)控；(2)泛素-降解通路；(3)基因表達(dá)；(4)與線粒體穩(wěn)態(tài)維持。

注：圖中橫、縱坐標(biāo)為各樣本相關(guān)系數(shù)的平方(r2)。

注：圖中縱坐標(biāo)為GO注釋的事件，橫坐標(biāo)為GO Term富集的顯著性水平，用log10(padj)表示，不同的灰度分別表示不同的功能分類。

注：圖中縱坐標(biāo)為GO注釋的事件，橫坐標(biāo)為GO Term富集的顯著性水平，用log10(padj)表示，不同的灰度分別表示不同的功能分類。

2.3差異可變剪接的代謝通路分析 結(jié)果分析顯示，差異SE基因主要富集在Apelin信號通路、自噬、剪接體和腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)信號通路。富集在剪接體代謝通路中的有絲氨酸/富含精氨酸的剪接因子SRSF1和SRSF7，廣泛參與剪接過程的活化。SRSF1基因位于17號染色體上，與正常對照組比較，患者組樣本中該基因在基因組負(fù)鏈坐標(biāo)58005801至58005041的區(qū)域出現(xiàn)了差異剪接，即SE，該剪接事件呈現(xiàn)顯著性增加。SRSF7基因位于2號染色體上，與正常對照組比較，患者組樣本中該基因在基因組負(fù)鏈坐標(biāo)38747062至38746747的內(nèi)含子區(qū)域出現(xiàn)了差異剪接，即患者組主要是以該區(qū)域內(nèi)含子剪接方式為主，而正常對照組在該基因中則是以基因組負(fù)鏈坐標(biāo)38748056至38746747的區(qū)域SE剪接模式為主，兩組呈現(xiàn)顯著性差異。富集在Apelin信號通路、自噬和AMPK信號通路上的磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶家族有MTOR基因，主要參與細(xì)胞生長、分化、增殖和自噬等。MTOR基因位于1號染色體上，與正常對照組比較，患者組樣本中該基因在基因組負(fù)鏈坐標(biāo)11258485至11256192的區(qū)域出現(xiàn)了差異剪接，即SE，在基因組負(fù)鏈坐標(biāo)11256933至11256192的區(qū)域出現(xiàn)了剪接事件顯著性增加。富集在自噬通路上的還有BECN1基因，主要參與自噬的調(diào)節(jié)，在發(fā)育、腫瘤發(fā)生和神經(jīng)退行性變中起重要作用。BECN1基因位于17號染色體上，與正常對照組比較，患者組樣本中該基因在基因組負(fù)鏈坐標(biāo)42814524至42810928的區(qū)域出現(xiàn)了差異剪接，即SE，該剪接事件呈現(xiàn)顯著性增加。 差異RI基因主要富集的通路在剪接體代謝和泛素化通路。富集在剪接體代謝通路中的SRSF1和SRSF5，后者參與特異基因的可變剪接調(diào)控，進(jìn)而參與細(xì)胞凋亡等多種生理過程。

3 討 論

SMN1基因缺失引起的SMN蛋白缺乏是導(dǎo)致SMA的直接原因。SMN蛋白在真核生物的組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，作為核糖核蛋白復(fù)合物的重要組成部分，在剪接體的組裝和核糖核酸蛋白的生物發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年有研究提示，SMN蛋白可能還參與了其他重要的生理過程，包括mRNA的翻譯和局部翻譯、細(xì)胞骨架動力學(xué)、內(nèi)吞和自噬等[7]。本研究基于RNA 測序?qū)颊呓M與正常對照組外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)譜進(jìn)行可變剪接分析，結(jié)果提示，SMN1基因缺失能夠改變部分基因的可變剪接，進(jìn)而影響相關(guān)蛋白的合成、組裝和降解，最終導(dǎo)致蛋白穩(wěn)態(tài)失衡?；诒狙芯繑?shù)據(jù)，SMN蛋白在蛋白穩(wěn)態(tài)維持中的功能主要體現(xiàn)在snRNP組裝與RNA剪接、mRNA的定位和翻譯、生物能量和線粒體穩(wěn)態(tài)、自噬、泛素依賴的降解通路，以及調(diào)節(jié)代謝通路及代謝酶活性乙?；揎?。

有研究表明，SMN蛋白通過與Gemin 2～8和Unrip等8個蛋白緊密結(jié)合，形成一個大分子復(fù)合物，即SMN復(fù)合體，定位在細(xì)胞質(zhì)和胞漿中[7]。SMN復(fù)合體在snRNP的組裝和核內(nèi)運輸過程中充當(dāng)分子開關(guān)的角色，進(jìn)而在后續(xù)的剪接體組裝和RNA剪接中發(fā)揮重要作用[8]。本研究通過可變剪接分析篩選出顯著差異SE事件與核糖核蛋白復(fù)合物生物發(fā)生、RNA剪接及核轉(zhuǎn)運的生物過程有關(guān)的主要基因有SRSF1、SRSF5。其中SRSF1編碼富含精氨酸/絲氨酸的剪接因子蛋白家族成員，該蛋白的磷酸化狀態(tài)和與它相互作用的蛋白決定了是可以激活還是抑制剪接。SRSF5編碼的蛋白是富含絲氨酸/精氨酸的前mRNA剪接因子家族成員，該家族構(gòu)成剪接體的一部分，這些因子中的每一個都包含一個用于結(jié)合RNA的RNA識別基序和一個用于結(jié)合其他蛋白質(zhì)的RS結(jié)構(gòu)域。RS結(jié)構(gòu)域富含絲氨酸和精氨酸殘基，促進(jìn)不同精氨酸剪接因子之間的相互作用。除了對mRNA剪接起關(guān)鍵作用外，精氨酸蛋白還被證明參與了核內(nèi)mRNA的輸出和翻譯，這些數(shù)據(jù)提示SMN蛋白對SE可變剪接基因的影響更多地集中在snRNP和剪接體的組裝調(diào)控過程。

近年來的研究顯示，SMN蛋白還與mRNA結(jié)合蛋白相互作用，并促進(jìn)它們組裝成mRNP運輸顆粒[8]，進(jìn)而調(diào)節(jié)mRNA的定位和局部翻譯[9-10]。同時有研究還發(fā)現(xiàn)，SMN蛋白也存在于軸突和樹突中，在神經(jīng)元發(fā)育或修復(fù)過程中對神經(jīng)元mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成有重要作用[11]。本研究的差異可變剪接數(shù)據(jù)也提示，SMN蛋白的缺失可影響mRNA的加工代謝和核糖體的生物合成過程，主要差異基因包括MTOR、TCS1、SRSF1等，其中MTOR基因是一個重要的真核細(xì)胞信號基因，編碼的蛋白屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶家族，該信號參與免疫抑制，影響轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、凋亡和自噬等[12]。體內(nèi)試驗提示，在小鼠模型來源的神經(jīng)元和患病者來源的成纖維細(xì)胞中SMN蛋白可能通過mTOR信號通路調(diào)控局部蛋白的合成[13]。TSC1基因編碼生長抑制蛋白Hamartin，該蛋白與GTPase激活蛋白tuberin相互作用并穩(wěn)定，負(fù)性調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素復(fù)合體靶點1(mTORC1)信號，從而阻止相關(guān)激酶的泛素化和蛋白酶體降解[14]。結(jié)合文獻(xiàn)報道及本研究數(shù)據(jù)推測，SMN蛋白可能通過以下幾種機制調(diào)控蛋白翻譯：(1)神經(jīng)元中mRNA的亞細(xì)胞定位；(2)與核糖體的結(jié)合進(jìn)而控制局部翻譯所需的核糖體單位；(3)mTOR信號的調(diào)控。對于SMN蛋白如何通過mTOR的信號調(diào)控從而在SMA的發(fā)生中發(fā)揮作用，亟待進(jìn)一步深入研究。

除了上述snRNP 組裝、mRNA的定位和翻譯等蛋白合成通路外，蛋白清除/降解通路也是蛋白穩(wěn)態(tài)維持的重要機制。真核生物的蛋白降解清除機制主要有兩種途徑，即泛素依賴的蛋白酶體系統(tǒng)/溶酶體蛋白水解及自噬。本研究SMN蛋白對SE和RI可變剪接影響均指向自噬和泛素-降解通路，這些基因包括GABARAPL1、BECN1等，其中GABARAPL1基因是雌激素誘導(dǎo)的早期基因，編碼從線蟲到人類高度保守的蛋白質(zhì)，是正常自噬通量所必需的[15]。BECN1基因位于染色體17q21上，參與自噬的調(diào)節(jié)，在發(fā)育、腫瘤發(fā)生和神經(jīng)退行性變中起重要作用[16-17]。

本研究還提示，SMN蛋白的缺失影響了線粒體穩(wěn)態(tài)維持和能量代謝相關(guān)的基因可變剪接，主要基因有GABARAPL1、MCL1，其中GABARAPL1基因也參與細(xì)胞能量代謝的調(diào)控，包括基礎(chǔ)耗氧速率、細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷、總谷胱甘肽和受損線粒體積聚等[15]。MCL1基因是在人髓系白血病細(xì)胞系分化過程中發(fā)現(xiàn)的早期誘導(dǎo)基因，可能通過不同的剪接機制和所產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長狀態(tài)[18]。近期有研究提示，在SMN蛋白缺失的小鼠模型中神經(jīng)元的線粒體功能缺陷，包括線粒體代謝的基礎(chǔ)和最大呼吸指標(biāo)異常、受損的線粒體膜容受性、線粒體動力學(xué)異常改變等[19]。當(dāng)然SMN蛋白在線粒體穩(wěn)態(tài)維持和能量代謝中的作用機制還需進(jìn)一步闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)，SMN1基因的缺失可導(dǎo)致乙?；揎椣嚓P(guān)的基因發(fā)生RI可變剪接差異。乙酰化是改變蛋白功能最主要的修飾方式之一。目前有研究提示，乙?；揎椆δ艹擞绊懠?xì)胞染色體結(jié)構(gòu)及對核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的激活方面外，還參與調(diào)節(jié)代謝通路及代謝酶的活性[20]，為SMA的發(fā)病機制提供了新的線索。

本研究通過對SMN1基因缺失型SMA患者外周血淋巴細(xì)胞的可變剪接分析提示，SMN蛋白缺陷能夠改變部分基因的可變剪接，這些基因主要參與snRNP組裝與RNA剪接、mRNA的定位和翻譯、生物能量和線粒體穩(wěn)態(tài)、自噬、泛素依賴的降解通路，以及調(diào)節(jié)代謝通路及代謝酶活性乙?；揎?，進(jìn)而影響相關(guān)蛋白的合成、組裝和降解，最終導(dǎo)致蛋白穩(wěn)態(tài)失衡，為SMA的發(fā)病機制提供新的線索。下一步將通過體外和體內(nèi)試驗對其中關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究，以期有新的發(fā)現(xiàn)。