劉國民 高日明 尚策 宋慶慶 王凱 陳炳全 朱修澤/金宇保靈生物藥品有限公司 010030

口蹄疫滅活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S）是重要的免疫抗原，其含量、完整性、穩(wěn)定性決定了疫苗的免疫效果?？谔阋卟《臼菬o囊膜病毒，對氯仿不敏感，對溫度、酸堿度比較敏感，當pH 變化或溫度升高時完整病毒146S容易分解。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果將大幅度降低。生產中如何保護146S 抗原完整性以及保證疫苗純度是工藝攻關難點。完整病毒粒子配合優(yōu)質佐劑，刺激機體產生抗體或致敏淋巴細胞，進而保護易感動物不被口蹄疫病毒感染，最終使口蹄疫滅活疫苗起到防控疫病的作用。

疫苗生產是系統(tǒng)工程，包括細胞培養(yǎng)、病毒放大生產、純化濃縮、分裝乳化、保存、使用等工序。臨床使用時，合格的疫苗必須具備安全、高效、均一、穩(wěn)定的特性。生產過程中采用合理的保存溫度和濃度，有助于延長病毒的保存期和維持較高的抗原水平，對生產中抗原的保存具有重要意義。本文通過對不同毒株熱穩(wěn)定試驗、半成品不同溫度、濃度下146S 變化、同時通過成品疫苗保存期試驗及挑戰(zhàn)試驗等證明不同的口蹄疫毒株對溫度敏感性不同，半成品、產品疫苗對溫度、酸度比較敏感，2℃～8℃是疫苗最佳保存條件，本文章研究結果對疫苗穩(wěn)定性方面研究有一定指導作用。

1 材料

1.1 口蹄疫毒株病毒液分別收集培養(yǎng)好的A/WH/09 毒株培養(yǎng)液、O/MYA98 毒株培養(yǎng)液、OR/80 毒株培養(yǎng)液及OZK/93 毒株培養(yǎng)液，各取1000mL 備用。

1.2 口蹄疫半成品原液及濃縮液A/WH/09、O/MYA98 口蹄疫滅活半成品抗原各1000mL，由金宇保靈公司生產部提供。

1.3 口蹄疫成品滅活疫苗OA 型口蹄疫滅活成品疫苗（20瓶）由金宇保靈公司生產部提供。

2 方法

2.1 不同口蹄疫毒株熱穩(wěn)定性試驗將A/WH/09 毒株、O/MYA98 毒株、OR/80 毒株及OZK/93 毒株病毒樣品，先進行批量解凍，將毒液分裝成10mL 離心管12 只，將不同口蹄疫毒株在90℃熱水浴鍋中滅活1min～8min，檢測TCID50，并記錄數(shù)據(jù)，主要觀察口蹄疫毒株對溫度的敏感性。

2.2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下146S 影響試驗隨機抽取本公司生產部滅活抗原液及其相應批號的10倍濃縮純化液，分別取樣進行初始樣品146S 含量的測定；將原液樣和10 倍濃縮后樣分別分裝，20mL/瓶，每種樣品分2 組，分別在-20℃和4℃冰箱中保存7 個月，每月定期各取出1 個樣品分別進行146S 的測定。

2.3 口蹄疫成品滅活疫苗保存期試驗及反復凍融挑戰(zhàn)試驗將同批次的20 瓶OA 型口蹄疫滅活成品疫苗分成兩組，一組2℃～8℃保存12 個月，每月抽檢一瓶；另一組做-20℃挑戰(zhàn)試驗，保存8 瓶并反復凍融5 次，凍融后檢測抗原含量。

3 結果

3.1 不同口蹄疫毒株熱穩(wěn)定性 從表1 數(shù)據(jù)可知，口蹄疫不同毒株對熱穩(wěn)定性有差異

表1 90℃熱水浴對不同口蹄疫毒株穩(wěn)定性試驗（TCID50）

3.2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下146S 影響從表2 數(shù)據(jù)可知，口蹄疫半成品在4℃和-20℃保存的7 個月中，完整病毒146S 粒子的含量均有所下降。4℃保存條件下，原液樣和濃后樣完整病毒146S 粒子的降解率分別為27.5%、12.3%；-20℃保存條件下，其降解率分別為87.5%、92.4%。從本試驗數(shù)據(jù)證明，4℃比-20℃保存條件更有利于抗原的保存，濃度對抗原保存影響不顯著。3.2 口蹄疫成品滅活疫苗保存期試驗及反復凍融挑戰(zhàn)試驗結果

表2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下對完整病毒146S檢測結果（ug/mL）

從圖1 數(shù)據(jù)可知，口蹄疫 A 型、O 型滅活疫苗在2℃～8℃分別放置 12 個月，每月采用蔗糖密度梯度離心定量法檢測146S 含量，結果發(fā)現(xiàn)，146S 抗原含量基本沒有變化,說明疫苗有效抗原保存比較好，完整病毒粒子保存完整。

圖1 口蹄疫成品疫苗2℃～8℃保存12月146S 含量變化（μg/mL）

從圖2 數(shù)據(jù)可知，將口蹄疫滅活疫苗多次冷凍融化后，抗原含量降解比較多，每次反復凍融抗原損失10～20%左右，5 次反復凍融后，抗原損失50%左右，因此在保管疫苗時盡量不要凍融。凍融后的疫苗堅決不能使用，因為完整病毒粒子146S 已經裂解為無效的12S 五聚體。

圖2 口蹄疫O 型、A 型滅活疫苗反復凍融后146S 抗原含量變化（μg/mL）

圖3 口蹄疫衣殼蛋白在存儲、加熱、低pH 條件下，完整病毒粒子146S 裂解成12S 五聚體電鏡圖

4 討論

穩(wěn)定的抗原、有效的佐劑是疫苗研究的重點和難點。滅活疫苗在長期儲存、加熱和微酸性環(huán)境中，病毒顆粒極其容易裂解，裂解產物也被稱為12S，12S 是一個由VP1，VP2，VP3組成的五聚體。因為五聚體之間存在大量的組氨酸殘基，在酸性環(huán)境下組氨酸會迅速發(fā)生質子化，釋放正電荷，通過靜電排斥作用引發(fā)粒子裂解，這是口蹄疫不穩(wěn)定的原因。由于146S 粒子在酸性環(huán)境下分解成12S 粒子，而12S 表面的免疫反應位點被隱藏或發(fā)生形變的緣故，使12S 不具備任何免疫原性，無法激發(fā)產生抗體，降低口蹄疫疫苗的免疫效力。口蹄疫病毒會在高溫狀態(tài)下，使組合狀態(tài)的 12S 粒子轉化為分解狀態(tài)，因此口蹄疫病毒不宜長期暴露在高溫狀態(tài)下，口蹄疫疫苗效力與口蹄疫滅活疫苗中的 146S 粒子數(shù)量有關，若是能夠確保 146S 粒子穩(wěn)定不被分解，口蹄疫疫苗的效力就能到有效的保護，這也是口蹄疫滅活疫苗2℃～8℃保存的機理?？谔阋呖乖€(wěn)定性差給口蹄疫疫苗的生產、儲存和應用帶來了很多困難，使用過程中必須全程冷鏈運輸以保護口蹄疫的免疫原性。

口蹄疫病毒抗原對酸和熱極其敏感，為了保證疫苗質量，生產商采取研發(fā)疫苗抗原保護劑、增加昂貴的冷鏈運輸系統(tǒng)、將優(yōu)質疫苗送到用戶手中。如何保障疫苗抗原不降解或降解速率慢，是疫苗生產企業(yè)的難點，但金宇生物一直采用自主研發(fā)的UTM 保護劑，從工藝技術上保障疫苗穩(wěn)定性，從運輸環(huán)節(jié)上采用無死角的2℃～8℃冷鏈運輸，使客戶用上最好、最新鮮的疫苗。不論后續(xù)技術如何革新，口蹄疫病毒粒子的完整性和穩(wěn)定性研究，一直是廣大科技從業(yè)者長期努力和研究的方向。