鄧仲元，賀星，周新強，鄭甦

（深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，廣東 深圳 518104）

0 引言

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種臨床上最常見的骨關(guān)節(jié)疾病，隨著年齡增長，免疫機能退化，預(yù)期壽命增加，本病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1,2]。研究顯示，各種因素造成關(guān)節(jié)軟骨損傷，也會引發(fā)自體抗原和損傷，導(dǎo)致無菌炎癥的產(chǎn)生，進一步損傷關(guān)節(jié)軟骨，在膝關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生緩慢、持續(xù)、漸進的炎癥，炎癥在KOA 發(fā)病的進程發(fā)揮重要的角色[3]。臨床上治療KOA 的目標(biāo)主要是控制癥狀，減輕疼痛，改善膝關(guān)節(jié)功能，改善生活質(zhì)量。治療方法有保守治療，如宣傳教育、下肢功能鍛煉、物理治療、藥物等；有手術(shù)治療，如保膝手術(shù)、單髁置換術(shù)、全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)。從45 歲到60 歲，腸道菌群的具體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。在60～80 歲趨于相對穩(wěn)定，超過80 歲其菌群結(jié)構(gòu)再次發(fā)生變化，其結(jié)構(gòu)組成和多樣性的改變在許多慢性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[4]。Toll 樣受體4 是Toll 樣受體（TLR）家族成員之一，其可通過相關(guān)信號通路介導(dǎo)炎性反應(yīng)[5]。白介素1（IL-1）和白介素18（IL-18）是白介素家族成員，均是促炎癥因子，參與炎性反應(yīng)和組織修復(fù)。但是，腸道菌群的群落在KOA 患者是否有變化，是否與炎癥反應(yīng)存在相互作用的關(guān)系，目前尚不十分清楚。為此，作者探討KOA 患者TLR4、IL-1、IL-18 的表達(dá)關(guān)系，腸道菌群的變化，以及兩者是否存在相關(guān)性，為KOA 患者的診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 一般情況

研究病例來自2017 年1 月至2019 年12 月在深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科治療的慢性膝關(guān)節(jié)疼痛病史、X 線檢查并結(jié)合臨床表現(xiàn)初次確診膝關(guān)節(jié)炎患者74 例的完整臨床資料，為實驗組，男性31 例，女性43 例，年齡40～85 歲，平均年齡(71.0±7.5)歲。對照組為同期在我院進行體檢的年齡大于50 歲的自愿參與本研究的健康人50 例，男性20 例，女性30例，年齡41～86 歲，平均年齡(70.0±7.9)歲。兩組對象性別、年齡、體重指數(shù)、空腹血糖、飲食情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）實驗組患者的診斷符合膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。（2）X 線片表現(xiàn)為：非對稱性膝關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨硬化，囊性變，關(guān)節(jié)邊緣見骨贅形成。MRI 檢查提示膝關(guān)節(jié)軟骨變薄，半月板損傷，關(guān)節(jié)腔積液等。（3）Kellgren-LawrenceⅠ～Ⅳ級。（4）自愿參與本研究，并簽署告知同意書。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）既往膝關(guān)節(jié)手術(shù)史，糖尿病及其他腸道菌群的疾病，服用抗生素等可能影響腸道菌群的藥物。（2）膝關(guān)節(jié)腫瘤、結(jié)核、化膿性炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎及心腦肺腎等嚴(yán)重病變者。（3）膝關(guān)節(jié)交叉韌帶斷裂者。（4）不愿意參與本研究者。

1.2 方法

1.2.1 血清TLR4、IL-1、IL-18 檢測

抽取所有研究對象清晨空腹肘部靜脈血5mL，送至檢驗科,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測TLR4、IL-1、IL-18 水平。

1.2.2 腸道菌群的檢測

采集兩組研究對象自然排出的新鮮糞便約6g，置入密閉無菌容器內(nèi)，0.5h 內(nèi)送檢中心實驗室。稱取糞便2g，其余置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。提取樣本總NDA，用瓊漿糖凝膠電泳檢測提取DNA 的基因組的完整性。選擇10000 個高質(zhì)量的16srRNA 擴增子序列進行分析，1 個患者因糞便DNA含量低被排除。所有的樣本的16S rDNA 的V3-V4 區(qū)進行PCR 擴增，送至北京諾禾科技公司進行高通量測序。得到有效序列后進行聚類分析，得到各樣本類別信息，進而得到各類別豐度和均勻度信息，對兩組人群糞便標(biāo)本中的腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、梭菌、總菌數(shù)進行培養(yǎng)計數(shù)和鑒定。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0 軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組之間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的連續(xù)變量以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，兩組之間比較采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以百分率（%）表示，兩組之間比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清TLR4、IL-1、IL-18 檢測結(jié)果

實驗組血清TLR4 顯著高于對照組，IL-1、IL-18 低于對照組（實驗組血清TLR4 高于對照組，IL-1、IL-18 低于對照組（109.31±22.09）ng/L vs（66.80±6.02）ng/L，（88.55±0.89）pg/mL vs（110.29±20.98）pg/mL, （210.24±22.4）pg/mL vs（345.56±43.62）pg/mL,P<0.05。見表1。

表1 兩組血清TLR4、IL-1、IL-18 檢測結(jié)果(±s)

表1 兩組血清TLR4、IL-1、IL-18 檢測結(jié)果(±s)

注：*與對照組比較，P<0.05

組別 例數(shù) TLR4（ng/L） IL-1(pg/mL) IL-18(pg/mL)實驗組對照組74 50 109.31±22.09*66.80±6.02 88.55±0.89*110.29±20.98 210.24±22.4*345.56±43.62 tP 28.387 0.000 20.165 0.000 15.951 0.000

2.2 兩組腸道菌群結(jié)果的比較（M，lg copies/g 糞便）

實驗組與對照組比較，雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、梭菌、總菌數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（8.51±0.56）vs（9.89±0.40），（8.91±0.43）vs（9.69±0.33），（8.96±0.36）vs（8.05±0.31），（8.51±0.42）vs（8.01±0.24），（7.96±0.16）vs（7.09±0.19），（9.16±0.06）vs（9.68±0.87），（8.02±0.24）vs（9.02±0.66）。P<0.05，見表2。

表2 兩組腸道菌群結(jié)果的比較（M， lg copies/g 糞便）

2.3 實驗組患者 TLR4、IL-1、IL-18 與腸道菌群的Pearson 相關(guān)性分析

經(jīng)過Pearson 相關(guān)性分析，實驗組患者TLR4 與雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、總菌值呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），與腸桿菌、腸球菌、梭菌呈正相關(guān)（P<0.05）；IL-1、IL-18 與雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、總菌值呈正相關(guān)（P<0.05），與腸桿菌、腸球菌、梭菌呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），見表3。

表3 實驗組研究對象TLR4、IL-1、IL-18 與腸道菌群的Pearson 相關(guān)性分析

2.4 實驗組患者腸道菌群的logistic 回歸分析

以總菌數(shù)為自變量，TLR4、IL-1、IL-18 為因變量，進 行l(wèi)ogistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，TLR4、IL-1、IL-18 是實驗組患者總菌數(shù)的影響因素。結(jié)果見表4。

表4 實驗組患者腸道菌群的logistic 回歸分析

3 討論

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（KOA）被認(rèn)為是全球范圍內(nèi)致殘的主要原因，關(guān)節(jié)軟骨的退變性疾病，后期導(dǎo)致嚴(yán)重的疼痛和關(guān)節(jié)功能喪失[6]。由于人類平均壽命的延長以及飲食習(xí)慣和生活方式的改變，其患病率也在不斷增加。許多因素可以促進KOA 的發(fā)生發(fā)展，腸道菌群近來已成為KOA 起始和發(fā)展的重要致病因素。遺傳，年齡，性別，飲食，生活方式和社會經(jīng)濟方面是影響機體肌肉骨骼健康以及腸道菌群平衡的重要因素。通過產(chǎn)生大量各種各樣的生物活性小分子，腸道菌群可以向腸外器官發(fā)出信號，與宿主的代謝、內(nèi)分泌、免疫和肌肉骨骼系統(tǒng)建立復(fù)雜的聯(lián)系。腸道菌群的生物多樣性和菌群功能的異常，也稱作腸道菌群失調(diào)，很可能與炎癥有關(guān)，炎癥是KOA 發(fā)展的最主要危險因素之一。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者的代謝異常表現(xiàn)為慢性低度全身性炎癥的持續(xù)存在[7]。KOA不僅是關(guān)節(jié)軟骨的退變，而且是各種炎癥因子共同參與的代謝性疾病，其特點是軟骨合成降解因子水平降低、促合成因子水平增高，而炎癥因子水平紊亂是該病發(fā)展的重要推動因素[8]。Boer, CG 等認(rèn)為巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥在骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛和嚴(yán)重程度中有因果作用，并且由腸道菌群產(chǎn)生的內(nèi)毒素引發(fā)的，認(rèn)為腸道菌群是膝關(guān)節(jié)炎疼痛可能的靶向治療目標(biāo)[9]。

Toll 樣受體(toll-like receptor,TLR) 作為模式識別受體的關(guān)鍵成分之一，在先天免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用。Toll 樣受體4(TLR4)是TLR 家族成員，在機體的各種細(xì)胞和組織均有表達(dá)，能識別病原體，激活一系列免疫應(yīng)答，是外周血單核細(xì)胞抗感染的重要組成部分[10]，影響腸道菌群環(huán)境，對人體腸道內(nèi)的多種微生物產(chǎn)生作用。KOA 患者腸道菌群的變化很可能與TLR4 及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在一定的聯(lián)系。研究表明IL-1、IL-18 均是骨關(guān)節(jié)炎的主要細(xì)胞因子，刺激介導(dǎo)前列腺素以及膠原酶、中性蛋白酶等軟骨降解酶的合成和分泌，從而導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)面軟骨破壞。IL-1、IL-18 是由軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的,是引起骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要因素[11,12]。人體腸道內(nèi)的大部分細(xì)菌定植于人體結(jié)腸內(nèi)，其對宿主的健康與營養(yǎng)起著重要作用，是激活和維持腸道生理功能的關(guān)鍵因素。如果患者腸道出現(xiàn)菌群失調(diào)，必將觸發(fā)機體炎癥反應(yīng)，包括全身性和局灶性炎癥反應(yīng)，參與KOA的發(fā)生、發(fā)展。

本研究顯示，與對照組進行比較，實驗組患者腸道菌群中，雙歧桿菌、乳桿菌、梭菌數(shù)量減少，而腸桿菌、腸球菌、擬桿菌數(shù)量增加，總菌值也相應(yīng)減小。膝關(guān)節(jié)炎患者經(jīng)歷慢性反復(fù)長期的炎癥因子刺激后，腸道微生態(tài)失衡，腸道細(xì)菌發(fā)生異位[13]。腸道菌群隨著患者年齡增長發(fā)生變化，患者的腸道免疫功能低下等[14]。當(dāng)機體受到外界環(huán)境、飲食及用藥等因素影響時，腸道中的腸桿菌、腸球菌、擬桿菌等條件致病菌可有機會轉(zhuǎn)為致病菌，破壞機體正常的生理平衡，使得腸道微生態(tài)失調(diào)[15]。經(jīng)過Pearson 相關(guān)性研究，KOA 患者TLR4 與與 雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、總菌呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），與腸桿菌、腸球菌、梭菌呈正相關(guān)（P<0.05）；IL-1、IL-18 與雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、總菌呈正相關(guān)（P<0.05），與腸桿菌、腸球菌、梭菌呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。經(jīng)logistic 回歸分析研究發(fā)現(xiàn)，TLR4、IL-1、IL-18 是KOA 患者總菌的影響因素。可能的原因是KOA 患者腸道菌群失衡，腸道細(xì)菌發(fā)生異位，腸壁通透性增強，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，導(dǎo)致TLR4 過表達(dá)，進而誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生免疫應(yīng)答，同時激活NFκB 途徑促進軟骨細(xì)胞中炎性因子IL-1、IL-18 的釋放，引起膝關(guān)節(jié)慢性炎性病變。

本次研究發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)炎患者TLR4、IL-1、IL-18 的異常表達(dá)，影響了患者的腸道菌群，在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病病程起一定的作用。對于KOA 的發(fā)病原因，腸內(nèi)因素中具體是哪些腸道微生物及其代謝產(chǎn)物發(fā)揮了重要作用，腸外因素膝關(guān)節(jié)自身的疾病變化，還是兩者互為影響，探索更多更精確的分子生物學(xué)機制，這將是需要下一步研究的內(nèi)容。