徐小龍 ，劉 穎 ，陳乃江

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院·江蘇省連云港市中醫(yī)院，江蘇 連云港 222006； 2. 江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222006）

葛根定眩膠囊由葛根、桂枝、生白芍、炙甘草、僵蠶、羌活、川芎、鉤藤、生姜9 味中藥組方，其主要功效為解肌和營(yíng)、疏風(fēng)定眩，主治太陽(yáng)經(jīng)樞不利所致頸項(xiàng)強(qiáng)痛、頭痛、頭暈?zāi)垦５劝Y狀。該制劑中含有僵蠶，2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中收載的相關(guān)藥材均涉及黃曲霉毒素（AF）的檢測(cè)。AF 屬呋喃香豆素的多環(huán)結(jié)構(gòu)化合物，主要由黃曲霉和寄生曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)生［1－2］，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2是 AF 最常見(jiàn)的有毒衍生物，其中毒性最強(qiáng)的是 AFB1［3］。目前，檢測(cè) AF 的方法有液相色譜 － 質(zhì)譜聯(lián)用法［4－6］、熒光分光光度法、高效液相色譜法、免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜（HPLC）－ 柱后光化學(xué)衍生法等［7－15］。其中 HPLC － 柱后光化學(xué)衍生法簡(jiǎn)便快捷，且AFB1和AFG1經(jīng)紫外線照射即具有熒光性［7］，應(yīng)用HPLC 熒光檢測(cè)器就可完成檢測(cè)。本研究中建立了測(cè)定葛根定眩膠囊中AF 有毒衍生物 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2含量的 HPLC － 柱后光化學(xué)衍生法，并評(píng)價(jià)其安全性，為提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司），配有 Waters 2695－2475 型熒光檢測(cè)器，Empower 3 型色譜工作站；KQ－500TDB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為80 kHz）；AE－100 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.000 1 g）；AF 免疫親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司，批號(hào)為171117）。

1.2 試藥

葛根定眩膠囊（江蘇省連云港市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào)分別為 20201208，20210618，20210619，20210620）；AFB1，AFB2，AFG1，AFG2混合對(duì)照品溶液（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為610001－202006，標(biāo)示濃度依次為 1.04，0.38，1.08，0.38 μg ／mL）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；磷酸、氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex C18Gemini 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 － 乙腈 － 水（40 ∶18 ∶42，V ／ V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器；激發(fā)波長(zhǎng)：365 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：450 nm；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，相鄰色譜峰的分離度大于1.5，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.AFG2 2.AFG1 3.AFB2 4.AFB1A.Mixed standard solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

2.2 溶液制備

精密量取 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2混合對(duì)照品溶液0.5 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得AF 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取樣品，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取15 g，精密稱定，置勻質(zhì)瓶中，加氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌 2 min，離心（轉(zhuǎn)速為 12 000 r／min）5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，離心（12 000 r／min）10 min，取上清液 20 mL，過(guò)AF 免疫親合柱，加水20 mL 洗脫，棄洗脫液，使空氣入柱，將水?dāng)D出，加適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。以甲醇為陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察、檢測(cè)限及定量限確定：精密吸取2.2 項(xiàng)下 AF 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液 5，10，15，20，25 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X，pg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。精密量取2.2 項(xiàng)下AF 混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，以甲醇逐級(jí)稀釋，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S ／ N）為 3 時(shí)的響應(yīng)強(qiáng)度濃度為檢測(cè)限，以 S ／ N 為10 時(shí)的響應(yīng)強(qiáng)度濃度為定量限。結(jié)果見(jiàn)表1。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定7 次，記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表1，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20210619）樣品2 g，精密稱定，共6 份，精密量取2.2 項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4 mL，依法制備供試品溶液，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定2 次，記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表1，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0，1，2，4，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，并記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表1，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表1 方法學(xué)考察結(jié)果Tab.1 Results of the methodological investigation

加樣回收試驗(yàn)：取不含AF 的陰性樣品，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取15 g，精密稱定，置勻質(zhì)瓶中，加氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇75 mL，攪拌2 min，離心（轉(zhuǎn)速為12 000 r／min）5 min，精密量取上清液 15 mL，置 50 mL容量瓶中，分別精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1，2，3 mL，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝ 9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品（批號(hào)分別為 20201208，20210618，20200619，20210620）適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表 3。2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定，AFB1和AFB1，AFB2，AFG1，AFG2總量的最高限量分別為 5 μg／kg和10 μg／kg，故4 批樣品AF 殘留量測(cè)定結(jié)果均符合藥典規(guī)定。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg／kg）Tab.3 Results of content determination of AF in the samples（μg ／kg）

3 討論

3.1 檢測(cè)方法選擇

中藥材和食品中AF 檢測(cè)方法主要有薄層層析法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、金標(biāo)免疫層析檢測(cè)技術(shù)、質(zhì)譜法等。葛根定眩膠囊由9 味藥材組方，成分復(fù)雜，其中僵蠶屬昆蟲類藥物，生物活性蛋白成分多，用常規(guī)的薄層層析法及酶聯(lián)免疫吸附法做定性檢測(cè)，專屬性不強(qiáng)。HPLC－柱后光化學(xué)衍生法可定量快速檢測(cè)；另外，商品化的免疫親合柱多，獲取方便，方法簡(jiǎn)單，易驗(yàn)證和確認(rèn)，用于檢測(cè)葛根定眩膠囊中AF 有毒衍生物的含量，靈敏度高，特異性強(qiáng)，快捷準(zhǔn)確。

3.2 流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

AF 為極性化合物，流動(dòng)相以水為基礎(chǔ)溶劑。曾考察乙腈 － 水（55 ∶45，V ／ V）和甲醇 － 水（70 ∶30，V ／ V）2 種流動(dòng)相對(duì)色譜分離效果的影響，均能有效洗脫和檢測(cè)AF，但以甲醇 － 乙腈 － 水（40 ∶18 ∶42，V ／ V ／ V）為流動(dòng)相時(shí)AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 個(gè)成分均能做到基線分離，色譜峰峰形尖銳、對(duì)稱。以流動(dòng)相為背景溶液，以熒光檢測(cè)器在190 ～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，結(jié)果AFB1，AFB2，AFG1，AFG2最佳激發(fā)波長(zhǎng)為 360 nm，AFG1和AFG2在 450 nm 波長(zhǎng)附近有最大吸收，AFB1和 AFB2在430 nm 波長(zhǎng)附近有最大吸收，最終選擇激發(fā)波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 450nm。AFB2和 AFG2熒光吸收較弱，借助紫外衍生器（254 nm）熒光吸收強(qiáng)度可提升10 倍以上。

3.3 方法操作要點(diǎn)

AF 性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液在2.1 項(xiàng)下色譜條件的響應(yīng)穩(wěn)定可靠，且考慮樣品前處理凈化、富集是影響測(cè)定結(jié)果的主要因素，必要時(shí)可進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)。對(duì)于多數(shù)陰性樣品或遠(yuǎn)低于限度的極弱陽(yáng)性樣品，不必追究其真實(shí)含量和檢測(cè)精密度；對(duì)于遠(yuǎn)超限度的強(qiáng)陽(yáng)性樣品，可采用外標(biāo)一點(diǎn)法予以定量控制。

3.4 安全性評(píng)價(jià)

AF 是一種劇毒物質(zhì)，已被癌癥研究機(jī)構(gòu)劃為一類致癌物，適宜生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的條件為10 ～45 ℃，最適溫度為30 ℃，相對(duì)濕度為85%，要求藥品在存儲(chǔ)、運(yùn)輸過(guò)程中要注意控制溫度和相對(duì)濕度。需進(jìn)行AF 檢測(cè)的中藥材品種包括15 個(gè)種子果實(shí)類中藥材（馬錢子、使君子、大棗、豆蔻等），2 個(gè)根和根莖類中藥材（遠(yuǎn)志、延胡索），8 個(gè)動(dòng)物類中藥材（水蛭、地龍、全蝎、蜈蚣、僵蠶、蜂房、九香蟲、土鱉蟲）［16］。本研究中僅 1 個(gè)批次樣品檢出AF 有毒衍生物，其含量為 AFB11.39 μg ／ kg，AFB20.13 μg ／kg，AFG20.10 μg ／kg，其他 3 個(gè)批次均未檢出。2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定，AFB1的最大限量為 5 μg ／ kg，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2總量不超過(guò)10 μg／kg，符合藥典規(guī)定，可為以僵蠶生藥粉為原料的中成藥檢查AF 提供參考。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可用于葛根定眩膠囊的質(zhì)量控制，且所檢測(cè)的AF 殘留量均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。