周 俊，李雪芹，唐 蕾，趙偉國(guó)

（廣東省中山市人民醫(yī)院，廣東 中山 528403）

復(fù)方透骨寬筋洗劑為醫(yī)院特色制劑，臨床應(yīng)用歷史悠久，療效確切，由寬筋藤、蘇木、透骨草等多味中藥組方，具有活血散瘀、舒筋活絡(luò)、消腫止痛功效，多用于治療跌打扭傷、骨折、脫位后期功能恢復(fù)等。根據(jù)臨床用藥經(jīng)驗(yàn)和處方藥材有效成分，制劑提取工藝采取水煎煮。方中透骨草、蘇木、千年健等均含有大量黃酮類物質(zhì)，因此本研究中以總黃酮和總固形物的含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化制劑的提取工藝?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DZTW 型調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；KA－1000C 型低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AUW2200 型電子分析天平（精度為 0.1 mg／0.01 mg），UV －1800 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，均購自日本島津公司。

1.2 試藥

藥材飲片（廣州康圣藥業(yè)有限公司）；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100080－201811，含量為92.4%）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 溶液制備

取蘆丁對(duì)照品25 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加80%乙醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.25 mg ／mL 的對(duì)照品溶液。按處方稱取藥材 135 g（其中荊芥穗水煎1 次，于第2 次煎液中加入），加10 倍量水，煎煮 1.5 h，煎煮 2 次，合并、濃縮濾液，加入含苯甲酸鈉 0.3 g、羥苯乙酯0.06 g 的乙醇溶液，攪拌使溶解，添加適量蒸餾水，得100 mL 藥液；精密量取藥液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用水定容，得樣品溶液；精密量取樣品溶液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用80%乙醇定容，搖勻，以 3 000 r／min 的速率離心 10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.1.2 測(cè)定方法

精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各3 mL，分別置25 mL 容量瓶中，各加入30%乙醇至15 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置3 min；加入10%硝酸鋁溶液 1.0 mL，搖勻，放置 3 min；加入 4.3% 氫氧化鈉溶液3.0 mL，搖勻，放置5 min，用30%乙醇定容至25 mL。在400 ～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，測(cè)定吸光度，結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液均在510 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇510 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL，分別置 25 mL 容量瓶中，各加入30%乙醇至15 mL，按2.1.2 項(xiàng)下方法操作，以相應(yīng)試劑作空白對(duì)照，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C，mg／mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A ＝12.395 C ＋0.009 6（r ＝0.999 8，n ＝7）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在 0.01 ～0.07 mg ／mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液3 mL，共6 份，分別置 25 mL 容量瓶中，按 2.1.2 項(xiàng)下方法操作，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果蘆丁吸光度的 RSD 為0.21%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取供試品溶液3 mL，按2.1.2項(xiàng)下方法操作，分別于顯色后 0，5，10，15，20，25 min 時(shí)在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果蘆丁吸光度的 RSD為 1.64% （n ＝ 6），表明顯色后 25 min 內(nèi)吸光度基本穩(wěn)定，故應(yīng)在顯色后25 min 內(nèi)測(cè)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取供試品溶液 6 份，按 2.1.2 項(xiàng)下方法操作，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果蘆丁吸光度的 RSD 為 0.53%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品溶液0.5 mL，共 6 份，分別置 10 mL 容量瓶中，精密加入對(duì)照品溶液 6.0 mL，用80%乙醇定容，搖勻，以 3 000 r／min的速率離心10 min，取上清液，依法制備供試品溶液，取3 mL，按 2.1.2 項(xiàng)下方法操作，在 510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入回歸方程，并計(jì)算供試品的含量。結(jié)果蘆丁的平均回收率為 98.23%，RSD 為 0.77% （n ＝ 6）。

2.2 總固形物含量測(cè)定

精密量取樣品溶液20 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中蒸干，將所得干膏于105 ℃下干燥至恒重，精密稱定，計(jì)算總固形物含量。

2.3 工藝參數(shù)優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)。在確定水提工藝路線基礎(chǔ)上，以浸泡時(shí)間（因素A）、加水量（因素B）、煎煮時(shí)間（因素 C）、煎煮次數(shù)（因素 D）為考察因素［1－3］，以總黃酮和總固形物的含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)分＝總黃酮含量隸屬度×0.5 ＋總固形物含量隸屬度×0.5，隸屬度＝（測(cè)定值－最小測(cè)定值）／（最大測(cè)定值－最小測(cè)定值）。采用 L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)方透骨寬筋洗劑的工藝。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of the L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the L9（34）orthogonal test

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)助手Ⅱ（V3.1 專業(yè)版）進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3?？梢?，考察因素對(duì)綜合評(píng)分均無顯著影響。直觀分析結(jié)果表明，影響最大為因素D；極差分析顯示，其水平3 提取效果最佳，水平2 與水平3 相差不大，從生產(chǎn)成本方面考慮，最優(yōu)工藝選擇水平2；其次為因素C 和因素B，極差分析顯示，兩者水平3 提取效果最佳，水平2 與水平3 相差不大，從生產(chǎn)成本方面考慮，最優(yōu)工藝選擇水平2；因素A 對(duì)提取效果影響最小，水平2 與水平3 幾乎無差異，最優(yōu)工藝選擇水平2。故最終確定的工藝為A2B2C2D2，即加10 倍量水，浸泡30 min，煎煮 1.5 h，煎煮 2 次。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of ANOVA

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)優(yōu)選工藝參數(shù)A2B2C2D2的可靠性與重現(xiàn)性進(jìn)行驗(yàn)證，并與理論最大提取工藝參數(shù)A2B3C3D3（即加12 倍量水，浸泡30 min，煎煮2 h，煎煮3 次）進(jìn)行比較。按驗(yàn)證試驗(yàn)優(yōu)選工藝條件平行制備3 份樣品，理論最大工藝條件平行制備2 份，測(cè)定提取液中總黃酮和總固形物的含量。詳見表4。可見，優(yōu)化工藝條件下總固形物和總黃酮含量的平均值分別為理論工藝條件下的85.83%和 80.04% 。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（mg／mL）Tab.4 Results of the validation test（mg ／mL）

3 討論

3.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇

方中，透骨草中黃酮、香豆素、多肽、甾醇、萘醌等化學(xué)成分的主要藥理成分為黃酮、香豆素、萘醌［4－6］，蘇木、威靈仙、千年健、鉤藤、荊芥穗等含有黃酮類物質(zhì)［7－14］，故本研究中以總黃酮的含量為提取工藝優(yōu)化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。總固形物的含量是中藥制劑提取工藝中常用評(píng)價(jià)指標(biāo)［15－16］，考慮到中藥有效成分的復(fù)雜性，故以總黃酮和總固形物的含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.2 總黃酮測(cè)定方法選擇

尚未見復(fù)方透骨寬筋洗劑總黃酮測(cè)定方法的報(bào)道，本研究中選擇紫外可見分光光度法進(jìn)行測(cè)定。方法建立過程中，以蘆丁為對(duì)照品，比較了直接測(cè)定法、三氯化鋁顯色法和硝酸鋁顯色法3 種總黃酮測(cè)定方法，發(fā)現(xiàn)直接測(cè)定法和三氯化鋁測(cè)定法的對(duì)照品溶液與供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)不一致，而硝酸鋁顯色法中蘆丁對(duì)照品溶液與供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)均為510 nm。因此，采用硝酸鋁顯色法，并考察了影響因素，對(duì)硝酸鋁濃度、氫氧化鈉濃度及用量、顯色條件等進(jìn)行了優(yōu)化。最后，對(duì)所建立的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果和加樣回收率均符合藥典要求。

3.3 最優(yōu)提取工藝確定

提取工藝優(yōu)化后的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)選的提取工藝合理。故最優(yōu)提取工藝確定為A2B2C2D2，即加10 倍量水，浸泡 30 min，煎煮 1.5 h，煎煮 2 次。