劉 潭，夏 駿，劉伯毅，方志成，李紅新

（湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

急性肝損傷以細(xì)胞壞死、炎癥和氧化損傷為特征［1］，過量產(chǎn)生促炎因子會(huì)誘發(fā)炎癥，并與肝損傷的發(fā)展、惡化、死亡率增加有關(guān)。硫代乙酰胺（TAA）是一種經(jīng)典的肝臟有毒化合物，可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)引起器官損傷，用于建立肝損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］。法尼酯衍生物X 受體（FXR）是一種高表達(dá)肝核膽汁酸受體，在膽固醇／膽汁酸代謝、葡萄糖／脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［3］。研究表明，F(xiàn)XR 可能是肝病的潛在治療靶標(biāo)，F(xiàn)XR 激動(dòng)劑可抑制膽汁酸引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，F(xiàn)XR 配體可能是肝炎性疾病的潛在治療手段［4－5］。FXR可調(diào)節(jié)AMP 活化蛋白激酶（AMPK）來保護(hù)肝損傷，在氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和線粒體功能障礙中起調(diào)節(jié)作用［6］。許多用于細(xì)胞保護(hù)的藥物可通過激活A(yù)MPK 抑制自由基，并誘導(dǎo)抗氧化酶產(chǎn)生［7］，激活 FXR ／AMPK 信號(hào)通路是肝損傷的治療靶點(diǎn)。薯蕷皂苷是一種具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功效的天然藥物，對(duì)四氯化碳引起的急性肝損傷具有保護(hù)作用［8］。本研究中探討了薯蕷皂苷對(duì)TAA 誘導(dǎo)的急性肝損傷模型大鼠的保護(hù)作用，以及FXR／AMPK 信號(hào)通路的作用機(jī)制，為薯蕷皂苷開發(fā)保肝藥物提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：AU5800 型全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）；HBS－1096B 型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BIO－RAD 型垂直電泳儀（美國BD 公司）；LYNX4000 型高速冷冰離心機(jī)（德國SorvallHeraeus 公司）；AL104 型電子天平（梅特勒＜上海＞儀器有限公司，精度為 0.1mg）；HR2838 型勻漿機(jī)（上海菲利普公司）。

試藥：薯蕷皂苷對(duì)照品（陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為19057－60－04，純度為98%）；水飛薊素（德國馬博士大藥房，批號(hào)為254952）；TAA（美國Sigma 公司，批號(hào)為 2020045－1－7）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（批號(hào)為080120），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（批號(hào)為080122），均購于中生北控生物科技有限公司；腫瘤壞死因子 －α（TNF －α）試劑盒 （ 批號(hào)為MM －0670R84），白細(xì)胞介素 6（IL －6）試劑盒（批號(hào)為MM －0670R22），白細(xì)胞介素 10（IL －10）試劑盒（批號(hào)為MM－0670R72），均購于欣博盛生物科技有限公司；谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)為 A004－1－3），超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)為A003－1－4），丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)為 A002－2－1），均購于南京建城生物工程有限公司；蛋白抽提試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)為175056）；FXR 抗體（批號(hào)為 SC －4176），AMPK 抗體（批號(hào)為 SC －5218），核因子 E2 相關(guān)因子 2（Nrf2）抗體（批號(hào)為 SC －5328），核轉(zhuǎn)錄因子 κB 抗體（NF－κB，批號(hào)為 SC －5329），β －actin抗體（批號(hào)為SC－5429），均購于美國Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記親和純化山羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G 二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為 115－58－264）；生理鹽水。

動(dòng)物：健康雄性SD 大鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK（桂）2019－0003，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為0015182。于溫度為（22±2）℃，相對(duì)濕度為 40% ～70%，噪音≤50 dB，晝夜循環(huán)（12 h ／12 h）的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)，1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 分組、造模及給藥

將60 只雄性大鼠均分為正常對(duì)照組（A 組），模型組（B 組），薯蕷皂苷低劑量組（C1組）、中劑量組（C2組）、高劑量組（C3組）和陽性對(duì)照組（D 組）。C1組、C2組、C3組大鼠分別灌胃薯蕷皂苷 25，50，100 mg ／kg［9］，D 組大鼠灌胃水飛薊素 200 mg ／kg［10］，A 組和 B 組大鼠灌胃生理鹽水每 100 g 體質(zhì)量 0.1 mL，每天 1 次，連續(xù) 7 d。末次灌胃 2 h 后，B 組、C1組、C2組、C3組、D 組大鼠均腹腔注射 TAA 100 mg ／ kg，A 組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。禁食不禁飲，24 h 后麻醉大鼠，心臟取血3 mL，以3 000 r／min 的速率離心15 min，分離血清；處死大鼠，分離肝臟，液氮保存，備用。

1.3 觀察指標(biāo)

血清中ALT 和AST 水平：采用 AU5800 型自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中ALT 和AST 的水平。

血清中 TNF－α，IL－6，IL－10 水平：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法。血清離心，取上清液，將 TNF－α，IL －6，IL －10 一抗稀釋至 10 μg／mL，加入 96 孔板中（每孔 0.1 mL），4 ℃過夜，洗滌 3 次，加血清 0.1 mL 于上述反應(yīng)孔中，37 ℃孵育1 h；加入新配置相應(yīng)的二抗0.1 mL，孵育 1 h，顯色 20 min，用 2 mol／L 硫酸 0.05 mL終止反應(yīng)，于450 nm 波長處測(cè)定各孔吸光度值。

肝組織中 GSH 與 SOD 活性和 MDA 含量：ELISA 法檢測(cè)。取肝組織，按 1 ∶10（m ∶V）加入生理鹽水，制成勻漿，加入磷酸鹽緩沖液 1 mL，12 000 r／min 離心 10 min，收集上清液，將相應(yīng)一抗稀釋至10 μg／mL，加入96 孔板中，每孔 0.1 mL，4 ℃ 過夜，洗滌 3 次，加肝組織勻漿0.1 mL 于上述反應(yīng)孔中，37 ℃孵育 1 h；加入新配置相應(yīng)的二抗 0.1 mL，孵育 1 h，顯色 20 min，用 2 mol／L 硫酸0.05 mL 終止反應(yīng)，于450 nm 波長處測(cè)定各孔吸光度。

肝組織中 FXR，AMPK，Nrf2，NF－κB 蛋白表達(dá)水平：蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)。取肝組織，用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，用研缽研碎，加入蛋白抽提試劑，冰浴2h后離心，取上清液，每孔30 μg，電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶在室溫下封膜 1h，將膜與 FXR（1 ∶200）、AMPK（1 ∶400）、Nrf2（1 ∶300）、NF －κB（1 ∶200）、β － actin（1 ∶1 000）進(jìn)行孵育，4 ℃ 過夜，將山羊抗鼠 IgG 二抗（1 ∶10 000）在室溫下孵育30 min。顯色，采集圖像，采用AlphaEaseFC 圖像分析軟件分析，以β－actin 作為內(nèi)對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血清 ALT 和 AST 水平

與 A 組比較，B 組、C1組、C2組、C3組、D 組大鼠血清中 ALT 和 AST 水平均顯著升高（P＜ 0.05）；與 B 組比較，C1組、C2組、C3組、D 組大鼠血清中 ALT 和 AST水平均顯著降低，且C1組、C2組、C3組呈劑量依賴性（P＜ 0.05）；D 組和 C3組各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表 1。

表1 薯蕷皂苷對(duì)TAA 致肝損傷模型大鼠血清中ALT 和AST水平的影響（，U ／L，n ＝ 10）Tab.1 Effect of diosgenin on serum ALT and AST levels in model rats with TAA －induced liver injury（，U ／L，n ＝ 10）

表1 薯蕷皂苷對(duì)TAA 致肝損傷模型大鼠血清中ALT 和AST水平的影響（，U ／L，n ＝ 10）Tab.1 Effect of diosgenin on serum ALT and AST levels in model rats with TAA －induced liver injury（，U ／L，n ＝ 10）

注：與 A 組比較，a P ＜ 0.05；與 B 組比較，b P ＜ 0.05；與 C1 組比較，c P ＜ 0.05；與 C2 組比較，d P ＜ 0.05。表 2 至表 4 同。Note：Compared with those in group A，a P ＜ 0.05；compared with those in group B，bP ＜ 0.05；compared with those in group C1，cP ＜ 0.05；compared with those in group C2，dP ＜ 0.05，as well as Tab.2 to Tab.4.

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量（mg／kg）25 50 100 200 ALT 18.26 ± 83.14 138.07 ± 21.43a 104.52 ± 9.31ab 89.21 ± 10.38abc 65.78 ± 7.13abcd 67.34 ± 8.24abcd AST 47.79 ± 6.30 273.56 ± 17.62a 216.51 ± 27.38ab 162.49 ± 8.92abc 82.37 ± 11.50abcd 79.10 ± 9.54abcd

2.2 血清 TNF －α，IL －6，IL －10 水平

與 A 組比較，B 組、C1組、C2組、C3組、D 組大鼠血清中 TNF －α 和 IL －6 水平均顯著升高，IL －10 水平均顯著降低（P＜0.05）；與 B 組比較，C1組、C2組、C3組、D 組大鼠血清中 TNF －α 和 IL－6 水平均顯著降低，IL－10 水平均顯著升高，且C1組、C2組、C3組呈劑量依賴性（P＜ 0.05）；D 組和 C3組大鼠各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表 2。

表2 薯蕷皂苷對(duì)TAA 致肝損傷模型大鼠血清中TNF－α，IL －6，IL －10 水平的影響（，pg ／mL，n ＝ 10）Tab.2 Effect of diosgenin on serum TNF－α，IL－6 and IL－10 levels in model rats with TAA－induced liver injury（，pg ／mL，n ＝ 10）

表2 薯蕷皂苷對(duì)TAA 致肝損傷模型大鼠血清中TNF－α，IL －6，IL －10 水平的影響（，pg ／mL，n ＝ 10）Tab.2 Effect of diosgenin on serum TNF－α，IL－6 and IL－10 levels in model rats with TAA－induced liver injury（，pg ／mL，n ＝ 10）

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量（mg／kg）25 50 100 200 TNF－α 475.76 ± 58.61 2 348.28 ±273.16a 1 958.34 ±267.39ab 1 658.29 ± 135.81abc 1 062.24 ±245.17abcd 1 043.25 ± 159.22abcd IL－6 328.14 ± 46.72 1 172.32 ± 104.20a 1 003.59 ± 89.61ab 837.62 ± 57.15abc 643.50 ± 67.64abcd 621.83 ± 74.69abcd IL－10 673.28 ± 79.21 242.62 ± 53.42a 341.28 ± 39.19ab 407.92 ± 67.34abc 573.16 ± 79.58abcd 590.45 ± 47.50abcd

2.3 肝組織 GSH 與 SOD 活性和 MDA 含量

與 A 組比較，B 組、C1組、C2組、C3組、D 組大鼠肝組織中MDA 含量均顯著升高，GSH 和SOD 活性均顯著降低（P＜ 0.05）；與 B 組比較，C1組、C2組、C3組、D 組大鼠肝組織中MDA 水平均顯著降低，GSH 和SOD 活性均顯著升高，且 C1組、C2組、C3組呈劑量依賴性（P＜0.05）；D 組和 C3組大鼠各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 薯蕷皂苷對(duì)TAA 致肝損傷模型大鼠肝組織中GSH 與SOD 活性和MDA 含量的影響（，n ＝ 10）Tab.3 Effect of diosgenin on GSH and SOD activities and MDA content in liver tissue of model rats with TAA－induced liver injury（，n ＝ 10）

表3 薯蕷皂苷對(duì)TAA 致肝損傷模型大鼠肝組織中GSH 與SOD 活性和MDA 含量的影響（，n ＝ 10）Tab.3 Effect of diosgenin on GSH and SOD activities and MDA content in liver tissue of model rats with TAA－induced liver injury（，n ＝ 10）

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量（mg／kg）25 50 100 200 GSH（μmol／mgprot）5.76 ±0.69 3.18 ± 0.41a 3.60 ±0.53ab 4.52 ±0.49abc 5.18 ± 0.61abcd 5.24 ±0.39abcd SOD（U ／mgprot）180.19 ±15.31 102.47 ± 5.48a 127.71 ±10.31ab 139.62 ±15.46abc 160.84 ± 12.73abcd 162.73 ±14.24abcd MDA（nmol／mgprot 3.28 ±0.41 5.69 ± 0.80a 4.68 ±0.34ab 4.22 ±0.58abc 3.84 ± 0.71abcd 3.71 ±0.43abcd

2.4 肝組織 FXR，AMPK，Nrf2，NF－κB 蛋白表達(dá)水平

與 A 組比較，B 組、C1組、C2組、C3組、D 組大鼠肝組織中FXR，AMPK，Nrf2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，NF －κB 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜ 0.05）；與 B 組比較，C1組、C2組、C3組、D 組大鼠肝組織中 FXR，AMPK，Nrf2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高，NF －κB 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，且C1組、C2組、C3組呈劑量依賴性（P＜ 0.05）；D 組和 C3組大鼠各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。詳見表 4 和圖 1。

圖1 薯蕷皂苷對(duì)TAA 致肝損傷模型大鼠肝組織中FXR，AMPK，Nrf2，NF －κB 蛋白表達(dá)水平的影響Fig.1 Effect of diosgenin on the expression levels of FXR，AMPK，Nrf2 and NF－κB protein in liver tissue of model rats with TAA－induced liver injury

表4 薯蕷皂苷對(duì)TAA 致肝損傷模型大鼠肝組織中FXR，AMPK，Nrf2，NF － κB 蛋白表達(dá)水平的影響（，n ＝10）Tab.4 Effect of diosgenin on the expression levels of FXR，AMPK，Nrf2 and NF－κB protein in liver tissue of model rats with TAA－induced liver injury（，n ＝ 10）

表4 薯蕷皂苷對(duì)TAA 致肝損傷模型大鼠肝組織中FXR，AMPK，Nrf2，NF － κB 蛋白表達(dá)水平的影響（，n ＝10）Tab.4 Effect of diosgenin on the expression levels of FXR，AMPK，Nrf2 and NF－κB protein in liver tissue of model rats with TAA－induced liver injury（，n ＝ 10）

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量（mg／kg）25 50 100 200 FXR 0.93 ±0.07 0.40 ±0.05a 0.51 ±0.07ab 0.59±0.05abc 0.82 ±0.06abcd 0.85 ±0.10abcd AMPK 0.82 ±0.04 0.19 ±0.04a 0.27 ±0.02ab 0.33±0.05abc 0.70 ±0.08abcd 0.72 ±0.06abcd Nrf2 1.05 ±0.13 0.37 ±0.05a 0.43 ±0.07abc 0.52 ±0.08abc 0.94 ±0.10abcd 0.97 ±0.07abcd NF－κB 0.35 ±0.06 0.82 ±0.04a 0.70 ±0.09abc 0.63 ±0.05abc 0.42 ±0.06abcd 0.41 ±0.09abcd

3 討論

急性肝損傷可由病毒感染、食品添加劑、藥物濫用、放射性損傷等引起，并產(chǎn)生親電子產(chǎn)物和自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死，促進(jìn)肝損傷進(jìn)展［11］。薯蕷皂苷是一種甾體皂苷，廣泛存在于薯蕷科、豆科、百合科等植物中，具有抗炎和抗氧化應(yīng)激活性，可降低對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝損傷模型大鼠血清中 ALT 和 AST 的水平，明顯改善肝組織病理損傷［12］。若肝臟受損，血液中的AST 和ALT 水平會(huì)升高。本研究結(jié)果顯示，薯蕷皂苷可顯著降低TAA 誘導(dǎo)的肝損傷模型大鼠血清中ALT 和AST 的水平，且其治療效果與臨床常用保肝藥物水飛薊素類似，提示薯蕷皂苷可能是治療急性肝損傷的有效藥物。此外，發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷可通過抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)來改善TAA 誘導(dǎo)的肝損傷。

TNF－α 是參與肝損傷的主要細(xì)胞因子，IL－6 可抑制肝細(xì)胞再生，抗炎細(xì)胞因子IL－10 水平降低可導(dǎo)致炎性反應(yīng)失衡，增加氧自由基生成，最終導(dǎo)致肝損傷［13］。氧化應(yīng)激是引起各種肝臟損傷的原因。TAA 可導(dǎo)致肝臟發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生自由基，增加MDA含量，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和凋亡。GSH 和SOD 的抗氧化防御系統(tǒng)可以保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化劑傷害，清除脂質(zhì)過氧化物和氧自由基，保護(hù)肝細(xì)胞免受活性氧損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，薯蕷皂苷可顯著降低血清中的TNF－α 和IL－6 水平，升高IL－10 水平，同時(shí)降低肝組織中MDA含量，提高了GSH 和SOD 活性。

FXR 是一種配體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟中呈高表達(dá)，可調(diào)節(jié)AMPK 的磷酸化水平，在氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)線粒體功能障礙中起調(diào)節(jié)作用［15］。許多用于保護(hù)細(xì)胞的藥物可通過激活A(yù)MPK 來抑制自由基，并誘導(dǎo)抗氧化酶。AMPK 激活可保護(hù)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷，并誘導(dǎo)Nrf2 的表達(dá)增強(qiáng)，這在調(diào)節(jié)抗氧化過程中起重要作用［16］。此外，AMPK 可以抑制 TNF －α 和 IL －6的產(chǎn)生，并抑制NF－κB 的激活。在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭中，通過降低 TNF－α，IL－1β，IL－6 水平激活 AMPK，抑制炎癥，減輕肝損傷［17］。同時(shí)，AMPK 不僅在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞小管極化中起關(guān)鍵作用，且對(duì)氧化應(yīng)激有抑制作用。Nrf2 是一種主轉(zhuǎn)錄因子，易位進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控抗氧化基因血紅素氧化酶 － 1、NADPH 氧化還原酶等抗氧化應(yīng)激［18］?；罨腘F －κB 增強(qiáng)了細(xì)胞因子如 TNF －α 和 IL －1β 的轉(zhuǎn)錄，增加了炎性介質(zhì)合成的持續(xù)時(shí)間［19］。此外，NF － κB 的激活可升高細(xì)胞間黏附因子1（ICAM－1）的表達(dá)水平，ICAM－1 是一種跨膜糖蛋白，在嗜中性粒細(xì)胞從血液運(yùn)輸?shù)窖仔苑磻?yīng)部位中起主要作用［20］。本研究結(jié)果顯示，薯蕷皂苷顯著增加了大鼠肝組織中FXR，AMPK，Nrf2 的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)降低了NF－κB 蛋白表達(dá)水平，抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。提示FXR／AMPK 信號(hào)通路可能是薯蕷皂苷對(duì)抗TAA 誘導(dǎo)的急性肝損傷的潛在作用機(jī)制。

綜上所述，薯蕷皂苷對(duì)TAA 誘導(dǎo)的急性肝損傷具有保護(hù)作用，可能通過激活FXR／AMPK 信號(hào)通路改善肝臟氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)發(fā)揮作用，為薯蕷皂苷作為一種治療急性肝損傷的新藥提供了理論依據(jù)。