陳 新 王 敏 傅茂潤 王貴芳 相 昆 劉慶忠 焦文曉 張美勇 許海峰

(1. 山東省果樹研究所/國家果樹種質(zhì)核桃板栗資源圃 泰安 271000； 2. 費(fèi)縣綠緣核桃專業(yè)合作社 臨沂 273400；3. 齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 濟(jì)南 250353)

核桃(Juglansregia)因其營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，被認(rèn)為是“21 世紀(jì)的超級(jí)食品”(李敏等， 2009； Maetal.， 2010)。我國核桃屬種質(zhì)資源豐富，種植范圍廣泛(馬慶國等， 2019)，但其病害也愈加嚴(yán)重，其中炭疽病是核桃生產(chǎn)中的災(zāi)難性病害，嚴(yán)重制約核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展(Zhuetal.， 2014)。炭疽病主要在6—7月開始發(fā)病，8—9月份最為嚴(yán)重，癥狀一般為青皮炭疽病斑近圓形、黑褐色，中央病區(qū)凹陷產(chǎn)生黑色小點(diǎn)(曲文文等， 2011)。大部分學(xué)者認(rèn)為核桃炭疽病主要由膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起(Wangetal.， 2020)，但也有學(xué)者在核桃中分離出暹羅炭疽菌(C.siamense)、果生刺盤胞菌(C.fructicola)和尖孢炭疽菌(C.acutatum)等(Wangetal.， 2017； Wangetal.， 2018； Lioetal.， 2018)。

植物酚類物質(zhì)是重要的次生代謝物，能夠抑制細(xì)菌、真菌等病原體的侵染(Oliveiraetal.， 2008； Limaetal.， 2019)。植物受炭疽菌侵染能夠觸發(fā)誘導(dǎo)抗性，產(chǎn)生各種酶、單寧、黃酮等物質(zhì)抵抗病原菌危害(汪愛娥， 2005)。Dicko等(2005)發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)能夠抑制炭疽菌的生長，此外，多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和過氧化物酶(peroxidase，POD)能夠氧化酚類物質(zhì)，促進(jìn)木質(zhì)素及縮合單寧等物質(zhì)的合成，抑制病原菌生長與擴(kuò)散(楊光道， 2009)，這表明酚類物質(zhì)在抵抗病原菌方面發(fā)揮重要作用。目前，核桃炭疽病防治主要以苯并咪唑類殺菌劑等化學(xué)藥劑為主(劉霞等， 2013)，長期單一使用此類藥劑，不僅導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生，還對(duì)環(huán)境造成危害。

核桃青皮中含有大量酚類物質(zhì)(陸俊等， 2014)，但在生產(chǎn)中多作為廢棄物扔掉，關(guān)于核桃青皮炭疽病相關(guān)酚類物質(zhì)分析及有效成分鑒定方面未見報(bào)道。代謝組學(xué)可尋找生物標(biāo)記物、藥物靶點(diǎn)、研究病害機(jī)制。本研究以核桃‘香玲’和‘泰勒’為試材，對(duì)其青皮體外接種膠孢炭疽菌，通過靶向代謝組學(xué)分析侵染后核桃青皮中酚類物質(zhì)含量及相關(guān)變化，篩選抗炭疽病有效成分，為探究炭疽病發(fā)生機(jī)制和后期開發(fā)炭疽病相關(guān)天然藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年9月下旬于山東省果樹研究所金牛山基地采摘‘香玲’和‘泰勒’2個(gè)核桃品種。膠孢炭疽菌菌株由山東省果樹研究所植保研究室范昆提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 接種環(huán)刮取適量膠孢炭疽菌菌絲，于15 mL離心管中(含適量無菌水及滅菌玻璃珠)，用渦旋振蕩器震蕩10 s，過濾制得1×106個(gè)·mL-1孢子懸浮液。

1.2.2 核桃膠孢炭疽菌接種 選取大小均勻、成熟度一致(八成熟)、無機(jī)械損傷、無病蟲害的核桃果實(shí)，用75%的酒精擦拭果實(shí)表面，除去果實(shí)表面病原菌，用滅菌的鋼釘在每個(gè)核桃赤道部位均勻刺3個(gè)傷口(長×寬×高=2 mm×1 mm×2 mm)，用移液槍吸取15 μL 1×106個(gè)·mL-1膠孢炭疽菌孢子懸浮液滴入傷口，待傷口處菌懸液被吸收后，將核桃果實(shí)移入塑料筐(長320 mm、寬240 mm、高100 mm)內(nèi)，用0.03 mm厚的聚乙烯保鮮袋封口，放置室溫(溫度25 ℃、濕度90%)培養(yǎng)、觀察，用C.g表示接種膠孢炭疽菌孢子懸浮液核桃果實(shí)，CK表示不加菌懸液的核桃果實(shí)，3次生物學(xué)重復(fù)。然后將膠孢炭疽菌侵染后的核桃青皮送歐易生物科技有限公司進(jìn)行130種酚類物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)品購自源葉生物和Sigma-Aldrich公司)利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS)分析。

1.2.3 UPLC-MS/MS分析 1)經(jīng)冷凍離心干燥機(jī)(Scientz-10N)凍干后樣品約50 mg，加入600 μL提取液[水∶甲醇(V∶V=1∶2，含琥珀酸-2,2,3,3-d4和Lyso PC17∶0, 50 ng·mL-1)],再加入400 μL氯仿。2)加入2顆鋼珠，研磨機(jī)(JXFSTPRP-24/32)60 Hz研磨2 min。3)冰水浴超聲提取20 min，離心10 min(4 ℃，13 000 r·min-1)，取上清500 μL裝入EP管中。4)向殘?jiān)欣^續(xù)加入400 μL，渦旋1 min，超聲提取20 min。5)離心10 min(4 ℃，13 000 r·min-1)，取300 μL上清，跟之前的500 μL上清合并，共計(jì)800 μL。6)取200 μL上清揮干，然后用200 μL水∶甲醇(V∶V=18∶7，含內(nèi)標(biāo)L-2-氯苯丙氨酸，10 ng·mL-1)復(fù)溶，渦旋30 s，超聲2 min。7)離心5 min(4 ℃，13 000 r·min-1)，用注射器吸取200 μL的上清液，使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到棕色LC進(jìn)樣小瓶，-80 ℃下保存，直到進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。質(zhì)控樣本(QC)由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個(gè)QC體積與樣本相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用 The Human Metabolome Database(HMDB)和Lipidmaps(v2.3)以及 METLIN 數(shù)據(jù)庫對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析，利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)檢測(MRM)模式獲得質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)，對(duì)色譜峰進(jìn)行峰面積積分，將代謝物的積分峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計(jì)算，最終得到實(shí)際樣本中的絕對(duì)含量數(shù)據(jù)。利用 Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行后期編輯(作圖，標(biāo)準(zhǔn)差分析)，用 DPS 7.05軟件(http： ∥www.chinadps.net)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘香玲’和‘泰勒’體外膠孢炭疽菌侵染分析

由圖1可知，在0～6天，未接種膠孢炭疽菌的‘香玲’青皮無明顯變化，而接種膠孢炭疽菌的‘香玲’青皮病斑在第6天明顯變大； ‘泰勒’青皮未接種和接種膠孢炭疽菌后，接種部位在0～6天均無明顯變化，表明‘泰勒’青皮具有更高的炭疽病抗性，可能含有抗膠孢炭疽菌有效生物成分。

圖1 ‘香玲’和‘泰勒’青皮體外膠孢炭疽菌侵染

圖2 酚類含量較高5類物質(zhì)

圖3 酚類含量較低4類物質(zhì)

2.2 ‘香玲’和‘泰勒’青皮酚類物質(zhì)鑒定

根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)將酚類物質(zhì)分為原花青素/花青素、苯甲酸及其衍生物、兒茶素及其衍生物、黃酮醇、苯丙素類、黃烷酮/二氫查爾酮、異黃酮/黃酮、萜類、香豆素及其衍生物共9大類。由圖2、3可知， ‘香玲’和‘泰勒’青皮酚類物質(zhì)總量基本一致，分別為610 817.32和608 953.55 ng·g-1，主要以原花青素/花青素、苯甲酸及其衍生物、兒茶素及其衍生物、黃酮醇、苯丙素類這5大類為主，其中‘香玲’青皮以苯甲酸及其衍生物最多，占60%以上，而‘泰勒’青皮以黃酮醇最多，占比接近30%； 9大類物質(zhì)中，‘香玲’青皮只有苯甲酸類高于‘泰勒’，其余均低于‘泰勒’。

‘泰勒’青皮原花青素/花青素主要以氯化飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、原花青素B1/2/3為主，而‘香玲’青皮中絕大部分為氯化飛燕草素-3-O-葡萄糖苷(圖4A)； 在苯甲酸及其衍生物和黃酮醇2類物質(zhì)中，‘泰勒’和‘香玲’青皮主要組成成分一致，但比例各不相同(圖4B、C)； 此外，‘泰勒’和‘香玲’青皮中隱綠原酸含量均占苯丙素類物質(zhì)的80%以上(圖4D)。

圖4 酚類物質(zhì)主要成分分析

2.3 膠孢炭疽菌侵染后‘香玲’和‘泰勒’青皮間差異代謝物分析

侵染6天后‘香玲’和‘泰勒’青皮病斑存在明顯差異，對(duì)兩者間差異代謝物分析(表1)可知，與‘香玲’相比，‘泰勒’青皮中上調(diào)差異代謝物52個(gè)，其中表兒茶素沒食子酸酯、對(duì)香豆酸、原花青素B1/2/3、櫻花亭、異櫻花亭、根皮苷等物質(zhì)差異倍數(shù)均在20倍以上，表明這些物質(zhì)可能與‘泰勒’青皮具有更高的炭疽病抗性有關(guān)； 下調(diào)差異代謝物8個(gè)，即沒食子酸甲酯、丁香酸、阿魏酸、鞣花酸等8種物質(zhì)在‘香玲’中具有較高的含量； 楊梅素、原花青素A2等5種物質(zhì)僅在‘泰勒’中檢測到，而洋薊素和毛蕊異黃酮僅在‘香玲’中檢測到，這體現(xiàn)了品種間特異性。

續(xù)表1 Continued

2.4 膠孢炭疽菌侵染后‘香玲’和‘泰勒’青皮出現(xiàn)明顯變化的差異代謝物

膠孢炭疽菌侵染第4天，‘香玲’和‘泰勒’青皮病斑與之前一致，但到了第6天，‘香玲’青皮病斑明顯增大，‘泰勒’仍無明顯變化，說明炭疽菌侵染第4～6天，‘香玲’和‘泰勒’青皮中差異代謝物變化最為關(guān)鍵。如圖5所示，‘泰勒’青皮咖啡酸和沒食子酸顯著上調(diào)表達(dá)，柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷含量基本不變； 而‘香玲’青皮咖啡酸、沒食子酸、柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷6種物質(zhì)均顯著下調(diào)表達(dá)，尤其以沒食子酸下調(diào)幅度最大，降至原來的14.36%。以上結(jié)果表明，‘泰勒’青皮病斑基本不變可能與咖啡酸和沒食子酸顯著上調(diào)表達(dá)有關(guān)，而‘香玲’青皮病斑明顯增大，可能與咖啡酸、沒食子酸、柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷顯著下調(diào)有關(guān)。

圖5 膠孢炭疽菌侵染第4～6天‘香玲’和‘泰勒’青皮出現(xiàn)明顯變化的差異代謝物

3 討論

3.1 核桃青皮炭疽病相關(guān)酚類物質(zhì)鑒定

核桃含有大量的不飽和脂肪酸(余啟明等， 2020)，是極具發(fā)展?jié)摿Φ哪颈居土献魑?。目前，炭疽病的發(fā)生且缺乏有效的防控技術(shù)是影響我國核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。植物酚類物質(zhì)是重要的次生代謝物，對(duì)細(xì)菌、真菌、酵母菌及病毒等具有明顯的抑制作用(姚瑞祺， 2011)。核桃青皮中含有大量的酚類物質(zhì)，萬政敏等(2007)利用HPLC鑒定出6種酚酸和3種黃酮，并分析其相對(duì)含量； Cosmulescu等(2010)在5種不同核桃青皮中鑒定出阿魏酸、香草酸、香豆酸、丁香酸及楊梅酮5種酚類物質(zhì)； 鄭渝川等(2018)進(jìn)一步分析了核桃青皮中多酚的種類及抗菌活性。本研究中，‘泰勒’和‘香玲’青皮對(duì)膠孢炭疽菌抗性存在明顯差異(圖1)； 通過代謝組學(xué)分析其青皮中酚類物質(zhì)與炭疽病關(guān)聯(lián)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘泰勒’和‘香玲’青皮中酚類總量基本一致，主要包括9大類物質(zhì)，但‘香玲’中只有苯甲酸類含量最高，占60%以上，主要以沒食子酸、丁香酸、鞣花酸和香草酸等為主，其余均低于‘泰勒’(圖2，3，4)，表明‘泰勒’青皮中高含量的原花青素/花青素、黃酮醇、苯丙素類物質(zhì)與炭疽病抗性相關(guān)； 黃酮醇類在‘泰勒’中含量最多，接近30%(圖2，3)，主要以金絲桃苷、槲皮苷、扁蓄苷、楊梅苷和楊梅素-3-O-半乳糖苷為主(圖4)，其中金絲桃苷和楊梅素-3-O-半乳糖苷均首次在核桃青皮中報(bào)道； 本試驗(yàn)還鑒定到氯化飛燕草素-3-O-葡萄糖苷為‘香玲’和‘泰勒’青皮中主要的花青素物質(zhì)(圖4)。此外，在‘香玲’和‘泰勒’青皮中，仍有許多微量抗炭疽菌酚類物質(zhì)未被檢測到，如喬松素、櫻花亭、大波斯菊苷、瑞香素、紫云英苷、桑色素、紫蘇醇等。目前，核桃青皮在生產(chǎn)中多當(dāng)作廢棄物丟掉，造成嚴(yán)重的酚類化感作用，因此，充分利用核桃青皮天然酚類物質(zhì)資源，不僅能防止土壤破壞，還對(duì)核桃炭疽病的防治研究工作具有重要意義。

3.2 核桃青皮抗炭疽病有效成分篩選

植物提取物中富含單寧、黃酮、酚酸等酚類物質(zhì)可作為潛在抗菌藥物的有效成分(Limaetal.， 2019)。楊光道等(2007； 2009)研究表明，酚類物質(zhì)花青素、對(duì)羥基苯甲酸和鄰苯二酚的含量與油茶炭疽病指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，在油茶炭疽病中發(fā)揮作用； 曾祥國等(2016)發(fā)現(xiàn)草莓(Fragaria×ananassa)中總酚、綠原酸、阿魏酸是‘晶玉’品種具有較強(qiáng)抗炭疽病能力相關(guān)的生理因子； Roy等(2018)通過分析草莓中酚酸和類黃酮對(duì)炭疽菌的影響，發(fā)現(xiàn)反式肉桂酸、阿魏酸和對(duì)香豆酸能抑制炭疽菌的生長，其中反式肉桂酸抑制作用最強(qiáng)。在本研究發(fā)現(xiàn)‘香玲’青皮病斑在膠孢炭疽菌侵染第4天無明顯變化，而第6天明顯增大(圖1)，說明膠孢炭疽菌侵染第4～6天是關(guān)鍵時(shí)期； 分析膠孢炭疽菌侵染6天后‘香玲’和‘泰勒’青皮間差異代謝物，發(fā)現(xiàn)表兒茶素沒食子酸酯、對(duì)香豆酸、原花青素B1/2/3、櫻花亭、異櫻花亭、根皮苷等物質(zhì)差異倍數(shù)均在20倍以上，結(jié)合其在青皮內(nèi)絕對(duì)定量結(jié)果(表1)，僅原花青素B1/2/3具有較高含量。 Mikulic-Petkovsek等(2013)研究表明，原花青素與草莓黑斑病相關(guān)，因此，結(jié)合上述結(jié)果，推測‘泰勒’青皮具有較高的炭疽病抗性可能與較高含量的原花青素B1/2/3有關(guān)。進(jìn)一步分析膠孢炭疽菌侵染第4～6天青皮出現(xiàn)明顯變化的差異代謝物，本研究發(fā)現(xiàn)‘泰勒’和‘香玲’青皮病斑差異與咖啡酸、沒食子酸、柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷物質(zhì)含量變化有關(guān)(圖5)，表明咖啡酸、沒食子酸、柚皮素等6種物質(zhì)在核桃青皮炭疽病中也發(fā)揮重要作用， 其中，趙梅(2013)研究表明，梨果實(shí)中咖啡酸對(duì)炭疽菌具有一定抗性，其余炭疽病相關(guān)酚類物質(zhì)均首次鑒定。目前，核桃炭疽病防治主要以化學(xué)藥劑為主，長期使用不僅導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生，對(duì)環(huán)境還造成危害； ，柳鳳等(2011)和米嘉琦等(2020)對(duì)芒果(Mangiferaindica)肉桂類多酚研究，開發(fā)了抑制炭疽病有效物質(zhì)，為炭疽病防治提出新思路。本研究通過代謝組學(xué)篩選到原花青素B1/2/3、咖啡酸、沒食子酸、柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷等潛在核桃青皮抗炭疽病有效成分，為后期開發(fā)炭疽病相關(guān)天然藥物提供了酚類物質(zhì)資源。

4 結(jié)論

鑒定核桃抗炭疽病品種‘泰勒’和感病品種‘香玲’酚類物質(zhì)，代謝物差異分析膠孢炭疽菌侵染后物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化，篩選到原花青素B1/2/3、咖啡酸、柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷和沒食子酸等潛在抗炭疽病有效成分，為后期開發(fā)核桃炭疽病相關(guān)天然抗性藥物，探究核桃炭疽病發(fā)生機(jī)制提供參考。