田 迪，陳 銳，樸永革，付 祺，李 鋒，李河霖，李寶志，桂明英

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院，昆明 650201；2吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，長(zhǎng)春 130031；3云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，昆明 650201

緬梔花(PlumeriarubraL.var.actifoliaBailey)，因其外形極似蛋白包裹蛋黃而又名雞蛋花，屬竹夾科[1]。緬梔花原產(chǎn)于南美洲，在云南較為常見，云南緬梔花具有清熱解毒、利濕、止咳的功效，并且可用來(lái)治療傳染性肝炎、支氣管炎、肺結(jié)核等疾病。環(huán)烯醚萜類及苷類化合物是緬梔花主要的功能性成分，由于其具有很強(qiáng)的抗真菌和抗腫瘤活性作用而受到廣泛關(guān)注[2-4]。糖尿病已成為當(dāng)前威脅全球人類健康最重要的慢性非傳染性疾病之一，并在世界范圍內(nèi)呈流行趨勢(shì)[5]。最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)糖尿病患者人數(shù)達(dá)到1.139億[6]，并產(chǎn)生巨大的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。2型糖尿病病理生理的主要特征是胰島素抵抗和胰島素分泌減少[7]，通常胰島素信號(hào)通路的減弱是發(fā)生胰島素抵抗的原因[8,9]，PI3K/Akt信號(hào)通路是胰島素作用的最主要信號(hào)通路。Akt蛋白是PI3K信號(hào)通路下游的重要靶蛋白，Akt蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一種，各種研究表明Akt在細(xì)胞的糖代謝、細(xì)胞增殖、凋亡方面占據(jù)重要作用[10]。目前對(duì)緬梔花的研究主要在其揮發(fā)油化學(xué)成分檢測(cè)及其藥理研究，而緬梔花提取物對(duì)骨骼肌細(xì)胞Akt調(diào)控作用的相關(guān)研究鮮有報(bào)道[11-14]。有研究表明緬梔花中存在抗糖尿病類異戊二烯和長(zhǎng)鏈δ-內(nèi)酯對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制的活性，莖皮提取物黃酮苷可明顯降低四氧嘧啶所致的高血糖大鼠中血清甘油三酯含量，說(shuō)明緬梔花具有一定的降糖降脂潛力[15,16]。

本研究以緬梔花為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)制備緬梔花水提物，探索其是否可以正向調(diào)節(jié)某一個(gè)關(guān)鍵因子如PI3K、Akt/PKB、AS160的磷酸化水平，使其處于活性狀態(tài)，進(jìn)而強(qiáng)化GLUT4的轉(zhuǎn)移，以期達(dá)到降血糖的效果。旨在為云南地區(qū)緬梔花資源促進(jìn)骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)提供理論依據(jù)和挖掘其綜合藥用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 緬梔花

實(shí)驗(yàn)用干燥緬梔花材料產(chǎn)自云南省昆明市。

1.1.2 骨骼肌細(xì)胞系

C2C12骨骼肌細(xì)胞購(gòu)于ATCC-American type culture collection。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

胰島素(江蘇萬(wàn)邦，7353789)；青鏈霉素混合液(Solarbio)；胰蛋白消化酶(碧云天)；DMSO(Solarbio，67-68-5)；磷酸鹽緩沖液(Solarbio)；DMEM/HIGHGLUCOSE(Hyclone)；抗體(Cell Signaling Technology)；2-NBDG葡萄糖攝取試劑盒(abcam，ab235976)；甲醇(天津致遠(yuǎn)，67-56-1)；Meilunbio?飛克特超敏ECL發(fā)光液(美侖生物，MA0186)；石油醚(阿拉丁)；乙腈(美國(guó)，TEDIA，色譜純)；三氟乙酸(德國(guó)，MERCK，色譜純)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 緬梔花提取物的制備

打碎：使用破壁粉碎機(jī)將干燥緬梔花進(jìn)行破碎化處理；浸出：按料液比1∶20加入熱水，溫度保持在75±10 ℃，浸出0.5 h后，使用三層醫(yī)用紗布進(jìn)行過(guò)濾，濾渣保留，按照1∶20、1∶20、1∶10的料液比反復(fù)熱水浸出3次，之后將全部濾液合并后做離心處理，取上清液；濃縮：減壓濃縮至原液體積的1/8～1/10后，進(jìn)入-20 ℃冰箱做冷凍處理；干燥：利用真空冷凍干燥機(jī)對(duì)冷凍濃縮液進(jìn)行冷凍干燥處理，得到干燥緬梔花水提取物，含水率低于3 %，產(chǎn)率為10～15 %。

1.2.2 使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)對(duì)緬梔花提取物進(jìn)行成分測(cè)定

儀器：Agilent Technologies-7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜儀；色譜柱：Agilent1909 1S-433UI HP(30 m×0.25mm×0.25 μm)石英毛細(xì)管柱；載氣為He，流速為1.2 mL/min，進(jìn)樣量5 uL，分流比10∶1；程序升溫：起始溫度為60 ℃，然后以6 ℃/min升到280 ℃，保持6 min，再以10 ℃/min升至300 ℃，保持2 min，運(yùn)行時(shí)間為46.667 min；EI電離源，電離能為70 eV，離子源溫度230 ℃；掃描質(zhì)量范圍m/z：35～550 amu。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)條件

在細(xì)胞培養(yǎng)板中使用含10%牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)高糖配方培養(yǎng)液對(duì)接種后的C2C12細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，至70～80 %細(xì)胞出現(xiàn)匯合時(shí)換培養(yǎng)液，添加新的培養(yǎng)液前需使用PBS進(jìn)行1～2次清洗，之后再新加入含有2 %馬血清的DMEM培養(yǎng)液使細(xì)胞分化，體外分化培養(yǎng)C2C12細(xì)胞4～5天后，進(jìn)行饑餓處理后加藥，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(0 mg/mL)和不同濃度緬梔花提取物組，濃度分別為1、2、4、8 mg/mL。

1.2.4 免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)

在10 %的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠上配制8 %的凝膠，添加經(jīng)過(guò)蛋白定量后的樣本，恒壓電泳1.5 h后，將蛋白轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，5%BSA封閉1 h。1∶1 000稀釋一抗抗體，封閉后加入一抗抗體4 ℃搖床8 h，PBST緩沖液洗膜3～4次，每次10 min。之后在封閉液中加入二抗抗體(1∶10 000)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠抗體，室溫?fù)u床1.5 h。再用PBST洗膜3次，每次10 min。經(jīng)過(guò)化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在曝光機(jī)中進(jìn)行曝光，掃描或拍照后，用圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)分子量條帶進(jìn)行數(shù)字化分析處理。

1.2.5 葡萄糖攝取測(cè)定(2-NBDG法)

分化后的C2C12細(xì)胞設(shè)置為空白對(duì)照組(control)、緬梔花提取物組(PE)和胰島素陽(yáng)性對(duì)照組(insulin)，使用熒光葡萄糖類似物2-NBDG葡萄糖攝取試劑盒，分別加入2-NBDG低糖培養(yǎng)基后，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在485 nm激發(fā)波長(zhǎng)和538 nm發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，對(duì)照組2-NBDG攝取率為100%，以2-NBDG為探針計(jì)算不同條件下細(xì)胞葡萄糖攝取率。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA進(jìn)行顯著性分析，P<0.05視為有顯著性差異，P<0.01視為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 緬梔花提取物的主要成分

經(jīng)GC-MS檢測(cè)所得的質(zhì)譜信息，緬梔花提取物實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果見圖1，應(yīng)用譜庫(kù)檢索并參考有關(guān)文獻(xiàn)[17]，鑒定了緬梔花提取物中含有12個(gè)主要成分。

圖1 緬梔花提取物GC-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of GC-MS experiment on Plumeria water extract

有研究表明，植物酚酸類、萜類物質(zhì)具有明顯的降糖作用[18,19]。由表1可知，對(duì)緬梔花揮發(fā)油中主要化學(xué)成分的分離鑒定表明主要成分為31.16%的十六酸(n-hexadecanoic acid)，肉豆蔻酸(tetradecanoic acid)含量為15.02%，9，12-十八碳二烯酸(9,12-octadecadienoic acid)含量為11.01%，還包含其他脂肪酸，酚類，酯類，烷烴類，萜類等成分，說(shuō)明雞蛋花揮發(fā)油中主要成分為脂肪酸和萜類化合物，其中脂肪酸為十六酸、肉豆蔻酸等，占揮發(fā)油總量的46%，萜類化合物主要為1，6，10-十二碳三烯-3-醇、2，6，10-十二碳三烯-1-醇和雙十六烷硫醇等，這些成分可能與緬梔花發(fā)揮功能性作用相關(guān)。從總的結(jié)果來(lái)分析，主要成分與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[20]，但在相同成分含量上卻存在差異，這可能與雞蛋花產(chǎn)地的土壤性質(zhì)、地理環(huán)境、采摘時(shí)間以及測(cè)試條件有一定關(guān)系。

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 緬梔花提取物對(duì)C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

由圖2知，不同緬梔花提取物(PE)濃度培養(yǎng)C2C12細(xì)胞4 h后，與對(duì)照組相比較，不同濃度PE對(duì)C2C12細(xì)胞增殖情況無(wú)明顯影響，未發(fā)現(xiàn)促細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)正常。

圖2 緬梔花提取物濃度對(duì)C2C12細(xì)胞存活率的影響Fig.2 The effect of PE concentration on C2C12 cell vitality

2.3 緬梔花提取物對(duì)C2C12細(xì)胞中葡萄糖攝取量和對(duì)蛋白激酶B(Akt)的調(diào)控作用

為了測(cè)定不同濃度PE對(duì)C2C12細(xì)胞中Akt的調(diào)控作用，使用PE濃度梯度為1、2、4、8 mg/mL處理之后，以Western blot法檢測(cè)Akt磷酸化水平。結(jié)果顯示，當(dāng)PE濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)Akt磷酸化的促進(jìn)效果不明顯，而PE濃度為2 mg/mL時(shí)，對(duì)C2C12細(xì)胞Akt磷酸化促進(jìn)效果顯著(P<0.05)，當(dāng)PE濃度為2 mg/mL時(shí)，對(duì)C2C12細(xì)胞Akt磷酸化有極顯著促進(jìn)效果，當(dāng)PE濃度為4 mg/mL時(shí)，達(dá)到最大促進(jìn)效果(P<0.01)，而在PE濃度增加到8 mg/mL時(shí)效果稍有減緩，因此我們選擇將4 mg/mL濃度作為PE正向調(diào)控C2C12細(xì)胞Akt磷酸化水平的最適劑量(見圖3B)。

在確定最適劑量后，為了確定PE最適處理時(shí)間，確定的最適劑量為4 mg/mL濃度的基礎(chǔ)上，選取15、30、45、60 min四個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行處理，同樣以Western blot法檢測(cè)C2C12細(xì)胞中Akt的磷酸化水平。結(jié)果表明，當(dāng)處理時(shí)間為15 min時(shí)，對(duì)Akt磷酸化有一定的促進(jìn)效果(P<0.05)，處理時(shí)間為30 min時(shí)，對(duì)C2C12細(xì)胞Akt磷酸化達(dá)到最大促進(jìn)效果(P<0.01)，而在處理時(shí)間為45 min和60 min時(shí)，Akt磷酸化的促進(jìn)效果基本持平，并略有減緩，因此選擇將30 min作為PE正向調(diào)控C2C12細(xì)胞Akt磷酸化水平的最適處理時(shí)間(見圖3C)。

圖3 確定PE對(duì)C2C12細(xì)胞中Akt磷酸化正向調(diào)控作用的最適劑量和時(shí)間Fig.3 Determine the optimal dose and time of PE on the positive regulation of p-Akt in C2C12 cells注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。下同。Note：Compared with control group,*P<0.5, **P<0.01,***P<0.001.The same below.

有研究表面表明，Akt是胰島素刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子[21]，能增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，同時(shí)腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)也是與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖脂代謝密切相關(guān)的酶。

在諸多前期研究中，在此胰島素(insulin，1 μL/mL,30 min)作用實(shí)驗(yàn)條件下[22]，骨骼肌的Akt磷酸化水平顯著增高，因此可以作為可靠的陽(yáng)性對(duì)照使用，所以本文選取胰島素(insulin，1 μL/mL,30 min)作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)PE(4 mg/mL,30 min)處理C2C12細(xì)胞，與對(duì)照組相比，C2C12細(xì)胞再經(jīng)過(guò)PE處理后Akt磷酸化水平顯著增加，同在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路下游的Akt底物(A 160 kDa substrate of the Akt Ser/Thr kinase，AS160)的磷酸化水平也明顯增加(見圖4C、4D)。為了考察PE的降糖活性，通過(guò)2-NBDG法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量，如圖4A示，與對(duì)照組相比，C2C12細(xì)胞再經(jīng)過(guò)PE(4 mg/mL、30 min)處理后對(duì)葡萄糖攝取量顯著提高，葡萄糖攝取量提高了1.65倍。

圖4 PE促進(jìn)C2C12細(xì)胞的葡萄糖吸收和刺激Akt、AS160的磷酸化水平Fig.4 PE promotes glucose uptake in C2C12 cells and stimulates the phosphorylation of Akt and AS160

我們又選取和咖啡因(caffeine，1 mg/mL,30 min)作為陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證了PE(4 mg/mL,30 min)對(duì)AMPK和ACC的磷酸化水平的影響(見圖5)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)PE對(duì)AMPK和ACC磷酸化水平?jīng)]有影響。

圖5 PE對(duì)C2C12細(xì)胞P-AMPK和P-ACC的影響Fig.5 The effect of PE on P-AMPK and P-ACC in C2C12 cells

2.4 緬梔花提取物與胰島素的協(xié)同作用

胰島素注射是當(dāng)前糖尿病治療的主要方法，而通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PE與胰島素都具有正向調(diào)控Akt磷酸水平的作用后，下一步，我們對(duì)PE是否有可能與胰島素發(fā)生協(xié)同作用進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)PE(4 mg/mL,30 min)和胰島素(insulin，1 μL/mL,30 min)單獨(dú)處理后C2C12細(xì)胞中Akt磷酸化水平與對(duì)照組相比有顯著上升(P<0.01)。PE和胰島素協(xié)同作用組(PE，4 mg/mL,30 min+insulin，1 μL/mL,30 min)比PE和胰島素單獨(dú)處理組又有了顯著上升(P<0.01)，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，PE和胰島素都能夠有效正向調(diào)控C2C12細(xì)胞Akt的磷酸化水平，同時(shí)PE和胰島素還表現(xiàn)出了良好的協(xié)同作用效果(見圖6A、6B)。

圖6 PE與胰島素的協(xié)同作用Fig.6 The synergistic effect of PE and insulin

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)GC-MS檢測(cè)了緬梔花提取物，對(duì)緬梔花揮發(fā)油中主要化學(xué)成分的分離鑒定，檢測(cè)出脂肪酸、酯類、烷烴類、萜類等12種主要成分，其中含量較多為十六酸、肉豆蔻酸等。目前已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，酚類、萜類、烷烴類物質(zhì)具有明顯的降糖作用，緬梔花中含有這些成分，可能是這些成分對(duì)于降糖產(chǎn)生了一定效果。對(duì)緬梔花揮發(fā)油的成分和組成的研究結(jié)果進(jìn)行報(bào)道，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在研究中選取的PE濃度范圍，未對(duì)C2C12細(xì)胞的生長(zhǎng)和狀態(tài)帶來(lái)毒副影響，在各組細(xì)胞數(shù)量基本一致的情況下，可以排除細(xì)胞狀態(tài)異常帶來(lái)的極端影響，所取得的數(shù)據(jù)可信度較高。C2C12細(xì)胞中的Akt在糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，PI3K/Akt/GlUT4途徑被公認(rèn)為是體內(nèi)胰島素介導(dǎo)糖攝取的主要信號(hào)通路之一[23]。AMPK作為細(xì)胞內(nèi)能量水平的感受器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量水平降低時(shí)，AMPK通過(guò)磷酸化機(jī)制被激活，促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子向細(xì)胞膜易位，通過(guò)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖來(lái)維持細(xì)胞能量水平，ACC為AMPK的下游因子。因此，我們也對(duì)與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路相關(guān)的AMPK以及ACC等關(guān)鍵酶是否也受到PE的影響進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證，結(jié)果PE處理對(duì)C2C12細(xì)胞中的AMPK和ACC沒(méi)有影響。

PE對(duì)C2C12細(xì)胞中的Akt具有正向調(diào)控作用，與Akt分子有緊密調(diào)控關(guān)系，這與胰島素依賴性糖轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路的機(jī)動(dòng)機(jī)制相似，因此，我們對(duì)PE與胰島素的協(xié)同作用也進(jìn)行了探究。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PE與胰島素聯(lián)用后，對(duì)Akt的刺激作用均強(qiáng)于PE或胰島素單獨(dú)作用，顯示了較好協(xié)同效應(yīng)，從正向調(diào)控C2C12細(xì)胞中Akt活性的角度，明確了PE具有與胰島素類似或者提升胰島素敏感性的作用，提供了緬梔花在醫(yī)藥健康領(lǐng)域應(yīng)用基礎(chǔ)研究依據(jù)。

目前，對(duì)緬梔花化學(xué)成分、功效、加工方法的方面的研究還比較有限，本研究通過(guò)緬梔花水提物的成分分析，鑒定分離緬梔花的主要成分及含量，并發(fā)現(xiàn)了緬梔花提取物對(duì)C2C12細(xì)胞Akt磷酸化水平的正向調(diào)控作用，明確了緬梔花水提物與胰島素的協(xié)同作用，為緬梔花在醫(yī)藥和保健品方面的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)和新的開發(fā)思路。