付信珍，丁振，李志，謝則平，張淑敏，寇立娟

濱州醫(yī)學院藥學院，山東 煙臺 264003

人參皂苷是一種四環(huán)三萜類化合物，被視為是人參中的藥理活性成分［1］；按其結構可分為原人參二醇型、原人參三醇型和齊墩果酸型，其中，20（S）-原人參二醇［20（S）-PPD］是二醇型人參皂苷在動物體內經(jīng)胃腸道微生物菌群代謝產生的活性最強的有效藥物成分［2］。近年來，由于其在抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護神經(jīng)系統(tǒng)與激活免疫系統(tǒng)方面發(fā)揮重要的藥理作用，得到了研究學者的廣泛關注［3-4］。創(chuàng)新藥物研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷類藥物的口服生物利用度低，在血漿中濃度較低，因此建立高靈敏度、高準確度的檢測方法非常關鍵［5-6］。

目前，血漿中20（S）-PPD 提取處理常采用液液萃取法或固相萃取法［7-8］。這兩種方法雖然能凈化樣品基質，但實驗需要的有機溶劑用量大，且過程中涉及旋蒸和氮吹步驟，操作煩瑣，容易造成目標物質的損失，往往需要大量的方法學驗證實驗。蛋白沉淀法可最大程度保留代謝物質，操作簡單快速，對環(huán)境友好，已經(jīng)廣泛應用于藥物代謝研究［9-10］，如吳悅等［9］采用乙腈蛋白沉淀法提取血漿中阿帕替尼，結合液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）實現(xiàn)了其藥動學研究。然而，將蛋白沉淀法應用于血漿樣品中20（S）-PPD 的分析鮮見有報道。

20（S）-PPD 的分析方法主要包括液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質譜法［6,8］。與高效液相色譜法相比，液相色譜-串聯(lián)質譜法由于分析速度快、選擇性與專屬性強、靈敏度高等優(yōu)勢，廣泛應用于復雜樣品基質中人參皂苷類化合物的分析。本研究采用蛋白沉淀法處理血漿樣品，UPLC-MS/MS 法測定大鼠血漿中20（S）-PPD，并將此方法應用于大鼠灌胃20（S）-PPD 的藥動學研究，為其創(chuàng)新藥物研究提供技術支持。

1 材料

1.1 主要儀器

ACQUITY 超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；QTRAP 6500+三重四極桿質譜儀（美國SCIEX 公司）；CHORUS 1 COMPLETE 型超純水儀（英國ELGA 公司）；MS105DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SH8200H 型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；FRESCO 21 型高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）；TARGIN VX-Ⅱ型渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

1.2 藥物及主要試劑

原人參二醇（純度≥96%，中國食品藥品檢定研究院）；齊墩果酸（分析對照品，麥克林試劑公司）；甲醇和乙腈（色譜純，德國Merk 公司)。

1.3 實驗動物

SPF 級SD 大鼠6 只，雄性，體質量范圍180 g～220 g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號SCXK（魯）20190003。飼養(yǎng)環(huán)境室溫20～26 ℃，日溫差≤4 ℃，相對濕度40%～70%，明暗交替時間為12/12 h。

2 方法

2.1 標準溶液的配制

準確稱取20（S）-PPD 和齊墩果酸標準物質，分別用色譜純甲醇溶解并定容至10 mL，配制成濃度為1 mg/mL 的標準儲備液。使用時以甲醇逐級稀釋成系列濃度的標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 血漿樣品處理方法

取灌胃給藥后大鼠血漿45 μL 于1.5 mL 尖底聚丙烯離心管內，然后加入濃度為2 μg/mL 內標物質齊墩果酸5 μL，準確加入0.05%甲酸/乙腈150 μL，渦旋震蕩3 min，以4 ℃、10 000 r/min 離心10 min 后，取上清液供UPLC-MS/MS 分析。

2.3 UPLC-MS/MS 檢測條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.40 mL/min；流動相：水-乙腈（2∶8）；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

質譜條件：電噴霧離子源，負離子掃描；離子源溫度：500 ℃；噴霧電壓：-4 500 V；氣簾氣流速：20 psi；霧化氣流速：50 psi；脫溶劑氣流速：50 psi；多反應監(jiān)測（MRM）掃描；20（S）-PPD 及內標物質齊墩果酸多反應監(jiān)測色譜-質譜分析參數(shù)見表1。

表1 20（S）-PPD及內標物質齊墩果酸的質譜分析參數(shù)

2.4 方法學驗證

本實驗參照《中國藥典》2020 版第四部生物樣品定量分析方法驗證指導原則進行了方法學驗證內容。

2.5 藥動學研究

SPF 級SD 大鼠適應性喂養(yǎng)3 d～5 d。給藥前夜禁食不禁水，給藥后持續(xù)禁食。配制濃度為5.0 mg/mL 20（S）-PPD 水溶液（含0.3%乙醇），將上述溶液按35 mg/kg 的給藥劑量灌胃至大鼠體內，于給藥前和給藥后5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 于眼眶采血，采用肝素鈉抗凝管收集血液約0.5 mL，采用3 000 r/min 離心10 min，收集血漿于-80 ℃保存待用。

上述大鼠血漿樣品采用“2.2”方法進行處理，采用“2.3”方法檢測20（S）-PPD 的含量，測定結果使用Phoenix WinNonlin（版本8.1）進行藥代參數(shù)分析。

3 結果與討論

3.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

采用乙腈作為蛋白沉淀劑在血漿樣品藥物含量測定應用非常廣泛，當乙腈-血漿（3∶1），可將血液中蛋白質去除完全。本實驗中，當采用乙腈作為蛋白沉淀劑時，內標物質齊墩果酸峰形狀差，無法實現(xiàn)準確定量分析；考察了含0.05%和0.1%甲酸/乙腈作為蛋白沉淀劑對20（S）-PPD 和內標物齊墩果酸的影響，結果見圖1。結果表明，當含0.1%甲酸/乙腈溶液作蛋白沉淀劑時，雖然內標物質齊墩果酸峰形尖銳，質譜響應信號增大，但20（S）-PPD的質譜響應信號明顯降低，僅為含0.05%甲酸/乙腈作蛋白沉淀劑時質譜信號的20%左右。綜合考慮，選擇含0.05%甲酸/乙腈作為蛋白沉淀劑和樣品提取劑。

圖1 提取溶劑對20（S）-PPD和內標物質的質譜響應影響：A.乙腈；B.0.05%甲酸/乙腈；C.0.1%甲酸/乙腈

3.2 色譜分離條件的選擇

考察了水/乙腈、甲酸/乙腈和乙酸銨/乙腈作為流動相對20（S）-PPD 和齊墩果酸的色譜分離及質譜響應影響，結果見圖2。由圖可知，當采用0.1%甲酸-乙腈（20∶80）和1 mmol/L 乙酸銨-乙腈（20∶80）作為流動相時，20（S）-PPD 和齊墩果酸的質譜響應信號明顯降低，考慮到方法靈敏度，選擇水/乙腈體系作為流動相體系。

圖2 流動相對20(S)-PPD和內標物質的質譜響應影響：A.水/乙腈；B.0.1%甲酸/乙腈；C.1 mmol/L乙酸銨/乙腈

3.3 方法學考察

3.3.1 專屬性取6 批次空白大鼠血漿50 μL 除不加內標物質外，其余按“2.2”方法進行處理；另取空白大鼠血漿45 μL，加入20（S）-PPD 和內標物質濃度同為2 μg/mL 的標準溶液5 μL，另取大鼠給藥后的血漿樣品50 μL，按“2.2”方法進行處理；處理后血漿按“2.3”方法進行分析。大鼠給藥后血漿樣品中20（S）-PPD 和內標物質分離良好，出峰情況和加標樣品一致，且空白大鼠血漿樣品中內源性物質不干擾代謝物質測定，方法選擇性和專屬性好。

3.3.2 線性范圍及定量下限分別精密量取空白大鼠血漿45 μL，加入5 μL 20（S）-PPD 和齊墩果酸的混合溶液，配制20（S）-PPD 濃度為1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1 000 和2 500 ng/mL的血漿樣品，內標物濃度均為200 ng/mL。結果表明，20（S）-PPD 在1～2 500 ng/mL 的濃度范圍內呈現(xiàn)良好線性（r≥0.998），按信噪比S/N=10 計算，血漿中最低定量下限為0.5 ng/mL，方法靈敏度高、線性范圍寬，可以滿足20（S）-PPD 藥物研發(fā)、臨床檢測等需要。

3.3.3 準確度及精密度本研究配制高濃度質控樣品（HQC）、中濃度質控樣品（MQC）、低濃度質控樣品（LQC）及定量下限（LLOQ）4 個濃度的血漿樣品，進行準確度和精密度實驗（n=5）。批間精密度實驗時，2 天內進行上述實驗3 批次，計算n=15 的精密度。分析結果見表2，血漿中20（S）-PPD 的批內批間準確度在±12.2%以內，批內與批間精密度≤15%，方法準確度高、精密度好，符合分析方法的要求。

表2 大鼠血漿樣品中20（S）-PPD分析方法的準確度和精密度

3.3.4 基質效應和提取回收率將大鼠空白血漿樣品按“2.2”方法（不加內標）進行提取處理后得到基質空白，然后取上述基質空白45 μL，加入5 μL 20（S）-PPD 及內標物質溶液，配制高、中、低濃度質控樣品，再加150 μL 基質空白，渦旋后離心，進樣分析，記錄峰面積為A；甲醇溶液配制相同高、中、低濃度對照樣品，再加150 μL 乙腈，渦旋進樣分析，記錄峰面積為B；通過二者峰面積比觀察是否有基質效應，結果見表3。大鼠血漿基質中20（S）-PPD經(jīng)樣品前處理后，基質效應在87.3%～104.8%內，內標歸一化的基質因子的變異系數(shù)CV 小于3.6%，可以滿足分析需求。

取大鼠空白血漿45 μL，加入5 μL 20（S）-PPD和齊墩果酸的混合溶液，配制高、中、低濃度質控樣品，然后按照“2.2”方法進行處理，進樣分析，記錄峰面積為C。通過C/A 計算方法提取回收率。表3 結果可知，提取回收率在84.8%～94.1%，精密度均小于10.4%，滿足分析方法需求。

表3 大鼠血漿樣品中20（S）-PPD的回收率與基質效應

3.3.5 樣品穩(wěn)定性取大鼠空白血漿45 μL，加入5 μL 20（S）-PPD 和齊墩果酸的混合溶液，配制高、低濃度質控樣品，考察了血漿樣品室溫放置4 h 后提取處理，10 ℃自動進樣器放置24 h 及兩周內三次凍融循環(huán)后20（S）-PPD 的穩(wěn)定性。從表4 可以看出，經(jīng)上述條件存放后，20（S）-PPD 和內標物質的穩(wěn)定性在±14.3%以內，精密度在8.7%以內，可以滿足分析需要。

表4 大鼠血漿樣品中20（S）-PPD穩(wěn)定性結果

3.3.6 稀釋效應樣品測定時有的樣品濃度會超出方法的線性范圍，需對樣品進行稀釋再測定。本方法配制了5 000 ng/mL 和10 000 ng/mL 的血漿樣品，考察了血漿樣品稀釋后的穩(wěn)定性結果表明，高濃度樣品稀釋5 倍和10 倍后，樣品穩(wěn)定性良好，準確度在97.4%～99.1%之間，符合方法學要求。

3.4 藥動學研究

20（S）-PPD 血藥濃度隨時間變化曲線如圖3所示，藥代動力學參數(shù)采用非房室模型進行計算。大鼠灌胃給藥后，血漿中20（S）-PPD 的Cmax、tmax、t1/2和AUC0-∞分別為3 520 ng/mL、2 h、10.65 h和21 760 ng·mL-1·h-1。

圖3 灌胃20（S）-PPD后大鼠血漿中20（S）-PPD的血藥濃度-時間曲線

4 結論

本研究系統(tǒng)考察了血漿樣品中20（S）-PPD 前處理方法與檢測條件，結果表明本方法操作簡單、線性范圍寬、定量限低，準確度及精密度好，提取回收率高，基質效應較小，滿足血漿樣品基質中20（S）-PPD 的定性定量分析需求；利用建立的分析方法成功應用于20（S）-原人參二醇在大鼠體內的代謝動力學評價研究，結果表明20（S）-PPD在大鼠體內的吸收、消除較快，從而為20（S）-原人參二醇藥物研發(fā)及臨床用藥研究提供理論基礎與技術支持。