陳 璨，石 辰，王大瑋 ，彭勁諭，段安安

(1.西南林業(yè)大學(xué)，西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)，云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

SRAP標(biāo)記即序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(sequencerelated amplified polymorphism)憑借其操作簡(jiǎn)單、可靠和信息量高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[12-13]、遺傳圖譜構(gòu)建[14]、親緣關(guān)系分析[15]以及種子純度鑒定[16]等方面。近年來(lái)，SRAP-PCR反應(yīng)體系已成功在蘋(píng)果[17]、山梨[18]和思茅松[19]等物種建立，為其遺傳多樣性的研究提供了技術(shù)支持。本研究旨在分析TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、模板DNA及引物5種因素對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響，建立云南栘SRAP-PCR體系，并篩選出有效的SRAP-PCR引物，為后續(xù)云南栘遺傳多樣性分析提供技術(shù)支持，以期為合理制定中國(guó)西南地區(qū)這一特色野生資源的遺傳改良策略以及野生種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究材料為木里(N27°95′，E101°27′)、瀾滄(N22°59′，E100°17′)和盈江(N25°20′，E98°16′)3個(gè)云南栘天然群體，每個(gè)群體隨機(jī)采集10株長(zhǎng)勢(shì)較好的云南栘植株的幼嫩葉片，儲(chǔ)存于-80 ℃ 條件下備用。SRAP-PCR體系建立的模板DNA來(lái)自瀾滄1號(hào)云南栘群體(N22°59′，E100°17′)，引物由生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

采用張魯杰等[20]的CTAB法并加以改進(jìn)，對(duì)采集樣本基因組DNA進(jìn)行提取。所得樣本DNA的質(zhì)量通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測(cè)定儀2種方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系及程序

表1 SRAP-PCR 反應(yīng)因素及水平Tab.1 Reaction factors and levels of SRAP-PCR

表2 SRAP-PCR 反應(yīng)因素水平 L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.2 L16(45) orthogonal test deign of SRAP-PCR

1.2.3 引物篩選

1.2.4 SRAP-PCR體系的穩(wěn)定性檢測(cè)

根據(jù)建立的SRAP-PCR反應(yīng)體系對(duì)木里、瀾滄和盈江3個(gè)天然群體的云南栘基因組DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)云南栘SRAP-PCR體系進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)，拍照保存結(jié)果。

1.2.5 數(shù)據(jù)整理與分析

利用張麗等[23]的方法，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，依據(jù)擴(kuò)增條帶的清晰度和穩(wěn)定性對(duì)16個(gè)組合的PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，條帶數(shù)量最多、清晰度最高的產(chǎn)物記為16分，最差產(chǎn)物記為1分。依據(jù)評(píng)分結(jié)果，Ki為同一水平參與反應(yīng)的各因子的試驗(yàn)值之和，ki為該水平參與反應(yīng)的數(shù)據(jù)平均值，同一因素下ki最大值減去ki最小值即為該因子的極差(R)。R的大小與各個(gè)因素對(duì)SRAP-PCR 反應(yīng)體系影響的大小成正比，R越大則該因素對(duì)反應(yīng)影響越大，反之，R越小則對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響越小。ki反映了因素在各水平條件下對(duì)反應(yīng)體系的影響，當(dāng)ki達(dá)到最大值時(shí)，該因素在當(dāng)前水平下達(dá)到最佳值。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA質(zhì)量

圖1 部分云南栘樣品DNA檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of genomic DNA of some Docyina delavayi

2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立

依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)16個(gè)組合的PCR (圖2)進(jìn)行評(píng)分，1～16號(hào)組合的評(píng)分結(jié)果(表3)顯示：第3、4、11和14泳道條帶數(shù)量較多且相對(duì)清晰，得分較高，其中，第4泳道條帶亮度最高，多態(tài)性好，得分最高，為16分；第1、2、8和9泳道條帶較少，亮度低，且存在彌散現(xiàn)象，得分較低，其中，第9泳道條帶最少亮度最弱，得分為1分。

表3 正交試驗(yàn)電泳條帶得分值Tab.3 Score of electrophoresis band in orthogonal test

圖2 云南栘 SRAP-PCR 反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The amplified results of D.delavayi SRAP-PCR orthogonal test

由R值(表4)可知：各因素對(duì)云南栘SRAPPCR反應(yīng)體系的影響由小到大排列為：dNTPs<模板DNA

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistic results of the orthogonal test

2.3 云南栘 SRAP-PCR引物組合篩選

表5 SRAP 引物組合及擴(kuò)增結(jié)果Tab.5 Primer pairs of SRAP and their amplification results

2.4 SRAP-PCR體系的穩(wěn)定性檢測(cè)

圖3 引物 Me6/Em2 對(duì)建立體系進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 The SRAP-PCR results with the primer of Me6/Em2

3 討論

SRAP標(biāo)記對(duì)基因組DNA的質(zhì)量濃度要求較低，但基因組DNA的質(zhì)量和純度是直接導(dǎo)致PCR擴(kuò)增反應(yīng)效果和重復(fù)性好壞的關(guān)鍵性因素[24]。云南栘葉片中富含多糖和多酚等多種次生代謝物[25]，容易與DNA結(jié)合形成難以溶解分離的膠狀化合物，從而影響基因組DNA的質(zhì)量，造成DNA得率下降等負(fù)面影響[26]。本研究以云南栘的幼嫩葉片為試驗(yàn)材料，在傳統(tǒng)CTAB提取法上針對(duì)多糖和多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行改良，在液氮研磨的過(guò)程中加入PVP-40粉末，并在提取過(guò)程中加入適量的β-巰基乙醇，最大限度地減少酚類(lèi)雜質(zhì)與基因組DNA的結(jié)合，有效降低了多酚物質(zhì)在提取過(guò)程中因氧化產(chǎn)生的褐化現(xiàn)象[27]。經(jīng)瓊脂糖凝膠及微量核酸蛋白儀檢測(cè)，驗(yàn)證了用該方法獲得的基因組DNA符合SRAPPCR反應(yīng)的要求，為后續(xù)分子試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

已有的SRAP-PCR體系建立大多采用單因素多水平分析法，此方法可以直觀了解各因素對(duì)SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的影響[28-29]，但在PCR反應(yīng)體系中，這些主要因素之間往往存在一定程度的相互作用與影響，單因素多水平分析法無(wú)法明確各個(gè)因素之間的相互影響[30]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，對(duì)各因素在不同水平下的交互作用進(jìn)行研究的一種試驗(yàn)方法[31]，具有均衡分散和整體可比的特點(diǎn)，通過(guò)較少的試驗(yàn)便可全面了解試驗(yàn)的情況，從而能快速地確定最佳體系組合[32]。本研究采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了云南栘25 μL的SRAP-PCR反應(yīng)體系，結(jié)果表明：引物、Mg2+、dNTPs和TaqDNA聚合酶對(duì)云南栘SRAP-PCR反應(yīng)體系有一定影響，各因素對(duì)云南栘SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響由小到大排列為dNTPs<模板 DNA

SRAP標(biāo)記在海南油茶[34]、河南辛夷[35]、楊樹(shù)[30]和思茅松[19]等植物中均有應(yīng)用，且能較好地?cái)U(kuò)增出多態(tài)性條帶。在眾多遺傳多樣性研究中，SRAP分子標(biāo)記有較大的利用率，在中國(guó)新疆野蘋(píng)果[36]和湖北油茶[37]的遺傳多樣性分析中，分別使用了10對(duì)和11對(duì)SRAP引物，擴(kuò)增得到的多態(tài)性位點(diǎn)百分率都較高。證明SRAP分子標(biāo)記在親緣關(guān)系判斷、遺傳多樣性分析以及分子標(biāo)記輔助育種等方面具有巨大的研究潛力。本研究共篩選出20對(duì)多態(tài)性較好的SRAP引物組合，共擴(kuò)增出212條帶，其中187條具有多態(tài)性，占比為88.21%，進(jìn)一步佐證了SRAP 分子標(biāo)記在云南栘群體中可以獲得較高的多態(tài)性，適合應(yīng)用于云南栘的遺傳多樣性分析。

4 結(jié)論