李 雪，李國澤，楊 玲，唐軍榮，趙 平，丁 勇

(1.西南林業(yè)大學(xué)，云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)，西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

樟葉越桔(Vaccinium dunalianumWight)為杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)多年生木本灌木或小喬木，在中國多分布于云南、四川和貴州等地[1]。全株藥用，具有祛風(fēng)除濕和舒筋活絡(luò)的功效[2]；其幼嫩葉芽經(jīng)民間加工處理后可作為“雀嘴茶”品嘗，其制作工藝可追溯到明代[3]。樟葉越桔化學(xué)成分豐富[4]，尤其因富含熊果苷、綠原酸和6′-O-咖啡酰熊果苷等重要天然次生代謝產(chǎn)物而具有多種生理活性[5-7]，在高質(zhì)量化妝品研發(fā)、食品與醫(yī)藥等方面具有重要的潛在研究價(jià)值。

樟葉越桔生長緩慢，目前仍處于野生或尚未開發(fā)狀態(tài)，加上近年來人們對其關(guān)注度的日益提高，其野生生境遭到嚴(yán)重破壞且程度日趨加劇，給樟葉越桔重要次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)和開發(fā)帶來巨大困難，而愈傷組織誘導(dǎo)和不定根分化是實(shí)現(xiàn)其重要次生代謝化合物生產(chǎn)和相關(guān)研究的重要途徑。愈傷組織自身分裂能力強(qiáng)、生長快、周期短，可用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[8]并大量生產(chǎn)次生代謝物；此外，愈傷組織在原生質(zhì)體分離[9]和遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用[10-12]等方面也具有重要作用。不定根廣泛應(yīng)用于植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)，在人參 (Panax ginseng)[13]、丹參 (Salvia miltiorrhizaBunge)[14]和何首烏 (PolygonummultiflorumThunb.)[15]等名貴中藥材重要次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中取得理想結(jié)果，為在工業(yè)水平生產(chǎn)重要次生代謝產(chǎn)物提供了可行性。近年來，愈傷組織誘導(dǎo)不僅在枸杞 (Lycium barbarumL.)[16]、泡桐 (Paulownia)[17]和杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)[18]等木本植物取得進(jìn)展，也在矮叢藍(lán)莓 (V.angustifolium)[19]、高叢藍(lán)莓 (V.corymbosum)[20]和越桔 (V.myrtillus)[21]等越桔屬植物中取得突破。樟葉越桔作為一個(gè)新型民族資源植物，雖然前期已經(jīng)初步建立了其組培技術(shù)體系[3,22-23]，但還未建立其以莖段為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)體系。莖段具有易培養(yǎng)、變異小、增殖快和成活率高等特點(diǎn)[24]，因此，本研究以樟葉越桔幼嫩莖段為外植體，探究其愈傷組織誘導(dǎo)和不定根再生的最佳激素組合，建立其愈傷組織誘導(dǎo)和不定根的再生體系，為樟葉越桔種質(zhì)資源保護(hù)和以其愈傷組織和不定根為材料的研究與應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試母本材料為樟葉越桔組培瓶苗，最初由西南林業(yè)大學(xué)樟葉越桔研究課題組于2013年5月繁育[3]，經(jīng)多次繼代培養(yǎng)，現(xiàn)培養(yǎng)于西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

試驗(yàn)中越桔屬植物組織培養(yǎng)常用的木本植物培養(yǎng)基(WPM) 干粉、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)、噻苯隆(thidiazuron,TDZ)和玉米素 (zeatin，ZT) 均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料的增殖培養(yǎng)

取同一來源、同一批次的樟葉越桔組培瓶苗，切成帶2個(gè)葉片的莖段，在無菌操作臺(SWCJ-2F)上垂直接種于添加蔗糖30 g/L、ZT 2.0 mg/L、瓊脂5 g/L的WPM (pH 5.8)上，每瓶培養(yǎng)基40 mL、10個(gè)莖段。經(jīng)7 d暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，光照強(qiáng)度30～50 μmol/(m2·s)，每天光照12 h，培養(yǎng)60 d后用作下一次繼代的增殖材料。經(jīng)過25次繼代增殖達(dá)到試驗(yàn)所需組培苗量后，選取生長良好、長勢基本一致的幼嫩樟葉越桔組培苗用于愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2.2 不同激素及其質(zhì)量濃度對樟葉越桔莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將樟葉越桔組培苗置于超凈工作臺上，去除葉片，取中部莖段，切成長為2～3 cm、帶3個(gè)節(jié)點(diǎn)的莖段，并在莖段上劃3～4個(gè)傷口，有傷口處朝上平行接種于添加不同質(zhì)量濃度2,4-D和TDZ的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (WPM +蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L) 上，采用L9(32)正交試驗(yàn)設(shè)置2因素9組合正交試驗(yàn)激素配比(表1)。每個(gè)處理組接種30瓶，每瓶2根莖段。先進(jìn)行7 d暗培養(yǎng)處理，之后轉(zhuǎn)到培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2.1節(jié)。每天觀察其生長情況，于30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率、外植體污染率、愈傷組織量和愈傷組織質(zhì)地等指標(biāo)。

表1 樟葉越桔莖段愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗(yàn)Tab.1 The orthogonal test of callus induction hormone combination of Vaccinium dunalianum mg/L

1.2.3 不同細(xì)胞分裂素及其質(zhì)量濃度對愈傷組織再分化不定根的影響

將1.2.2節(jié)中獲得的最優(yōu)愈傷組織用手術(shù)刀從外植體上輕輕剝離，盡量不損傷愈傷組織，切成直徑約1 cm的塊狀，分別接種于不同質(zhì)量濃度TDZ和ZT (表2)的愈傷組織再分化培養(yǎng)基 (WPM +蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L) 上。每個(gè)處理組接種20瓶，每瓶接種5塊愈傷組織。先進(jìn)行7 d暗培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2.1節(jié)。于60 d時(shí)觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織再分化不定根情況。

表2 愈傷組織再分化誘導(dǎo)激素及其質(zhì)量濃度Tab.2 Hormone and its concentration induced by callus redifferentiation mg/L

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel統(tǒng)計(jì)，并根據(jù)以下公式計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織再分化誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=(形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù))×100%；

愈傷組織再分化誘導(dǎo)率=(再分化的愈傷組織數(shù)/接種的總愈傷組織數(shù))×100%。

根據(jù)愈傷組織生長情況和愈傷組織量的多少，將愈傷組織量描述為少、一般、較多和旺盛4個(gè)等級，分別記為“+”“++”“+++”和“++++”。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟葉越桔組培苗的繼代增殖

如圖1所示：樟葉越桔組培苗在增殖培養(yǎng)基上生長約30 d時(shí)可明顯觀察到幼嫩腋芽萌發(fā)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，腋芽數(shù)量增加，形成較多分支；當(dāng)培養(yǎng)到90 d時(shí)，組培苗生長旺盛，側(cè)枝多，顏色濃綠，平均高度可達(dá)5～7 cm，可滿足后續(xù)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的供試材料要求。

圖1 供試樟葉越桔材料的繼代增殖培養(yǎng)Fig.1 Subculture and multiplication culture of test Vaccinium dunalianum material

2.2 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3和圖2可知：2,4-D和TDZ的9組不同質(zhì)量濃度組合配比處理均可先后成功誘導(dǎo)樟葉越桔莖段長出愈傷組織，但試驗(yàn)誘導(dǎo)愈傷組織的初愈傷時(shí)間和愈傷組織質(zhì)地存在一定差異。培養(yǎng)7 d后觀察到各處理組的莖段普遍增大變粗趨于透明狀；T4組莖段于培養(yǎng)12 d時(shí)誘導(dǎo)長出小顆粒愈傷組織，T5～T9組莖段在培養(yǎng)15 d時(shí)誘導(dǎo)出愈傷組織，T1～T3組莖段誘導(dǎo)出愈傷組織的時(shí)間最長，為20 d。培養(yǎng)至30 d時(shí)，T1和T2組莖段誘導(dǎo)率較高，分別為90.0%和93.3%，但愈傷組織量一般，無明顯差異。T3組誘導(dǎo)率為76.7%，愈傷組織效果較差。T4～T6組誘導(dǎo)的乳白色愈傷組織生長迅速，鮮活，質(zhì)地緊實(shí)，長勢好；其中，T4組誘導(dǎo)率達(dá)100.0%，且愈傷組織量旺盛；T5組誘導(dǎo)率為90.0%，愈傷組織量較多；而T6組誘導(dǎo)率低至73.3%。T7～T9組誘導(dǎo)的乳白色愈傷組織雖然鮮活，但質(zhì)地疏松且長勢緩慢；其中，T7組誘導(dǎo)率較低，為76.7%；T8和T9組雖然誘導(dǎo)率較高(分別為100.0%和93.3%)，但生長緩慢且質(zhì)地不理想。表明2,4-D質(zhì)量濃度越高，愈傷組織質(zhì)地越趨于疏松；質(zhì)量濃度越低，愈傷組織質(zhì)地越緊實(shí)。另外，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，后期觀測到隨著TDZ質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織越趨于褐化且程度加深。因此，2,4-D 2.0 mg/L+TDZ 0.1 mg/L (T4組)是樟葉越桔莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素組合。此外，培養(yǎng)60 d 時(shí)T4組愈傷組織質(zhì)地為乳白色大顆粒、緊實(shí)、鮮活，相較于其他處理組仍長勢最好，因此，將T4組的愈傷組織作為后續(xù)不定根再生的供試材料。

圖2 不同激素配比下愈傷組織的生長 (30 d)Fig.2 Growth of callus under different hormones ratio

表3 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effects of different hormone ratio on the callus induction of stem

2.3 不同細(xì)胞分裂素及其質(zhì)量濃度對愈傷組織再分化不定根的影響

愈傷組織在各組再分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后，乳白色愈傷組織普遍開始轉(zhuǎn)變?yōu)槟劬G色，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長到約40 d時(shí)，愈傷組織表面開始產(chǎn)生一定數(shù)量的不定根。再隨著培養(yǎng)時(shí)間增加到60 d時(shí)(表4、圖3)，T10組不定根萌發(fā)率最高，可達(dá)96.7%，不定根較長、量較多且整齊均勻；T11組效果次之，不定根萌發(fā)率為66.7%，不定根數(shù)量中等且不均勻；T12組不定根萌發(fā)率最差，僅為46.7%，不定根數(shù)量較少且短。說明隨著TDZ質(zhì)量濃度的增加，不定根萌發(fā)率和生長逐漸受到抑制。此外，T15組的不定根萌發(fā)率最高，為76.7%，量多但不均勻；T14組效果次之，不定根的萌發(fā)率為53.3%；T13組的不定根萌發(fā)率效果最差，僅為36.7%，量少、稀疏且不均勻。說明隨著ZT的質(zhì)量濃度越大，不定根的萌發(fā)率越高且數(shù)量越多。以上結(jié)果表明：TDZ對樟葉越桔愈傷組織再分化不定根的促進(jìn)作用顯著優(yōu)于ZT，且質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)效果較好。

圖3 不同質(zhì)量濃度細(xì)胞分裂素下愈傷組織再分化不定根的生長 (60 d)Fig.3 Growth of callus redifferentiation adventitious root under different concentrations of cytokinin

表4 不同質(zhì)量濃度細(xì)胞分裂素對愈傷組織再分化不定根的影響Tab.4 Effects of different mass concentrations of cytokinin on the callus redifferentiation adventitious root

3 討論

本研究以樟葉越桔幼嫩莖段為外植體，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基及配方為：WPM +2,4-D 2.0 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%，乳白色顆粒，質(zhì)地緊密，鮮活且生長旺盛，無褐化現(xiàn)象產(chǎn)生。愈傷組織在再分化培養(yǎng)基(WPM+TDZ 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L)上，不定根誘導(dǎo)率達(dá)96.7%，根較長，量較多，整齊，均勻。MEINERS等[20]以越桔莖段為外植體，發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基比Anderson和MS培養(yǎng)基更適合越桔屬植物的組織培養(yǎng)。SEDLAK等[25]以高叢藍(lán)莓為試驗(yàn)材料的研究結(jié)果也說明WPM培養(yǎng)基更適合越桔屬植物組織培養(yǎng)的結(jié)論，所以本研究優(yōu)先選用WPM為基本培養(yǎng)基。

植物生長調(diào)節(jié)劑的使用在很大程度上決定著愈傷組織誘導(dǎo)的效率、愈傷組織胚性及其分化方向[26]。本研究選擇不同質(zhì)量濃度的2,4-D對樟葉越桔莖段愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度為2.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率可達(dá)到100%。這一結(jié)果與白刺花(Sophoradavidii)胚性愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果[26]一致。一般認(rèn)為高質(zhì)量濃度的生長素有利于愈傷組織的生長，且2,4-D的誘導(dǎo)效果優(yōu)于萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸等[27-29]。但當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度過高或過低時(shí)愈傷組織的生長和分化會受到嚴(yán)重影響，不利于外植體間接芽再生后期不定芽的分化[21]，且愈傷組織長期生長于含2,4-D的培養(yǎng)基上會逐漸喪失其胚性，極大地限制愈傷組織進(jìn)一步分化出芽的能力[26]。TDZ是一種新型人工合成的高效細(xì)胞分裂素類植物激素[30]，對組織培養(yǎng)的效果因其質(zhì)量濃度存在較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度的TDZ更有利于樟葉越桔莖段愈傷組織的發(fā)生，這一結(jié)果與KARAKAS[16]對枸杞愈傷組織誘導(dǎo)的研究結(jié)果相符。愈傷組織用途眾多，不僅是細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)的原材料來源[31]，還常用于工農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥生產(chǎn)中無性系的篩選以及重要次生代謝化合物的大規(guī)模生產(chǎn)[32]。此外，不同部位誘導(dǎo)形成的愈傷組織，其次生代謝物含量會存在差別[33]。本研究以樟葉越桔莖段為外植體建立愈傷組織誘導(dǎo)體系，為后續(xù)進(jìn)行不同部位愈傷組織合成次生代謝物能力比較奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)，也為開展愈傷組織合成次生代謝物的研究與應(yīng)用提供了材料參考，并對日益匱乏的樟葉越桔植物種質(zhì)資源保存、品種改良及遺傳育種工作具有重要意義。

不定根在重要次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)與植物營養(yǎng)等方面具有重要意義[13-15]。由于次生代謝物通常由專門的細(xì)胞或在不同的發(fā)育階段才能合成，而未分化的植物細(xì)胞培養(yǎng)物通常會部分或全部喪失積累次生產(chǎn)物的能力[34]。因此，通過誘導(dǎo)不定根獲得次生代謝物也是一種重要的生物技術(shù)手段，不定根在培養(yǎng)過程中比細(xì)胞系更穩(wěn)定，且次生代謝物的合成能力更強(qiáng)[35-36]。本研究建立了以愈傷組織為材料分化不定根的技術(shù)體系，在愈傷組織再分化誘導(dǎo)階段中發(fā)現(xiàn)：在不同種類的單一細(xì)胞分裂素作用下，愈傷組織的再分化程度存在差異。在TDZ作用下，不定根誘導(dǎo)率最高達(dá)96.7%，而在ZT作用下誘導(dǎo)率與前者相比降低20%，可見，TDZ在促進(jìn)樟葉越桔愈傷組織再分化不定根階段中效果更佳。與以樟葉越桔組培苗葉片為外植體的不定根形成技術(shù)體系[22]相比，愈傷組織因質(zhì)地均一、分化能力強(qiáng)，誘導(dǎo)獲得的不定根數(shù)量更多、長度更長、質(zhì)量更佳，還解決了因個(gè)別葉片效果差異所導(dǎo)致的不定根相對平均偏差較大[22]的問題。因此，本研究為實(shí)現(xiàn)利用樟葉越桔不定根植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)熊果苷和6′-O-咖啡酰熊果苷等重要次生代謝化合物提供了穩(wěn)定的材料來源。

有研究表明：TDZ在越桔[20]和高叢藍(lán)莓[37]等越桔屬植物中具有顯著的促進(jìn)不定芽再生作用。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，提高TDZ的質(zhì)量濃度可提高外植體不定芽的數(shù)量，但會抑制不定芽節(jié)間的伸長；降低其質(zhì)量濃度有助于節(jié)間伸長但不定芽數(shù)量減少[21,38]。本研究發(fā)現(xiàn)：樟葉越桔愈傷組織可直接再分化出大量不定根，這一現(xiàn)象與譚亞婷等[39]的研究一致，而與其他越桔屬植物愈傷組織再分化誘導(dǎo)易出芽[40]相反，說明樟葉越桔愈傷組織易分化不定根，但不易出芽。這給以樟葉越桔愈傷組織為材料的遺傳轉(zhuǎn)化體系建立帶來了困難。推測愈傷組織再分化不易出芽的原因主要有：(1) 盡管2,4-D具有顯著的促進(jìn)愈傷組織生成的能力，但在某些物種愈傷組織再分化不定芽后期具有抑制作用[21]；(2) 2,4-D的作用具有階段性，愈傷組織在含2,4-D的培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間后會喪失再分化不定芽的能力[26]；(3) 愈傷組織再分化不定芽階段不僅需要細(xì)胞分裂素的調(diào)節(jié)，也需要生長素的參與[41]。針對樟葉越桔愈傷組織再分化不定芽過程中存在的問題，需要在后續(xù)研究中進(jìn)行更深入的探索，如培養(yǎng)條件的優(yōu)化、外源激素種類的選擇與配比的合理使用等。

4 結(jié)論

本研究建立了樟葉越桔以莖段為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)體系，誘導(dǎo)出的愈傷組織呈乳白色且誘導(dǎo)率理想，愈傷組織再分化階段獲得大量不定根，數(shù)量多、較長且均勻，愈傷組織和不定根在培養(yǎng)過程中比細(xì)胞系更穩(wěn)定。因此，通過誘導(dǎo)愈傷組織和不定根再生來獲得重要次生代謝產(chǎn)物也是一種重要的生物技術(shù)手段，這為樟葉越桔在工業(yè)水平生產(chǎn)重要次生代謝產(chǎn)物提供了可行性。