劉 魁，田陽陽，王正旭，楊繼周，李湘?zhèn)?，孫蒙猛，嚴(yán) 杰，趙文軍

[紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100]

土壤細(xì)菌是土壤微生物區(qū)系的重要組成部分，在土壤中參與有機(jī)質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成及養(yǎng)分循環(huán)過程，是土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化的驅(qū)動(dòng)力，其多樣性和豐富度是衡量土壤健康狀況及肥力水平的生物指標(biāo)之一[1-2]。但目前烤煙生產(chǎn)上隨著復(fù)種指數(shù)的增加及化肥的長期施用，土壤環(huán)境發(fā)生了巨大變化，有機(jī)質(zhì)含量逐漸降低，供肥能力逐漸減弱，有益微生物減少，限制了煙葉質(zhì)量的提升[3]。研究表明：6年定位施用化肥植煙土壤有機(jī)質(zhì)含量較原始土壤下降6.09%[4]；12年定位施用化肥植煙土壤自生固氮菌和無機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量分別較不施肥土壤降低56.69%和41.30%[5]；16年定位施用化肥植煙土壤有機(jī)質(zhì)含量下降20.56%，真菌種群數(shù)量增加，病原微生物相對(duì)占比增大[6]?？梢姡L期單施化肥不利于土壤的可持續(xù)利用和培肥土壤。改變施肥模式，增加有機(jī)肥的施用可對(duì)土壤微生物產(chǎn)生重要影響[7]。前人通過平板計(jì)數(shù)法、Biolog法和高通量測序技術(shù)對(duì)植煙土壤微生物的研究表明：施用有機(jī)肥較單施化肥可提高植煙土壤中的細(xì)菌多樣性和豐富度[8]，提高烤煙根際土壤細(xì)菌數(shù)量和微生物總量[9]，增加土壤中氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物數(shù)量[10]，提高碳源利用能力[11]。針對(duì)連作植煙土壤，施用有機(jī)肥也可提高細(xì)菌多樣性、豐度及進(jìn)化距離指數(shù)，促進(jìn)細(xì)菌群落進(jìn)化[12]。因此，研究施用有機(jī)肥對(duì)土壤微生物變化的影響，對(duì)科學(xué)施肥、改善煙區(qū)土壤狀況及煙區(qū)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

不同種類的有機(jī)肥對(duì)土壤微生物的作用存在一定差異。趙文超[13]對(duì)6種有機(jī)肥的研究表明：不同有機(jī)肥處理土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)相似度為73.45%，但不同處理間在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳素循環(huán)及代謝等方面仍存在差異。施嫻等[14]對(duì)4種有機(jī)肥的研究表明：施用有機(jī)肥可增加土壤微生物數(shù)量，但不同有機(jī)肥處理間表現(xiàn)不同。因此，本研究以玉溪煙區(qū)3種組分差異較大的常用商品有機(jī)肥為材料，利用IonS5TMXL高通量測序平臺(tái)研究施用不同有機(jī)肥對(duì)烤煙根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響，并對(duì)其進(jìn)行功能預(yù)測分析，為煙區(qū)土壤改良修復(fù)及可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況及試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年4—9月在云南省玉溪市峨山縣塔甸鎮(zhèn)瓦哨宗村(N24.28°，E102.11°)進(jìn)行，土壤類型為紅壤，前作為油菜，土壤理化性質(zhì)為：pH 6.5，有機(jī)質(zhì)含量33.26 g/kg，全氮含量1.85 g/kg，堿解氮含量114.52 mg/kg，有效磷含量43.27 mg/kg，速效鉀含量231.46 mg/kg。供試烤煙品種為K326。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理，(1) CK：煙草專用復(fù)合肥[m(N)∶m(P)∶m(K)=12∶6∶24] 600 kg/hm2；(2) T1處理：CK+煙草專用有機(jī)肥1.5 t/hm2(pH 6.3，有機(jī)質(zhì)含量55.04%，全氮含量1.67%，C/N=19.12，成分主要為菜籽粕、作物秸稈和腐殖酸等)；(3) T2處理：CK+生物有機(jī)肥1.5 t/hm2(pH 7.1，有機(jī)質(zhì)含量90.8%，全氮含量0.90%，C/N=58.52，成分主要為腐殖酸和生物菌等)；(4) T3處理：CK+精制有機(jī)肥1.5 t/hm2(pH 7.42，有機(jī)質(zhì)含量89.71%，全氮含量2.96%，C/N=17.58，成分主要為菜葉渣和油枯等)。各有機(jī)肥均為商品有機(jī)肥。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)面積55.56 m2，烤煙種植行株距為120×50 cm，2018年4月26日開始移栽，9月10日采收結(jié)束。施肥方式為基肥：30%煙草專用復(fù)合肥加全部有機(jī)肥在烤煙移栽時(shí)拌塘施用；追肥：70%復(fù)合肥在移栽后30 d內(nèi)分2次追施。其他生產(chǎn)技術(shù)措施按照烤煙常規(guī)栽培技術(shù)操作。

1.3 土壤樣品采集

根際土壤樣品于烤煙移栽后55 d利用抖土法[15]采集。每個(gè)小區(qū)按五點(diǎn)取樣法采集土壤樣品，將各處理不同重復(fù)土壤樣品混勻后進(jìn)行四分法留取，將得到的4個(gè)處理樣本放入-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存，待測。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤微生物基因組DNA的提取

用MO-BIO PowerSoil?DNA Isolation Kit對(duì)各處理土壤樣品微生物基因組DNA進(jìn)行提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和含量，用無菌水稀釋至1 ng/μL。

1.4.2 PCR擴(kuò)增及測序

將帶標(biāo)簽序列的16S rDNA V4區(qū)特異引物51-5F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，使用GeneJET凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher公司的Ion S5TMXL測序平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測序。該過程由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

將截去標(biāo)簽序列和引物序列初步質(zhì)控得到的原始序列通過UCHIME軟件[16]與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)檢測嵌合體序列，并去除其中的嵌合體序列[17]，得到最終的有效序列。利用Uparse軟件[18]以97%的一致性將所有樣品的全部有效序列聚類成為OTUs。用Mothur方法[19]與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[20]進(jìn)行物種注釋分析，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的樣本為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各樣品數(shù)據(jù)均一化處理后進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。使用Qiime V1.9.1計(jì)算細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)和unifrac距離(分析細(xì)菌群落β多樣性)，并構(gòu)建UPGMA樣品聚類樹。α多樣性指數(shù)中，Shannon指數(shù)為菌群多樣性指數(shù)，Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)為菌群豐度指數(shù)，指數(shù)值越大表示細(xì)菌群落多樣性越高、種類越豐富。使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線、PCA圖(分析細(xì)菌群落β多樣性)和韋恩圖。使用FAPROTAX[21]工具進(jìn)行細(xì)菌群落功能預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量

由表1可知：4個(gè)處理樣本測序后經(jīng)初步質(zhì)控得到的原始序列數(shù)為351 299條，去除嵌合體后得到的有效序列數(shù)為340 351條，占原始序列數(shù)的96.88%，按97%一致性共聚類為5 655個(gè)OTUs，注釋到3界37門50綱114目211科500屬(含未明確細(xì)菌)。由圖1可知：隨著測序數(shù)量的不斷增加，細(xì)菌OTUs豐度的稀釋曲線斜率逐漸減小后趨于平坦，表明測序數(shù)據(jù)量合理，能夠反映出不同處理烤煙根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，而更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種。

圖1 烤煙根際土壤細(xì)菌OTUs豐度稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of bacteria OTUs abundance in fluecured tobacco rhizosphere soil

表1 烤煙根際土壤樣品測序結(jié)果Tab.1 Sequencing results of flue-cured tobacco rhizosphere soil samples

2.2 細(xì)菌群落α多樣性分析

由表2可知：測序深度指數(shù)樣品文庫覆蓋率為99.66%～99.81%，表明制備文庫覆蓋了烤煙根際土壤樣品中99.66%以上的細(xì)菌類群，庫存容量足夠反映樣品中細(xì)菌群落的真實(shí)組成。各處理細(xì)菌Shannon指數(shù)、Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)排序均為T2>T3>T1>CK，表明增施有機(jī)肥均有利于提高烤煙根際土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度。

表2 施用有機(jī)肥對(duì)烤煙根際土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)的影響Tab.2 Effects of organic fertilizer application on the α diversity index of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco

2.3 細(xì)菌OTUs分布

由圖2可知：CK、T1、T2和T3處理烤煙根際土壤樣本中共有的細(xì)菌OTUs數(shù)為1 716，每個(gè)處理均有數(shù)量不等的其他樣品沒有出現(xiàn)的OTUs，各處理按特有OTUs數(shù)量排序?yàn)門2>T3>T1>CK。可見，施用有機(jī)肥可提高烤煙根際土壤特有細(xì)菌菌種數(shù)量。

圖2 烤煙根際土壤細(xì)菌OTUs分布韋恩圖Fig.2 Venn graph of bacteria OTUs distribution in rhizosphere soil of flue-cured tobacco

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)豐度

對(duì)不同處理根際土壤中優(yōu)勢細(xì)菌門相對(duì)豐度的分析(圖3)表明：各處理根際土壤中相對(duì)豐度排名前10的優(yōu)勢細(xì)菌門分別為：變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、未明確細(xì)菌、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和厚壁菌門(Firmicutes)，總相對(duì)豐度達(dá)到95.12%～96.46%。各有機(jī)肥處理變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門和浮霉菌門相對(duì)豐度較CK均有所增加，但放線菌門的相對(duì)豐度有所下降，其中T1和T2處理酸桿菌門、綠彎菌門及浮霉菌門相對(duì)豐度均高于T3處理，T3處理變形菌門相對(duì)更為豐富，芽單胞菌門相對(duì)豐度以T1處理最高。

圖3 施用有機(jī)肥對(duì)烤煙根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌門結(jié)構(gòu)組成和相對(duì)豐度的影響Fig.3 Effects of organic fertilizer application on the composition and relative abundance of dominant bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco at phylum level

對(duì)排名前5的優(yōu)勢細(xì)菌門中包含序列數(shù)最多的OTUs所代表的細(xì)菌屬相對(duì)豐度進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果(表3)表明：T1、T2與T3處理烤煙根際土壤中變形菌門鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、擬桿菌門黃色土源菌屬(Flavisolibacter)、酸桿菌門Bryobacter、芽單胞菌門芽單胞菌屬(Gemmatimonas)的相對(duì)豐度較CK均有所增加，且以T1處理最高，但放線菌門未明確細(xì)菌屬的相對(duì)豐度均低于CK。

表3 施用有機(jī)肥對(duì)烤煙根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌相對(duì)豐度的影響Tab.3 Effects of organic fertilizer application on the relative abundance of dominant bacteria in fluecured tobacco rhizosphere soil %

2.5 細(xì)菌群落β多樣性分析

PCA結(jié)果(圖4)表明：第1主成分(PC1)可以解釋47.15%的細(xì)菌群落組成成分，第2主成分(PC2)可以解釋29.05%的細(xì)菌群落組成成分，合計(jì)解釋度為76.20%。施用有機(jī)肥處理位于第二和第三象限，其中T1和T2處理處于第三象限，T3處理處于第二象限，CK處理處于第四象限。在第1主成分上，T1、T2和T3處理具有相似性，且與CK有較大差異。表明施用不同有機(jī)肥后細(xì)菌群落物種相對(duì)豐度較單施化肥均發(fā)生了明顯變化。

圖4 各處理烤煙根際土壤細(xì)菌群落在門水平上的PCA分析Fig.4 PCA analysis of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco under different treatments at phylum level

由圖5可知：當(dāng)unifrac距離為0.025時(shí)，各處理烤煙根際土壤細(xì)菌群落在門水平上可聚為2類，施用有機(jī)肥處理為1類，單施化肥處理為1類；當(dāng)unifrac距離為0.037 5～0.050 0時(shí)可聚為3類，T1和T2處理為1類，T3處理與CK分別單獨(dú)為1類。表明施用有機(jī)肥處理細(xì)菌群落組成及相對(duì)豐度與單施化肥處理均有明顯差異，其中T1與T2處理相似度較高。

圖5 各處理烤煙根際土壤細(xì)菌群落在門水平上的UPGMA聚類分析Fig.5 UPGMA cluster analysis of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco under different treatments at phylum level

2.6 細(xì)菌群落功能分析

根據(jù)16S序列分類注釋結(jié)果，利用FAPROTAX工具對(duì)細(xì)菌群落功能進(jìn)行注釋預(yù)測，總共獲得56個(gè)功能分組；相對(duì)豐度排名前10的細(xì)菌群落功能分組信息及聚類結(jié)果見圖6。結(jié)果表明：各有機(jī)肥處理烤煙根際土壤中化能異養(yǎng)、幾丁質(zhì)分解、光養(yǎng)、光異養(yǎng)、硝化和發(fā)酵等功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度均高于單施化肥處理，而芳香化合物降解功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度低于單施化肥處理。T1處理發(fā)酵和捕食性功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度高于其他處理；T2處理硝酸鹽還原功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度高于其他處理，其硝化功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度(1.07%)與T1處理(1.04%)水平相當(dāng)且高于CK和T3處理；T3處理化能異養(yǎng)、光養(yǎng)和光異養(yǎng)等功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度高于其他處理。

圖6 基于FAPROTAX工具的細(xì)菌群落功能預(yù)測結(jié)果Fig.6 Prediction results of bacterial community function based on FAPROTAX

3 討論

有機(jī)肥施用作為烤煙生產(chǎn)的重要措施之一，其種類、數(shù)量對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性均會(huì)產(chǎn)生一定的影響。劉昌等[22]研究表明：有機(jī)肥和無機(jī)肥配施可以提高土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)；樊俊等[23]研究發(fā)現(xiàn)：施用腐熟有機(jī)肥可提高土壤微生物OTUs總量及群落多樣性和豐富度指數(shù)。本研究中，各有機(jī)肥處理根際土壤中細(xì)菌OTUs數(shù)量、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)較單施化肥均有所增加，說明增施有機(jī)肥有利于提高烤煙根際土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度，這與劉昌等[22]及樊俊等[23]的研究結(jié)果一致。其中，生物有機(jī)肥處理的細(xì)菌群落多樣性和豐富度高于其他處理，可能有以下兩方面的原因：一是生物有機(jī)肥的施入將細(xì)菌帶入土壤中；二是高C/N有機(jī)肥為土壤提供了更多的有機(jī)碳含量，從而提高了土壤細(xì)菌對(duì)碳源的利用能力，促進(jìn)細(xì)菌生長繁殖而增加其數(shù)量。王軍等[24]研究表明：施用C/N越高的有機(jī)肥導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)和水溶性碳含量相應(yīng)增加；焦曉光等[25]研究表明：土壤微生物量碳、基礎(chǔ)呼吸和細(xì)菌數(shù)量隨土壤有機(jī)質(zhì)含量的增加而增加。但是過高的C/N容易導(dǎo)致微生物與作物競爭土壤中氮素[26]，因此在施用該生物有機(jī)肥時(shí)需適當(dāng)調(diào)整氮肥用量。

高通量測序技術(shù)作為研究微生物多樣性的分子生物學(xué)手段，可檢測到更多低豐度的遺傳信息，能更深層次地揭示微生物群落結(jié)構(gòu)組成[27]。本研究利用高通量測序技術(shù)對(duì)烤煙根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌門、屬的分析發(fā)現(xiàn)：各處理均以變形菌門相對(duì)豐度最高，這與陳澤斌等[28]的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)：各增施有機(jī)肥處理根際土壤樣品鞘氨醇單胞菌屬、Bryobacter及芽單胞菌屬均有所增加，變形菌門中鞘氨醇單胞菌屬對(duì)芳香化合物具有高代謝能力[29]，酸桿菌門Bryobacter具有促進(jìn)土壤碳循環(huán)的作用[30]，芽單胞菌門芽單胞菌屬具有降解復(fù)雜的大分子有機(jī)化合物的作用[31]，這說明施用有機(jī)肥有利于土壤中鞘氨醇單胞菌屬、Bryobacter及芽單胞菌屬等碳循環(huán)功能細(xì)菌群落的富集。從PCA和UPGMA聚類結(jié)果也可看出：有機(jī)肥處理的根際土壤細(xì)菌群落組成及相對(duì)豐度在門水平上相似性較高，與單施化肥有較大差異。這可能是因?yàn)槭┯糜袡C(jī)肥均可提高土壤中有機(jī)物質(zhì)的含量，進(jìn)而促進(jìn)有機(jī)物降解功能細(xì)菌數(shù)量增加。各有機(jī)肥處理土壤樣品中放線菌門相對(duì)豐度較單施化肥處理有所降低，這與劉昌等[22]的研究結(jié)果一致，但與施河麗等[32]的研究結(jié)果不一致，這可能是由于有機(jī)肥施用改變了土壤的pH、氮素形態(tài)及養(yǎng)分含量，進(jìn)而影響土壤放線菌數(shù)量的變化。有研究表明：放線菌是一類喜中性偏堿環(huán)境的微生物，且數(shù)量與土壤中氮素形態(tài)及養(yǎng)分含量密切相關(guān)[33-34]，但有機(jī)肥施用對(duì)放線菌的具體影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

FAPROTAX是LOUCA等[21]為解析微生物群落功能于2016年創(chuàng)建的基于原核微生物分類的功能注釋數(shù)據(jù)庫。本研究發(fā)現(xiàn)：施用有機(jī)肥后，烤煙根際土壤中硝化功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度高于單施化肥處理，這與劉娟娟[35]的研究結(jié)果一致；其中，煙草專用有機(jī)肥與生物有機(jī)肥處理硝化功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度高于其他處理，這可能是因?yàn)檫@2種有機(jī)肥原料中含有活性較高的礦物源腐殖酸。有研究表明：褐煤和風(fēng)化煤等礦物源腐殖酸對(duì)土壤硝化作用具有明顯的促進(jìn)作用[36]。此外，煙草專用有機(jī)肥處理土壤發(fā)酵功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度、生物有機(jī)肥處理硝酸鹽還原功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度以及精制有機(jī)肥處理化能異養(yǎng)、光養(yǎng)和光異養(yǎng)功能的細(xì)菌群落相對(duì)豐度均高于其他處理，表明煙草專用有機(jī)肥處理更有利于促進(jìn)土壤碳氮代謝，生物有機(jī)肥處理更有利于促進(jìn)氮代謝，精制有機(jī)肥處理更有利于促進(jìn)碳代謝?；贔APROTAX工具可以預(yù)測土壤中已知功能細(xì)菌群落的相對(duì)豐度，而土壤中還有大量細(xì)菌功能未知，今后有必要繼續(xù)深入研究。

4 結(jié)論

本研究施用的生物有機(jī)肥、精制有機(jī)肥和煙草專用有機(jī)肥均有利于提高烤煙根際土壤細(xì)菌群落多樣性及特有細(xì)菌菌種數(shù)量。在土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成方面，煙草專用有機(jī)肥處理根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)豐度與生物有機(jī)肥處理相似，均表現(xiàn)為酸桿菌門、綠彎菌門及浮霉菌門更豐富，而精制有機(jī)肥處理以變形菌門更豐富；有機(jī)肥處理鞘氨醇單胞菌屬、黃色土源菌屬、Bryobacter和芽單胞菌屬等為主要優(yōu)勢細(xì)菌門的主要細(xì)菌屬，且均以煙草專用有機(jī)肥處理更豐富。在土壤細(xì)菌功能性方面，施用有機(jī)肥均有利于提高根際土壤中化能異養(yǎng)、發(fā)酵、硝化、光養(yǎng)和光異養(yǎng)等功能性細(xì)菌群落的相對(duì)豐度，其中，施用煙草專用有機(jī)肥處理發(fā)酵功能的細(xì)菌群落相對(duì)更豐富，施用生物有機(jī)肥處理硝酸鹽還原功能的細(xì)菌群落相對(duì)更豐富，施用精制有機(jī)肥處理化能異養(yǎng)及光養(yǎng)功能的細(xì)菌群落相對(duì)更豐富。整體而言，以施用煙草專用有機(jī)肥對(duì)烤煙根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響更為突出，有利于提升土壤細(xì)菌群落多樣性，促進(jìn)土壤碳氮代謝。