韓 昱，張立永 ，張富梅

(1.河北北方學院 實驗動物中心，河北 張家口 075000；2.河北北方學院 動物科技學院，河北 張家口 075000)

熱應(yīng)激是影響畜禽生產(chǎn)性能的重要因素[1-3]，可導致種畜禽繁殖性能下降[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)：熱應(yīng)激可顯著降低山羊干物質(zhì)采食量，影響其生產(chǎn)性能和乳品質(zhì)，使其瘤胃黏膜絨毛大面積萎縮、脫落和壞死，增加瘤胃黏膜屏障的通透性[7]；還會使睪丸細胞線粒體形態(tài)學發(fā)生改變，誘發(fā)細胞氧化損傷，進而可能影響生殖功能[8]。探索抗熱應(yīng)激措施，并研究其作用機制至關(guān)重要。畜禽發(fā)生熱應(yīng)激時，腎上腺發(fā)揮著核心作用，其分泌的皮質(zhì)醇(cortisol，CORT)是熱應(yīng)激不可或缺的激素[9]。因此，觀測腎上腺結(jié)構(gòu)及其分泌激素水平變化，有助于研究緩解種公兔熱應(yīng)激反應(yīng)的機制，為指導炎熱環(huán)境下種公兔飼養(yǎng)提供科學依據(jù)。

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是一種益生菌，可促進動物消化道有益菌生長，抑制有害菌增殖，調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡，增強消化功能，促進生長[10-14]；還可刺激動物免疫器官生長，激活淋巴細胞，提高機體免疫力[15-17]。鄧文等[18]研究發(fā)現(xiàn)：地衣芽孢桿菌可改善熱應(yīng)激下雞蛋品質(zhì)和提高產(chǎn)蛋率；宦海琳等[19]發(fā)現(xiàn)：仔豬受到脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)應(yīng)激后，利用地衣芽孢桿菌可提高其免疫力，增強腸黏膜抗氧化能力，減緩腸道損傷并修復腸道形態(tài)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：種公兔飼糧中添加適量地衣芽孢桿菌可降低由熱應(yīng)激引起的精子畸形率，提高精子密度和精子活力[20]。到目前為止，未見有關(guān)地衣芽孢桿菌對種公兔熱應(yīng)激下腎上腺結(jié)構(gòu)及其分泌皮質(zhì)醇影響的報道。本研究通過在熱應(yīng)激種公兔飼糧中添加地衣芽孢桿菌，觀察其對熱應(yīng)激種公兔腎上腺結(jié)構(gòu)的影響，測定血漿中CORT的變化，探究地衣芽孢桿菌緩解種公兔熱應(yīng)激機制，為炎熱季節(jié)種公兔的合理飼養(yǎng)提供科學依據(jù)，也為后續(xù)開發(fā)抗熱應(yīng)激營養(yǎng)素提供進一步的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

地衣芽孢桿菌活菌制劑購于北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司，其活菌含量2×1010CFU/g；塞北兔種公兔來自河北北方學院實驗動物中心。

1.2 試驗動物分組與飼養(yǎng)

1.2.1 種公兔選擇與分組

選取年齡相近、體況良好的塞北兔種公兔90只，隨機等分為3組，每組設(shè)置3個重復，每個重復10只。設(shè)常溫對照組(N組)、熱應(yīng)激組(H組)和熱應(yīng)激+地衣芽孢桿菌組(H+B組)。N組和H組飼喂基礎(chǔ)飼糧，H+B組飼糧為基礎(chǔ)飼糧+地衣芽孢桿菌1 000 mg/kg (前期研究確定的最佳添加劑量[7])。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

公兔自由采食和飲水，采用全自動智能控溫電加熱暖風機控溫。設(shè)置溫度N組為20～25 ℃；H組和H+B組模擬夏季溫度變化規(guī)律：12：00—16：00溫度控制在32～35 ℃，10：00—12：00和16：00—22：00溫度控制在28～30 ℃，22：00—10：00溫度控制在25～27 ℃。各組其他飼養(yǎng)環(huán)境相同，濕度均為50%～55%。預飼期7 d后轉(zhuǎn)為正式期飼喂30 d。

1.3 測定指標

1.3.1 血漿CORT含量

在試驗開始0 h、12 h、3 d、10 d、20 d和30 d，各組兔分別耳靜脈采血，制備血漿，采用放射免疫分析法測定血漿CORT含量，即利用全自動化學發(fā)光免疫分析儀(MAGLUMI X8)和皮質(zhì)醇檢測試劑盒(化學發(fā)光法)進行測定。

1.3.2 腎上腺指數(shù)

試驗結(jié)束后，各組兔空腹12 h，測定體質(zhì)量；麻醉固定，腹部解剖，無菌摘取腎上腺，稱量，計算腎上腺指數(shù)。腎上腺指數(shù)=腎上腺質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)。

1.3.3 腎上腺組織光鏡樣品制備及觀察

取部分腎上腺組織塊立即固定于4%甲醛磷酸緩沖液中(pH=7.2～7.4)；充分固定后，按常規(guī)方法脫水、透明、石蠟包埋，制作石蠟切片，HE染色后，用顯微鏡觀察，并采用YD300型數(shù)字攝像機及圖像處理系統(tǒng)分析腎上腺組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.4 腎上腺組織透射電鏡標本制備及觀察

另取腎上腺組織塊，用2.5%戊二醛固定24 h以上，用磷酸緩沖液漂洗，再用1%餓酸固定，用不同體積分數(shù)的乙醇脫水，然后包埋、固化，制成超薄切片；用3%醋酸鈾—枸櫞酸鉛雙染色，采用JEMCXⅡ型透射式電子顯微鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

測定數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0生物統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激種公兔腎上腺指數(shù)的影響

由表1可知：熱應(yīng)激組(H)腎上腺質(zhì)量和腎上腺指數(shù)極顯著高于常溫組(N)(P<0.01)；而熱應(yīng)激+地衣芽孢桿菌組(H+B)極顯著低于H組(P<0.01)，但仍高于N組。

表1 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激種公兔腎上腺指數(shù)的影響Tab.1 The effect of Bacillus licheniformis on the adrenal index of heat-stressed male rabbits

2.2 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激種公兔腎上腺組織結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 種公兔腎上腺組織結(jié)構(gòu)的變化

由圖1可知：光鏡下觀察，熱應(yīng)激組(H)種公兔腎上腺被膜厚度減小，為(50.70±2.98) μm，熱應(yīng)激+地衣芽孢桿菌組(H+B)為(104.30±12.30) μm，常溫對照組(N)為(146.90±15.81) μm。由圖2可知：N組、H+B組和H組的皮質(zhì)細胞團直徑分別為(20.70±2.91)、(16.30±2.58)和(13.30±1.34) μm；N組細胞團由3～9個低柱狀細胞和細胞索組成，基膜清晰完整，核仁明顯，染色較深，細胞團相挨緊湊，胞質(zhì)中略見嗜酸性脂滴；H+B組與H組相比，細胞團基膜邊緣較為完整，但略次于N組；H組中每個細胞中胞質(zhì)較多，胞膜輪廓不清，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化；細胞核H+B組較H組清晰，染色也略深；N組中腎上腺皮質(zhì)層束狀帶與球狀帶分界清晰，較球狀帶厚，成索狀排列，細胞索之間可見較窄的竇狀血管；H+B和H組細胞索分界不清晰，H組竇狀血管較H+B組增寬。

圖1 光鏡下觀察種公兔腎上腺被膜厚度的變化(HE，400×)Fig.1 Observation of changes in adrenal gland thickness of male rabbits under light microscope

圖2 光鏡下觀察種公兔腎上腺組織內(nèi)細胞團直徑變化(HE，400×)Fig.2 Observation of changes in cell cluster diameter in adrenal gland tissue of male rabbits under light microscope

2.2.2 腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的變化

由圖3可知：常溫對照組(N)公兔腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞，胞核圓，染色質(zhì)較少，核膜完整，核染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，線粒體呈圓形管狀結(jié)構(gòu)，不腫脹，嵴清楚，胞漿內(nèi)脂滴清晰，且豐富均勻；胞漿中含有大量的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體較為發(fā)達，有少量溶酶體。熱應(yīng)激時(H組)腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞胞膜不清，核異染色質(zhì)較多，且向核膜邊聚集，線粒體較少松散、嵴斷裂不清晰，出現(xiàn)明顯腫脹，空化明顯，脂質(zhì)顆粒減少或無，有的細胞脂滴呈空泡狀；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹模糊不清，有脂褐素和髓樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。熱應(yīng)激+地衣芽孢桿菌組(H+B)與H組相比，線粒體結(jié)構(gòu)較為完整，有輕微腫脹，脂滴相對較多，脂滴空泡狀相對較少，無出現(xiàn)脂褐素溶酶體，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模糊不清，異染色質(zhì)向核膜靠攏。

圖3 電鏡下種公兔腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞變化Fig.3 Changes of fascicular zone cells in the adrenal cortex of male rabbits under electron microscope

由圖4可知：常溫對照組(N)正常細胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量較為完整的線粒體顆粒，高爾基復合體不發(fā)達，胞核較大，染色質(zhì)分布均勻；熱應(yīng)激時(H組)髓質(zhì)細胞核明顯皺縮，染色質(zhì)凝聚，線粒體顆粒呈明顯排空狀態(tài)，且水腫明顯；熱應(yīng)激+地衣芽孢桿菌組(H+B)與H組相比，主要是線粒體顆粒相對較多，顆粒排空相對較少，線粒體出現(xiàn)較明顯腫脹。

圖4 電鏡下種公兔腎上腺髓質(zhì)細胞線粒體變化Fig.4 Mitochondrial changes of adrenal medullary cells of male rabbits under electron microscope

2.3 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激種公兔血漿CORT水平的影響

由表2可知：熱應(yīng)激12 h和3 d時，熱應(yīng)激組(H)與熱應(yīng)激+地衣芽孢桿菌組(H+B)血漿CORT含量均極顯著高于常溫對照組(N)(P<0.01)，但H+B組較H組上升緩慢；10 d時，H+B組和H組均呈現(xiàn)下降趨勢；至30 d時，H+B組趨向于N組(P>0.05)，而H組水平雖仍顯著高于N組和H+B組(P<0.05)，但較熱應(yīng)激初期明顯下降。

表2 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激種公兔血漿CORT水平的影響Tab.2 Effect of B.licheniformis on plasma CORT levels in heat stressed male rabbits nmol/L

3 討論

3.1 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激種公兔腎上腺指數(shù)及組織結(jié)構(gòu)的影響

腎上腺是動物應(yīng)激反應(yīng)的重要器官，其正常結(jié)構(gòu)是機體應(yīng)對熱應(yīng)激的保障，當動物受到應(yīng)激刺激時，下丘腦—腺垂體—腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)功能活動加強[9,21]。據(jù)研究報道，熱應(yīng)激可導致腎上腺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。王玨等[22]研究發(fā)現(xiàn)：熱應(yīng)激導致蛋雞分泌皮質(zhì)激素的腎間組織比例增大，但隨著熱應(yīng)激時間延長，腎間細胞出現(xiàn)萎縮、破碎和解體等現(xiàn)象；張樂萃等[23]也報道了類似結(jié)果。本研究呈現(xiàn)與上述結(jié)果相一致的現(xiàn)象，試驗30 d時，種公兔腎上腺質(zhì)量和腎上腺指數(shù)均極顯著增加。光鏡下觀察，熱應(yīng)激組腎上腺被膜厚度降低，細胞團直徑減??；超微結(jié)構(gòu)顯示：皮質(zhì)束狀帶細胞中空化明顯，脂質(zhì)顆粒減少，脂滴有時呈空泡狀，線粒體明顯腫脹，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹模糊不清。分析其原因，是長期熱應(yīng)激環(huán)境下促腎上腺皮質(zhì)激素(adreno-cortico-tropic-hormone，ACTH)反復刺激腎上腺細胞所致。ACTH的作用是促進腎上腺皮質(zhì)增生，對維持腎上腺皮質(zhì)正常結(jié)構(gòu)以及糖皮質(zhì)激素的合成和分泌具有重要作用[9]。劉法東等[24]研究表明：熱應(yīng)激可以造成大鼠血清ACTH水平顯著升高，且發(fā)現(xiàn)熱暴露組大鼠較室溫對照組腦垂體和腎上腺相對質(zhì)量增加。但有研究發(fā)現(xiàn)：HPA軸對應(yīng)激的急性反應(yīng)通常有適應(yīng)性，即HPA軸上的激素適度分泌將有利于抵抗應(yīng)激刺激，但過度或長時間被激活會對機體產(chǎn)生有害影響[25]。本研究從微觀上也證實了持續(xù)熱應(yīng)激可對種公兔腎上腺結(jié)構(gòu)造成損傷。

趙善廷等[26]研究發(fā)現(xiàn)：溶酶體、脂滴、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體與類固醇激素的合成緊密相關(guān)，本研究中腎上腺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化，影響了皮質(zhì)激素的分泌，這也解釋了試驗中熱應(yīng)激中后期機體CORT呈現(xiàn)下降的原因。這必然會導致種公兔體內(nèi)物質(zhì)代謝紊亂，免疫力降低，蛋白質(zhì)分解加強，激素合成受阻，生長遲緩，甚至出現(xiàn)負增長，這可能是熱應(yīng)激下種公兔生殖機能下降的重要原因[20]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)：熱應(yīng)激使種公兔腎上腺髓質(zhì)細胞核明顯皺縮，腎上腺素顆粒呈明顯排空狀態(tài)，線粒體腫脹。腎上腺髓質(zhì)結(jié)構(gòu)變化會影響兒茶酚胺類激素分泌，加重熱應(yīng)激反應(yīng)。而熱應(yīng)激+地衣芽孢桿菌組試驗結(jié)果顯示：可緩解熱應(yīng)激引起腎上腺被膜降低速度，增加皮質(zhì)細胞核直徑，保持細胞團基膜邊緣的整齊度和細胞核的完整，降低腎上腺髓質(zhì)細胞胞質(zhì)和線粒體空泡化程度。這說明地衣芽孢桿菌可以明顯減輕熱應(yīng)激對腎上腺結(jié)構(gòu)的損傷程度，使之趨于正常水平。

目前，益生菌對腎上腺及其他腺體結(jié)構(gòu)和分泌功能的作用機制尚未見報道，有待深入研究。據(jù)報道：存在多種因素影響HPA 軸的功能，其中腸道微生物群是重要影響因素。腸道微生物群失調(diào)可能影響機體代謝功能，進而影響大腦發(fā)育，特別是 HPA 軸的發(fā)育[27]。有研究發(fā)現(xiàn)：日糧中添加益生菌可以增加熱應(yīng)激條件下動物盲腸有益菌乳酸桿菌的數(shù)量，減少有害菌大腸桿菌的數(shù)量[28]，有利于調(diào)節(jié)腎上腺功能。另外，DENG等[29]報道：在熱應(yīng)激母雞飼糧中添加地衣芽孢桿菌，能增加腸道上皮淋巴細胞和IgA分泌細胞的數(shù)量，提高機體免疫力；彭承英[30]發(fā)現(xiàn)：飼糧中添加益生菌可以提高熱應(yīng)激肉雞天然免疫基因表達，改善其抗氧化能力。由此可見，在熱應(yīng)激條件下，益生菌對提高機體免疫及抗氧化性能也有顯著作用，這可能是本試驗中地衣芽孢桿菌能改善熱應(yīng)激下腎上腺結(jié)構(gòu)與分泌功能的間接原因。

3.2 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激種公兔血漿CORT的影響

腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的糖皮質(zhì)激素是機體應(yīng)激反應(yīng)的主要激素[9]，去除腎上腺的動物抗應(yīng)激能力顯著下降，當遭受應(yīng)激刺激時往往容易引起死亡[31]。有報道稱熱應(yīng)激可導致腎上腺皮質(zhì)釋放CORT增多[32]；鄧文等[18]也報道：蛋雞熱應(yīng)激6和12 d時，血清CORT水平極顯著高于對照組，飼喂地衣芽孢桿菌可顯著改善這種現(xiàn)象，使CORT水平與對照組無明顯差異。本研究結(jié)果總體呈現(xiàn)出與上述報道相一致的規(guī)律，即熱應(yīng)激組在試驗初期(12 h和3 d) CORT水平表現(xiàn)顯著升高，但從10 d后血漿中CORT含量開始下降，直至30 d時雖高于常溫組和熱應(yīng)激+地衣芽孢桿菌組，但比熱應(yīng)激初期明顯降低。分析原因認為：初期由于熱應(yīng)激造成ACTH分泌增多，引起腎上腺皮質(zhì)分泌CORT相應(yīng)增多，這是腎上腺皮質(zhì)出現(xiàn)代償性分泌的結(jié)果，使機體積極應(yīng)對熱應(yīng)激；但熱應(yīng)激中后期，腎上腺皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，分泌功能降低，CORT分泌減少，機體抗熱應(yīng)激能力下降，機能表現(xiàn)衰退。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)：熱應(yīng)激可導致種公兔精液品質(zhì)降低，甲狀腺及甲狀旁腺結(jié)構(gòu)受損，影響其生殖功能[20,33]。

本研究在種公兔飼糧中添加地衣芽孢桿菌后，雖在試驗初(0～3 d) CORT水平有升高現(xiàn)象，可能是地衣芽孢桿菌還未很好地發(fā)生作用，但中后期(10 d) CORT水平開始下降，至試驗20 d后逐漸趨于正常，與常溫對照組差異不顯著。這從激素水平方面進一步說明地衣芽孢桿菌在緩解種公兔熱應(yīng)激中的作用。結(jié)果提示：在種兔養(yǎng)殖實踐中，地衣芽孢桿菌應(yīng)在夏季高溫來臨前10～20 d即開始添加使用，可達到預期效果。課題組前期試驗數(shù)據(jù)也表明：日糧中添加適量地衣芽孢桿菌可以緩解熱應(yīng)激導致的種公兔生殖機能下降以及甲狀腺和甲狀旁腺結(jié)構(gòu)損傷[20,33]。因此，地衣芽孢桿菌的應(yīng)用對改善炎熱夏季種公兔生殖性能、促進養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展起到積極作用。

4 結(jié)論

熱應(yīng)激可導致種公兔腎上腺結(jié)構(gòu)損傷，造成CORT水平在初期顯著升高，后期明顯下降，飼糧中添加適量地衣芽孢桿菌可以使這些變化得到顯著改善。