程美玲，黃 鑫，安曈昕，范江平，李建賓，希從芳

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)健康長(zhǎng)壽的需求日益增長(zhǎng)，因此，研發(fā)抗氧化、抗疲勞食品及保健品等已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[1-2]?；ㄇ嗨厥且活惙植荚谧匀唤缰械母呱仡慄S酮，是一種天然強(qiáng)抗氧化劑，它除了可以賦予鮮花、水果和蔬菜紅色、紫色和藍(lán)色外，還可以促進(jìn)機(jī)體健康[3]。已有研究表明：紫山藥花青素具有抗腫瘤活性[4]，黑豆皮[5]和紫薯[6]花青素具有降血脂及抗氧化效果，黑枸杞花青素具有抗疲勞功能[7-8]，野葛花[9]、藍(lán)莓[10]和葡萄籽[11]花青素對(duì)小鼠具有抗疲勞及體內(nèi)抗氧化作用，藍(lán)莓花青素還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-13]。

玫瑰(Rosa rugosa)，又稱刺玫花、刺客、穿心玫瑰，為薔薇科薔薇屬多年生灌木。云南氣候溫和，適宜藥用玫瑰生長(zhǎng)發(fā)育，其產(chǎn)量高、品質(zhì)好、花期長(zhǎng)，已成為中國(guó)藥用玫瑰主產(chǎn)區(qū)。玫瑰花瓣中不僅富含維生素C和維生素E等多種維生素以及檸檬酸和蘋果酸等有機(jī)酸，而且還富含花青素，但鮮有關(guān)于藥用玫瑰花青素的研究報(bào)道。鑒于此，本研究通過給小鼠灌服玫瑰花青素提取物后，測(cè)定小鼠負(fù)重游泳時(shí)間及抗疲勞和抗氧化相關(guān)指標(biāo)，探討玫瑰花青素抗疲勞和抗氧化的功效，旨在為云南藥用玫瑰花青素功效的深入研究及系列產(chǎn)品的研發(fā)和應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玫瑰花青素：由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制。試驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)，健康雄性昆明種小白鼠40只，體質(zhì)量 (20±2) g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，許可證號(hào)：SCXK (滇)K2015-0002。

1.2 試劑

尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血乳酸(blood lactic acid，BLA)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxide dismutase，GSH-Px)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及灌胃

將適應(yīng)7 d后的40只健康雄性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，即對(duì)照組(蒸餾水，20 mL/kg)、玫瑰花青素低劑量組(100 mg/kg)、中劑量組(150 mg/kg)和高劑量組(200 mg/kg)。每天定時(shí)灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～22 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。試驗(yàn)期間小鼠自由采食和飲水。

1.3.2 負(fù)重游泳時(shí)間測(cè)定

末次給予玫瑰花青素灌胃30 min 后，小鼠尾根負(fù)荷5%體質(zhì)量的鉛皮，然后置小鼠于游泳箱中，水溫(25±0.5) ℃，水深大于25 cm，記錄小鼠從開始游泳至沉于水面下10 s后不能浮出水面的時(shí)間，即為力竭時(shí)間[14]，以客觀地反映其運(yùn)動(dòng)疲勞的程度[15]。

1.3.3 抗疲勞和抗氧化生化指標(biāo)測(cè)定

在小鼠負(fù)重游泳休息30 min后，摘除眼球采血。血液在4 ℃下3 000 r/min離心20 min，分離血清，-80 ℃以下保存?zhèn)溆?；將采血后的小鼠立即處死，摘取肝臟，用冰生理鹽水將肝臟制成10%的勻漿，在4 ℃下5 000 r/min離心10 min，收集上清液，-80 ℃以下保存?zhèn)溆谩０凑崭髟噭┖姓f明書測(cè)定BUN、BLA和MDA的含量、LDH、T-SOD和GSH-Px的活性以及T-AOC等指標(biāo)。

1.3.4 抗氧化與抗疲勞的相關(guān)性分析

以低、中、高3個(gè)劑量組小鼠血清中的TAOC為橫坐標(biāo)，分別以LDH活性以及BUN和BLA含量為縱坐標(biāo)，繪制T-AOC與LDH、BUN、BLA之間的關(guān)系圖，以分析抗氧化與抗疲勞的相關(guān)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理分析，結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。將3個(gè)不同劑量組分別與對(duì)照組進(jìn)行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰花青素對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

由表1可知：與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組的小鼠負(fù)重游泳時(shí)間都極顯著增加(P<0.01)；與低劑量組相比，中、高劑量組的小鼠負(fù)重游泳時(shí)間極顯著增加(P<0.01)；與中劑量組相比，高劑量組的小鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著增加(P<0.05)。說明玫瑰花青素能顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，有效緩解運(yùn)動(dòng)疲勞；在一定范圍內(nèi)，小鼠負(fù)重游泳時(shí)間與玫瑰花青素?cái)z入量呈劑量依賴關(guān)系。

表1 玫瑰花青素對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響Tab.1 Effects of rose anthocyanin on the swimming time with load in mice

2.2 玫瑰花青素對(duì)小鼠血液中BLA和BUN含量及LDH活性的影響

由表2可知：與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組小鼠血液中BLA含量均極顯著降低(P<0.01)，分別降低17.25%、28.11%和41.44%；且隨著玫瑰花青素劑量的增加，BLA含量極顯著降低(P<0.01)。與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組小鼠血液中的BUN含量分別顯著降低11.84%、21.32%和33.96% (P<0.01或P<0.05)；且隨著玫瑰花青素劑量的增加，BUN含量降低。與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組LDH活性均極顯著升高(P<0.01)，分別升高13.24%、42.34%和68.87%；且隨著玫瑰花青素劑量的增加，LDH活性極顯著升高(P<0.01)。表明玫瑰花青素降低了小鼠運(yùn)動(dòng)后血液中BLA和BUN含量，增加LDH活性，可有效緩解運(yùn)動(dòng)時(shí)的疲勞。

表2 玫瑰花青素對(duì)小鼠血液中BLA和BUN含量及LDH活性的影響Tab.2 Effects of rose anthocyanin on the contents of BLA and BUN,and the activity of LDH in blood of mice

2.3 玫瑰花青素對(duì)小鼠血清和肝臟中MDA含量、GSH-Px和T-SOD活性及T-AOC的影響

2.3.1 對(duì)小鼠血清中相關(guān)指標(biāo)的影響

由表3可知：與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組小鼠血清中的MDA含量分別降低9.67%、15.31%和15.65%，其中，中、高劑量組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)；與低劑量組相比，中、高劑量組MDA含量顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比，低、中劑量組小鼠血清中的T-AOC水平顯著增加(P<0.05)，高劑量組T-AOC水平極顯著增加(P<0.01)；與低劑量組相比，高劑量組T-AOC水平顯著增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比，低劑量組小鼠血清中的GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，中、高劑量組GSH-Px活性極顯著升高(P<0.01)；與低劑量組相比，中、高劑量組GSH-Px活性極顯著升高(P<0.01)。與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組小鼠血清中的T-SOD活性極顯著升高(P<0.01)；與低劑量組相比，中、高劑量組的T-SOD活性極顯著升高(P<0.01)。

2.3.2 對(duì)小鼠肝臟中相關(guān)指標(biāo)的影響

由表3還可知：與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組小鼠肝臟中的MDA含量均極顯著降低(P<0.01)，且高劑量組的MDA含量均極顯著低于低、中劑量組(P<0.01)。與對(duì)照組相比，低、中劑量組小鼠肝臟中T-AOC水平顯著升高(P<0.05)；且隨著玫瑰花青素劑量的增加，T-AOC水平顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與對(duì)照組相比，低、中劑量組小鼠肝臟中的GSH-Px活性顯著增加(P<0.05)，高劑量組的GSH-Px活性極顯著增加(P<0.01)；高劑量組的GSH-Px活性顯著高于低、中劑量組(P<0.05)；但低、中劑量組的GSH-Px活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組小鼠肝臟中T-SOD活性均極顯著增加(P<0.01)；且隨著玫瑰花青素劑量的增加，T-SOD活性極顯著升高(P<0.01)。

表3 玫瑰花青素對(duì)小鼠血液和肝臟中部分生化指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of rose anthocyanin on some biochemistry indexes in serum and liver of mice

以上結(jié)果說明：玫瑰花青素能有效降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血清和肝臟中的MDA含量、增加GSHPx和T-SOD活性，總抗氧化力提高，清除過氧化物的能力增強(qiáng)；抗氧化能力與玫瑰花青素灌胃劑量存在依賴關(guān)系。

2.4 抗疲勞與抗氧化的相關(guān)性分析

由圖1可知：小鼠血液中LDH活性隨T-AOC水平的提升而增加，二者之間成正比關(guān)系 (y=488.02x+1 096.330，R2=0.217)；BUN和BLA含量隨T-AOC水平的提升而降低，即成反比關(guān)系 (y=-0.477x+16.020，R2=0.037；y=-0.946x+18.617，R2=0.152)?？梢?，灌胃玫瑰花青素小鼠血液中T-AOC越強(qiáng)，小鼠運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生并累積的BUN和BLA越少，說明玫瑰花青素可以有效地緩解運(yùn)動(dòng)疲勞。

圖1 T-AOC與LDH活性及BUN和BLA含量的相關(guān)性Fig.1 Correlations between T-AOC and LDH activity,and the content of BUN and BLA

3 討論

當(dāng)機(jī)體生理過程不能維持或其機(jī)能在某一特定的水平不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度時(shí)即為疲勞?？蛊诎ㄑ泳徠诘漠a(chǎn)生和/或加速疲勞的消除[16]。機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)，體內(nèi)糖類分解供能加速，供氧不足導(dǎo)致糖無(wú)氧酵解產(chǎn)生乳酸，血液中乳酸(BLA)含量升高，使肌肉中H+濃度上升，pH值下降，運(yùn)動(dòng)能力下降，產(chǎn)生疲勞[17]；機(jī)體能量代謝降低時(shí)，蛋白質(zhì)及氨基酸的分解代謝加強(qiáng)，尿素生成增多，使血清尿素氮(BUN)含量升高[18]，運(yùn)動(dòng)耐力下降。本研究通過灌胃玫瑰花青素小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)玫瑰花青素能延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間，提高運(yùn)動(dòng)耐力，增強(qiáng)血液中LDH活性，加快乳酸分解，降低血液中BUN和BLA含量，延緩疲勞。劉協(xié)等[11]研究發(fā)現(xiàn)：葡萄籽提取物原花青素能降低小鼠運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生的乳酸；劉岱琳等[19]發(fā)現(xiàn)：復(fù)方低聚原花青素能有效減少尿素氮含量；王紫玉等[20]研究發(fā)現(xiàn)：藍(lán)莓花青素能有效延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間；傅科其[21]研究發(fā)現(xiàn)原花青素能延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)論基本一致，說明玫瑰花青素具有抗疲勞功效。

超氧陰離子自由基產(chǎn)生和血漿脂質(zhì)過氧化物增加是運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生的重要原因[22-23]。運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生過量的自由基會(huì)攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸產(chǎn)生丙二醛，并破壞生物膜正常的生理功能，若不及時(shí)消除，將會(huì)影響物質(zhì)代謝和酶促反應(yīng)過程[24]。因此，從體外補(bǔ)給具有抗氧化功效的物質(zhì)，可以提高機(jī)體抗氧化酶的活力，及時(shí)清除過量的超氧陰離子自由基，達(dá)到抗疲勞的效果。玫瑰花中含有豐富的花青素，不僅具有明顯的清除自由基能力，還對(duì)體內(nèi)各種抗氧化酶具有促進(jìn)和激活作用[25]。本研究表明：灌服玫瑰花青素后，小鼠血清和肝臟中抗氧化酶T-SOD和GSHPx活性增加，MDA含量降低，T-AOC增大，說明玫瑰花青素具有顯著的抗氧化和抗疲勞作用。通過抗氧化性與抗疲勞性相關(guān)性的分析可知：抗氧化能力與抗疲勞效果呈正相關(guān)關(guān)系。姚翠育[26]采用DPPH法測(cè)定純化得到的玫瑰花原花青素產(chǎn)品抗氧化活性，表明原花青素的抗氧化能力強(qiáng)于維生素C；李鵬飛[27]提取甘肅苦水玫瑰花抗氧化成分進(jìn)行體外抗氧化能力分析，表明苦水玫瑰干花瓣抗氧化物質(zhì)具有良好的DPPH·和羥自由基的清除效果，且隨著苦水玫瑰花瓣提取物添加量的增加，豬油自動(dòng)氧化被逐漸抑制；高璐等[28]研究發(fā)現(xiàn)：葡萄籽原花青素提取物對(duì)衰老模型小鼠具有抗氧化作用；張卓睿等[10]通過灌胃小鼠藍(lán)莓花青素提取物研究其對(duì)小鼠抗疲勞及抗氧化功效，結(jié)果表明其抗疲勞和抗氧化作用顯著；羅文娟[29]研究發(fā)現(xiàn)：黑果枸杞原花青素能夠抑制紫外照射聯(lián)合皮下注射D-半乳糖對(duì)小鼠皮膚的氧化損傷，并下調(diào)半胱氨酸蛋白酶-3和半胱氨酸蛋白酶-9表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，延緩皮膚衰老。本研究體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，但抗氧化和抗疲勞的生理生化機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。本研究為闡釋玫瑰花青素抗疲勞和抗氧化功效提供理論依據(jù)，也為藥用玫瑰花系列產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

玫瑰花青素能有效延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，使小鼠體內(nèi)的乳酸脫氫酶、總超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性增強(qiáng)，總抗氧化能力提升，使丙二醛、尿素氮和血乳酸的含量降低，具有抗疲勞和抗氧化功效；抗疲勞和抗氧化功效與玫瑰花青素灌胃劑量存在依賴關(guān)系。