賀軍與，鐘 偉，陳云瓊，熊靜蕾，王衛(wèi)斌，蔣亞麗，施輝蒙，陳升位

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

大麥成熟籽粒中的黃酮類化合物由苯丙烷代謝途徑合成，具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病和抑制癌細(xì)胞生長等藥用和保健價值[1-6]。不同學(xué)者采用紫外可見分光光度法檢測了大麥成熟籽粒中黃酮類化合物的總含量[7-9]，基于薄層層析和高效液相色譜技術(shù)鑒定了大麥籽粒中的槲皮素、楊梅素和山奈酚等黃酮類化合物，并測定了部分化合物的含量[7,10-14]。在大麥不同成熟籽粒間黃酮類化合物總含量[4,7]和特定化合物含量均存在明顯差異[7,10-12,15-16]，如云啤2號、功麥3號和北青7號等成熟籽粒間黃酮類化合物的含量差異高達(dá)3倍以上。不僅如此，相同基因型的成熟籽粒中不同化合物的含量也不同[7,10-12]。有研究表明：環(huán)境因素可影響大麥成熟籽粒黃酮類化合物的含量，而大麥基因型是導(dǎo)致該差異的主要因素[8,13-14,16-18]，并將花色苷含量QTLs定位于Chr1H、Chr2H和Chr4H等6條染色體上[8,17]。與銀杏、水稻和燈盞花等植物相比，已報道的大麥成熟籽粒黃酮類化合物還較少，特別是對二氫楊梅素、曲克蘆丁和染料木苷等化合物的含量特性缺乏認(rèn)識[1,18-19]。因此，本研究以8種遺傳穩(wěn)定、籽粒顏色不同的大麥品種(或品系)為材料，采用高效液相色譜鑒定其成熟籽粒中苯丙烷代謝分支節(jié)點上的15種化合物，并檢測不同化合物的含量，分析不同材料成熟籽粒間黃酮類化合物的含量差異；基于含量差異，篩選15個化合物代謝特性的極端差異材料，為研究大麥成熟籽粒黃酮類化合物的積累機(jī)制和大麥品種的遺傳改良提供理論依據(jù)和試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

8種材料均為遺傳穩(wěn)定的品種或品系，其中3種為地方品種，其余為育成品種(或品系)，其基本特性見表1。所有材料由本課題組繁育并保存。

表1 試驗材料及其基本特性Tab.1 The materials used in the study and the basic characteristics

1.2 材料繁育

試驗材料均種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)試驗農(nóng)場，播種期為2018年11月9日。隨機(jī)排列，每個品系種植6行，每行20株，行距20 cm，株距5 cm，重復(fù)3次。其他管理措施與常規(guī)大田生產(chǎn)一致。

1.3 黃酮類化合物提取與純化

在完熟期收獲8種材料的成熟籽粒，用錫箔紙包裹后裝入牛皮紙袋置于-80 ℃冰箱儲存、備用。采用LGJ-12C真空冷凍干燥機(jī)干燥成熟籽粒，用AM600研磨儀將干燥的籽粒碾磨5 min至粉末狀。等量混合3個重復(fù)的成熟籽粒粉末，分別構(gòu)建不同材料的樣品池，每個樣品池稱取2.0 g粉末溶于20.0 mL 70%的甲醇溶液，采用YQ-1001A超聲波清洗儀輔助處理浸提液30 min，取上清液。采用0.22 μm的微孔濾膜過濾，純化提取物。

1.4 高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)品制作

將二氫楊梅素、曲克蘆丁和染料木苷等15種標(biāo)準(zhǔn)品(表2)溶入70%甲醇，分別配制100 mg/L母液，置于4 ℃暗儲存，備用?；?5種標(biāo)準(zhǔn)品母液分別配制1、2、4、8、16、32、64和128 μg/mL的工作液以及與15種標(biāo)準(zhǔn)品不同質(zhì)量濃度的混合工作液，并采用 Agilent 1200 Infinity Series高效液相色譜儀(產(chǎn)地：德國)對其滯留時間及色譜峰進(jìn)行高效液相色譜檢測。色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(5 μm×4.6 mm×150 mm)；流動相：A相為0.1%的冰醋酸，B相為乙腈；洗脫梯度：0 min，A∶B (V/V)=95∶5，60.0 min，A∶B (V/V)=5∶95，60.1 min，A∶B (V/V)=95∶5，65.0 min，A∶B (V/V)=95∶5；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長：280 nm。重復(fù)試驗3次。基于SPSS 20.0中回歸模塊默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與質(zhì)量濃度的回歸方程(相關(guān)系數(shù)R≥0.99)。

表2 檢測的15種化合物Tab.2 The 15 compounds of tested

1.5 黃酮類化合物及其含量差異分析

根據(jù)出峰時間定性鑒定黃酮類化合物，利用標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與質(zhì)量濃度的回歸方程計算樣品質(zhì)量濃度，并將其轉(zhuǎn)換為含量?；赟PSS 20.0中方差和多重比較模塊默認(rèn)參數(shù)分析化合物含量差異，顯著和極顯著水平分別為5%和1%。

2 結(jié)果與分析

2.1 可有效檢測的黃酮類化合物

由表3可知：在Bowman、光頭大麥和云南高世代成熟籽粒中檢測到9種化合物，Morex成熟籽粒中檢測到12種化合物，淳安六棱胭脂大麥和定海紅綠黃成熟籽粒中檢測到11種化合物，紫青稞成熟籽粒中檢測到10種化合物，北青7號成熟籽粒中僅檢測到7種化合物。其中，曲克蘆丁在8種材料中均檢測到，其余化合物只在部分材料中檢測到。

表3 8種成熟籽粒中檢測到的黃酮類化合物Tab.3 The flavonoids compound detected in eight barley mature grains

2.2 黃酮類化合物的含量差異分析

2.2.1 15種化合物總含量的差異分析

在8種材料的成熟籽粒中，15種化合物的總含量變幅為(40.31±3.92)～(319.22±10.69) μg/g。多重比較結(jié)果(圖1)表明：紫青稞成熟籽粒的化合物總含量極顯著或顯著高于其他7種材料的化合物總含量。Morex、光頭大麥和淳安六棱胭脂大麥3個品種間化合物總含量無顯著差異，但極顯著或顯著高于Bowman、定海紅綠黃、云南高世代和北青7號的化合物總含量；定海紅綠黃成熟籽粒的化合物總含量極顯著高于Bowman和北青7號，且顯著高于云南高世代的化合物總含量；Bowman、北青7號和云南高世代3種材料成熟籽粒間的化合物總含量無顯著差異。

圖1 8種大麥成熟籽粒中黃酮類化合物總含量Fig.1 The total content of flavonoids compounds in eight eight barley mature grains

2.2.2 不同大麥成熟籽粒間化合物含量的差異分析

由表4可知：在8種大麥成熟籽粒中，黃豆黃素、槲皮素、柚皮素查爾酮、芹菜素、芒柄花素和白楊素的含量在Morex中最高，二氫楊梅素、曲克蘆丁和染料木苷的含量在淳安六棱胭脂大麥中最高，木犀草素、山奈酚和山奈素的含量在紫青稞中最高，柚皮素和二氫槲皮素的含量在定海紅綠黃和云南高世代中最高。

多重比較結(jié)果(表4)表明：黃色籽粒間共有9種化合物的含量存在差異，其中芹菜素和白楊素在3個品種間達(dá)到顯著或極顯著差異，二氫楊梅素和槲皮素等11種化合物在Bowman與光頭大麥間無顯著差異，二氫槲皮素含量在Morex與光頭大麥間無差異，楊梅素含量在Bowman與Morex間無差異；紫色籽粒間除白楊素外其余14種化合物的含量均有差異，芒柄花素和山奈酚的含量在3種材料間差異極顯著，其余化合物的含量在其中2種材料間差異顯著或極顯著。

表4 不同大麥成熟籽粒中15種黃酮化合物的平均含量及其差異Tab.4 The mean contents of 15 flavonoids in mature grains of different barley and difference between the mean contents μg/g

由表4還可知：黃色籽粒與紫色籽粒間差異化合物最多為12種(Morex和紫青稞)，最少為3種(Bowman和定海紅綠黃)；與黑色籽粒間差異化合物最多為10種(Morex和云南高世代)，最少為2種(Bowman和云南高世代)；與藍(lán)色籽粒間差異化合物最多為12種(Morex和北青7號)，最少為3種(光頭大麥和北青7號)。紫色籽粒與黑色籽粒間差異化合物最多為9種(淳安六棱胭脂大麥和云南高世代)，最少為4種(定海紅綠黃和云南高世代)；與藍(lán)色籽粒間差異化合物最多為10種(淳安六棱胭脂大麥和北青7號)，最少為4種(紫青稞和北青7號)。黑色籽粒與藍(lán)色籽粒間僅木犀草素和芹菜素的含量差異達(dá)顯著水平，其余化合物的含量均無差異。

3 討論

本研究采用高效液相色譜檢測了8種大麥成熟籽粒的二氫楊梅素、曲克蘆丁和染料木苷等15種化合物，其含量變幅為0～(223.41±8.44) μg/g。雖然已有報道大麥籽粒中兒茶素、楊梅素和山奈酚等化合物的含量，但鮮有染料木苷、曲克蘆丁和黃豆黃素等7種化合物的含量報道[1-2,7-12,18-19]。楊曉夢等[8]和周明等[18]檢測了25種大麥材料成熟籽粒的9種黃酮類化合物，發(fā)現(xiàn)其含量變幅為0.00～(348.88±3.80) μg/g，其中大多數(shù)化合物的含量變幅與本研究報道的基本一致。在不同成熟籽粒中可有效檢測到15種化合物，表明大麥籽粒具有合成相應(yīng)化合物的有效代謝途徑。不同材料的成熟籽粒間可有效檢測的共有化合物明顯不同，在Morex與淳安六棱胭脂大麥、Morex與定海紅綠黃、淳安六棱胭脂大麥與定海紅綠黃成熟籽粒中可檢測到9種共有化合物，但在Morex與光頭大麥、Morex與北青7號及光頭大麥與北青7號等6對成熟籽粒間僅能檢測到5種共有化合物。從含量來看，在不同成熟籽粒間特定化合物的含量也存在較大差異，如淳安六棱胭脂大麥成熟籽粒中曲克蘆丁和染料木苷的含量極顯著高于其他14種大麥成熟籽粒。

不同顏色的多對成熟籽粒(黃色籽粒與紫色籽粒)間與相同顏色(黃色或紫色)籽粒相比差異化合物偏少。育成品種籽粒和地方品種籽粒相比，育成品種與地方品種的多對籽粒間差異化合物也偏少。因此，15種化合物在不同成熟籽粒間的代謝互補(bǔ)性與籽粒顏色(黃色或紫色)和品種屬性(育成品種或地方品種)沒有明顯的關(guān)聯(lián)性。作者認(rèn)為：可能是代謝酶基因的中性突變削弱了相同顏色、育成品種或地方品種成熟籽粒間15種化合物的代謝關(guān)聯(lián)性。在8種成熟籽粒中，Morex與紫青稞成熟籽粒間僅有6種共有化合物，Morex與北青7號成熟籽粒間僅有5種共有化合物，且共有化合物的含量存在明顯差異(如楊梅素、柚皮素和山奈酚等)，其中楊梅素和山奈酚在材料間的含量差異大于謝文英等[10]、ABDEL-AAL等[19]和余春磊等[20]的研究，說明上述2對大麥材料的籽粒間15種化合物的代謝互補(bǔ)性較高。Morex、紫青稞和北青7號屬不同的生態(tài)類型，其中北青7號和紫青稞是云南省迪慶州的主推青稞品種，Morex是國外啤酒大麥育成品種，3種材料的農(nóng)藝性狀間遺傳互補(bǔ)性也較高，如北青7號和紫青稞屬裸大麥，而Morex屬皮大麥。因此，上述材料可用于大麥成熟籽粒黃酮類化合物的積累機(jī)制以及保健大麥育種等的研究。

4 結(jié)論

本研究8種大麥材料成熟籽粒中可有效檢測的化合物為7～12種，其中曲克蘆丁在所有材料中均檢測到。材料間15種化合物總含量差異顯著或極顯著，黃色籽粒間9種化合物的含量差異顯著或極顯著，紫色籽粒間除白楊素外其余14種化合物的含量差異顯著或極顯著，不同顏色的籽粒間差異化合物為2～12種。研究結(jié)果對解析大麥成熟籽粒黃酮類化合物的積累機(jī)制具有重要的理論意義。