藍海琴，朱婷婷，李旭麗，鄭星耀，許佳華，賴勇勇，朱斐

(浙江農(nóng)林大學 動物科技學院動物醫(yī)學院，浙江 杭州 311300)

白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)引發(fā)的白斑綜合征是對甲殼動物具有較高致死率，并且具有很強傳染性的疾病[1]，嚴重威脅著世界上經(jīng)濟蝦類養(yǎng)殖的安全。自從1993年我國暴發(fā)此病以來，蝦類養(yǎng)殖業(yè)受到沉重打擊，幾乎所有養(yǎng)殖蝦類皆可被感染。早期WSSV的毒力較強，被感染的蝦3～10 d內(nèi)死亡率可達100%[2]，但是近年來該病毒發(fā)生了較大程度的變異，更多呈現(xiàn)出潛伏感染的趨勢。克氏原螯蝦的養(yǎng)殖價值可觀，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展日益蓬勃，但由于養(yǎng)殖水體出現(xiàn)污染、養(yǎng)殖密度不斷提高以及飼料污染等原因[1-3]，淡水養(yǎng)殖的克氏原螯蝦也開始流行WSSV。本研究通過獲取浙江省各個地區(qū)克氏原螯蝦的WSSV檢出率及病毒拷貝數(shù)，研究影響浙江省克氏原螯蝦WSSV病毒檢出率及病毒拷貝數(shù)的因素，為養(yǎng)殖提供一些可行性建議。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用克氏原螯蝦采購自杭州、湖州、溫州、麗水4地的養(yǎng)殖場。每月各地各采樣15份，5個月共75份螯蝦樣本。聚合酶鏈式反應(PCR)擴增所用引物等由上海生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 WSSV的PCR檢測

病毒DNA根據(jù)試劑盒操作步驟進行提取，提取出的DNA樣品利用引物(Forward：5′-CTTTCAC TCTTTCGGTCGTG-3′，Reverse：5′-TTCTGCCCCAC AGTCACTTC-3′)進行PCR反應擴增囊膜蛋白VP28基因片段。PCR反應體系：DNA模板(WSSV DNA)1 μL；10×PCR擴增緩沖液5 μL；MgCl2(25 mmol·L-1)3 μL；dNTPs 1 μL；上游引物(20 mmol·L-1)1 μL；下游引物(20 mmol·L-1)1 μL；Taq酶1 μL。加超純水至總體積為50 μL(以上都在冰上操作)，置于PCR儀內(nèi)進行擴增。PCR程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，運行30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳結束后用Immage master VDS成像系統(tǒng)檢測目的條帶。

1.2.2 病毒拷貝數(shù)檢測體系與程序

病毒拷貝數(shù)檢測使用Perfect Real Time premix(Takara，Japan)以及特異性Taqman探針進行檢測，模板包括已知濃度的病毒標準液，以及上一步得到的基因組DNA。引物WSSV-RT1(5′-TTGGT TTCATGCCCGAGATT-3′)和WSSV-RT2(5′-CCTT GGTCAGCCCCTTGA-3′)。Taqman探針為(5′-FAM-TGCTGCCGTCTCCAA-TAMRA-3′)[4]。將1010μL-1的病毒標準品按照1∶10逐級稀釋，取109μL-1至103μL-16個梯度作為標準品模版，用以標準曲線的制備，每組樣品對應3個生物學重復。在96孔板中依序加樣，將96孔板在水平離心機2 000 r·min-1離心10 min。在ABI step one實時熒光定量PCR儀上進行如下程序：50 ℃，5 min；95 ℃，45 s；52 ℃，45 s；72 ℃，45 s；45個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 不同氣溫條件下克氏原螯蝦的WSSV陽性感染率

結合圖1～2可以發(fā)現(xiàn)溫州5月WSSV陽性率最高，為100%，而5月溫州平均氣溫為20～27 ℃。湖州產(chǎn)的克氏原螯蝦WSSV陽性率也于5月達到高峰，為66.7%，5月湖州的平均氣溫為18～27 ℃。而麗水、杭州產(chǎn)的克氏原螯蝦WSSV陽性率分別于6月、4月達到最高峰，陽性率都為80%，麗水6月平均氣溫為24～32 ℃，杭州4月平均氣溫為14～24 ℃。

圖1 浙江省4個地區(qū)4—8月克氏原螯蝦的WSSV陽性感染率

圖2 浙江省4個地區(qū)4—8月平均氣溫變化

觀察4—8月各地的克氏原螯蝦WSSV陽性率，可以發(fā)現(xiàn)在陽性率大于60%時，溫度在20～26 ℃。隨著溫度的增高，陽性率也增高，但是在溫度高于26 ℃時，螯蝦的WSSV陽性率不增反減。由此可見，白斑綜合征病毒在20～26 ℃時感染活性最高，克氏原螯蝦最易感染白斑綜合征病毒。相關研究證明，白斑綜合征病毒在高溫下活性減弱，復制和增殖減慢，而在低溫下活性不足，增殖較慢[5]。

2.2 浙江省不同地區(qū)克氏原螯蝦的PCR檢測結果

圖3 PCR檢測結果顯示，來自浙江省4個地區(qū)的克氏原螯蝦在4—8月的陽性感染率存在一定的差異。通過計算4—8月各個組螯蝦WSSV陽性感染率的平均值，可以得出4—8月杭州鰲蝦的平均陽性感染率為34.7%，而湖州、溫州和麗水的平均陽性感染率分別為24.0%、52.0%和49.3%?？梢园l(fā)現(xiàn)位于浙南的溫州和麗水的克氏原螯蝦WSSV陽性率明顯高于位于浙北的湖州和杭州。

圖3 浙江省四個地區(qū)4—8月的克氏原螯蝦體內(nèi)WSSV的PCR檢測結果

克氏原螯蝦一般養(yǎng)殖在稻田、河溝、池塘等淡水環(huán)境中，而WSSV則主要在海水甲殼類、橈足類動物中傳播流行。所以沿海地區(qū)發(fā)展克氏原螯蝦養(yǎng)殖的病害風險會明顯大于內(nèi)陸地區(qū)。從經(jīng)濟角度分析，溫州、麗水等地的克氏原螯蝦養(yǎng)殖戶可能會選擇直接從海里獲取養(yǎng)殖克氏原螯蝦的生物餌料(魚類、蝦類、蟹類等)，而我國海洋近岸幾乎所有甲殼類、橈足類動物均已受到WSSV的感染，這或許是溫州、麗水WSSV陽性感染率高的一個原因。觀察浙江水系分布圖，杭州、湖州所在地區(qū)有較多的大型湖泊，而溫州、麗水則沒有。在淡水湖泊中養(yǎng)殖克氏原螯蝦，感染W(wǎng)SSV的風險較低[6]。所以杭州、湖州產(chǎn)的克氏原螯蝦WSSV感染率低于溫州、麗水。

2.3 感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦不同組織中的病毒拷貝數(shù)

本研究分別對WSSV檢測呈陽性的克氏原螯蝦的血淋巴、腸、鰓進行取樣并且進行了病毒拷貝數(shù)檢測。如圖4，這3個組織中都能檢測到較高的病毒拷貝數(shù)。在克氏原螯蝦的腸內(nèi)能檢測出較高病毒拷貝數(shù)，推測是由于攝入生物性餌料(如蝦類、蟹類、橈足類等)，甚至是攝食感染W(wǎng)SSV的鰲蝦尸體造成的[7]。因為WSSV可感染幾乎所有養(yǎng)殖和野生的對蝦、鰲蝦、蟹類等甲殼動物。而其鰓內(nèi)的較高病毒拷貝數(shù)可能由其水源引起，野外的患病野生蝦蟹會通過池塘注水等方式進入養(yǎng)殖池塘，且通過各種方式在水中釋放出病毒粒子，病毒粒子再經(jīng)鰓部感染宿主，值得注意的是鰓內(nèi)的病毒拷貝數(shù)有隨溫度升高的趨勢。血淋巴中的病毒拷貝數(shù)也有隨溫度升高而升高的趨勢，尤其是在麗水的檢測結果中這一趨勢更為顯著，有研究指出WSSV會感染宿主的血淋巴細胞，再通過血液循環(huán)將病毒粒子傳播到宿主體內(nèi)的其他組織，所以血淋巴中也能檢出病毒[2]。

圖4 4個地區(qū)5—8月克氏原螯蝦WSSV病毒拷貝數(shù)

3 討論

本研究經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)WSSV增殖的適宜溫度在20～26 ℃。羅淑婭[5]通過分析實驗得出WSSV在27 ℃水溫下活性最強，溫周瑞[8]發(fā)現(xiàn)22～32 ℃時克氏原螯蝦感染W(wǎng)SSV概率較大，這些數(shù)據(jù)與本研究得出的結論基本相符。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)浙江省不同地區(qū)的克氏原螯蝦的WSSV陽性感染率有所不同，溫州、麗水等浙南地區(qū)的蝦感染率較高，推測是由于喂食較多來自海洋的生物飼料引起，建議投放病毒感染風險較小的植物性飼料，并且推薦將天然湖泊作為養(yǎng)殖場所。從已感染的克氏原螯蝦的血淋巴、鰓、腸中均能夠檢測出較高的WSSV病毒拷貝數(shù)，這與其食用同類尸體等生活習性和生活環(huán)境密切相關。建議養(yǎng)殖場在發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦死亡時，應當立即將死蝦撈出，采取無害化處理，必要時可水體滅菌，預防疾病傳播。而且血淋巴和鰓內(nèi)的病毒拷貝數(shù)有隨溫度升高的趨勢，所以在夏季高溫季節(jié)要更加注意白斑綜合征的防控，投喂免疫增強劑以抵抗病毒感染。已有的研究發(fā)現(xiàn)納米殼聚糖添加劑能增強克氏原螯蝦的先天免疫力，抑制WSSV的復制，并且納米殼聚糖可明顯提高克氏原螯蝦對WSSV的抵抗能力[9]。此外橙皮素也具有較強的抗WSSV活性，同時能增強克氏原螯蝦的先天免疫機能，并且降低WSSV感染后克氏原螯蝦的死亡率[10]。因此，建議將殼聚糖和橙皮素作為有效免疫增強劑用于克氏原螯蝦的人工養(yǎng)殖以防治WSSV。