黃佳奇，譚影影，陳美琳，李佳霖，張景媛，段小霞，翟弋焱，時 銳，吳嘉瑞#

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488; 2.北京澤橋傳媒科技股份有限公司，北京 100176)

流行性感冒(簡稱“流感”)是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，臨床表現(xiàn)包括咳嗽、鼻塞、頭痛和咽喉痛等[1]。人流感病毒由于核蛋白和內(nèi)膜抗原蛋白的不同可分為甲、乙和丙3型[2]。荊防顆粒由荊芥、防風(fēng)、羌活、獨活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗和甘草等11味藥組成，具有發(fā)汗解表、散風(fēng)祛濕的功效[3]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測荊防顆粒治療流感的成分、靶點，并通過分子對接技術(shù)進行驗證，為進一步的研究提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 荊防顆粒相關(guān)化學(xué)成分及靶點信息查找

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)查找荊防顆粒的成分，并以藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，篩選各藥材的成分，并通過TCMSP查找成分對應(yīng)的靶點。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，以“influenza”為關(guān)鍵詞查找流感的疾病靶點；根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，將流感靶點的蛋白名轉(zhuǎn)化為基因名。利用在線工具Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，將荊防顆粒的靶點與流感的靶點進行交集，得到荊防顆粒治療流感的潛在靶點。

1.2 “藥物-成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.2軟件，將荊防顆粒的成分及潛在靶點進行可視化處理，構(gòu)建“藥物-成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

將潛在靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

將潛在靶點通過Rstudio進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。通過PATHVIEW網(wǎng)站(https://pathview.uncc.edu/analysis)顯示出富集通路的基因，利用Portable Pathway Builder Tool 2.0軟件將通路可視化。

1.5 分子對接

通過TCMSP獲得荊防顆粒成分的結(jié)構(gòu)信息，通過PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)得到靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)。利用AutodockTool軟件對小分子和靶蛋白進行加氫、計算電荷和合并非極性氫等前處理，利用Autodock Vina軟件對二者進行對接，通過PyMOL 2.3.0軟件將對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 荊防顆粒成分和靶點信息

收集到11味藥共220個成分，去除未查得靶點的成分后再去重得到159個成分。查得荊防顆粒的靶點3 531個，去除未能成功轉(zhuǎn)化為基因名的靶點并去重得到248個靶點。

2.2 共有靶點庫的建立

查得流感的靶點2 574個，取“Relevance”大于中位數(shù)的靶點，篩選2次得到665個靶點。與荊防顆粒的靶點取交集得到荊防顆粒治療流感的54個潛在靶點，見圖1。

圖1 VENN圖Fig 1 Venn diagram

2.3 “藥物-成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)

“藥物-成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)見圖2，圖中菱形節(jié)點代表荊防顆粒治療流感的潛在靶點，圓形節(jié)點代表荊防顆粒的成分，正方形節(jié)點代表荊防顆粒的11味藥材，節(jié)點大小與其度值(Degree)成正比。槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、柚皮素(naringenin)、金合歡素(acacetin)和丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)等成分Degree較高，可能是荊防顆粒治療流感的關(guān)鍵成分。靶蛋白PTGS2、PRSS1、MAPK14、ADRB2和RELA的Degree較高，Degree≥10。

圖2 “藥物-成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 “Drug-components-potential targets” network

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

荊防顆粒治療流感的潛在靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖3，圖中節(jié)點大小以及顏色深淺與其Degree成正比。白細胞介素(IL)6、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGFA)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、細胞腫瘤抗原p53(TP53)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)和IL-1β等節(jié)點的Degree較高，與其他蛋白關(guān)系密切。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network

2.5 GO和KEGG富集分析

GO和KEGG分析結(jié)果見圖4—5。荊防顆?？烧{(diào)節(jié)信號受體結(jié)合、酶結(jié)合、含蛋白質(zhì)的復(fù)合物結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合和細胞因子活性等分子功能，作用于細胞外區(qū)域、細胞外空間、細胞質(zhì)囊泡和細胞內(nèi)囊泡等細胞組分，參與細胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、細胞對有機物的反應(yīng)、細胞死亡和程序性細胞死亡等生物過程。甲型流感信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路和IL-17信號通路等可能是荊防顆粒治療流感的關(guān)鍵通路。

圖4 GO功能富集分析Fig 4 GO functional enrichment analysis

圖5 KEGG通路富集分析Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接

選取PTGS2、PRSS1、ADRB2、MAPK14、CASP3、JUN和RELA作為分子對接的靶蛋白，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚、柚皮素和漢黃芩素作為分子對接的小分子，結(jié)合能最低的9組對接結(jié)果見表1。結(jié)合能越低，小分子與靶蛋白之間的親和力越高，結(jié)合效果越好。選取結(jié)合效果最好的5組進行展示，見圖6。

表1 分子對接結(jié)果Tab 1 Results of molecular docking

A.ADRB2-luteolin；B.PTGS2-luteolin；C.PTGS2-quercetin；D.ADRB2-quercetin；E.ADRB2-beta-sitosterolA.ADRB2-luteolin；B.PTGS2-luteolin；C.PTGS2-quercetin；D.ADRB2-quercetin；E.ADRB2-beta-sitosterol圖6 分子對接結(jié)果Fig 6 Results of molecular docking

2.7 荊防顆粒治療流感的通路分析

選取Influenza A通路進行展示，見圖7—8。圖7中，深色方塊代表荊防顆粒作用的靶點；圖8中，P代表磷酸化，箭頭代表促進作用，星形標注的靶點是荊防顆粒作用的靶點。荊防顆?？勺饔糜诤艘蜃应蔅(NF-κB)、IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ調(diào)控Influenza A通路，通過調(diào)節(jié)病毒引起的先天免疫反應(yīng)、促進細胞因子釋放，影響流感病毒RNP的釋放以及病毒蛋白的表達控制病毒感染。

圖7 荊防顆粒干預(yù)Influenza A通路圖Fig 7 Pathway of Influenza A intervened by Jingfang granules

圖8 荊防顆粒干預(yù)Influenza A 核心通路示意圖Fig 8 Core pathway of influenza A intervened by Jingfang granules

2.8 “藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

荊防顆粒治療流感的“藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)見圖9，圖中正方形節(jié)點代表荊防顆粒，三角形節(jié)點代表藥物，菱形節(jié)點代表成分，圓形節(jié)點代表靶點，正六邊形節(jié)點代表通路。

圖9 “藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig 9 “Drug-components-targets-pathway” network

3 討論

荊防顆粒由11味中藥組成，其中荊芥、防風(fēng)為君藥，有發(fā)汗解表散風(fēng)之效；羌活、獨活為臣藥，祛一身風(fēng)寒濕邪；柴胡、川芎、桔梗、枳殼、前胡和茯苓共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥；諸藥合用，共奏發(fā)汗解表、散風(fēng)祛濕之效[4]。

通過“藥物-成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，荊防顆粒可能通過槲皮素、木犀草素、山柰酚等成分作用于PTGS2、PRSS1和ADRB2等靶點發(fā)揮治療流感的作用。槲皮素具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗炎癥的作用，影響流感病毒mRNA的合成、病毒的組裝及釋放[5-6]。木犀草素能夠干擾IAV外殼蛋白Ⅰ復(fù)合物的表達，抑制H1N1導(dǎo)致的細胞病變，下調(diào)流感病毒H1N1激活的凋亡通路[7-9]。山柰酚與M2蛋白有較高的結(jié)合親和力，能夠阻斷神經(jīng)氨酸酶的活性位點，抑制TLR4/MyD88介導(dǎo)的NF-κB和MAPK通路的激活，從而抑制炎癥介質(zhì)過量產(chǎn)生[10-12]。漢黃芩素能夠抑制TLR7介導(dǎo)的MyD88依賴性信號通路及NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位和表達，抑制流感病毒感染后肺泡巨噬細胞內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[13-14]。PTGS2具有抗炎、抗氧化的作用，與炎癥病理過程密切相關(guān)[15]。MAPK14參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，被激活后可以調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生以及細胞的增殖、分化[16-17]。ADRB2即β2-AR，可介導(dǎo)NE誘導(dǎo)細胞分泌IL-10，控制炎癥[18]。RELA與炎癥調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答等生命活動密切相關(guān)[19]。CASP3、CASP8與細胞焦亡密切相關(guān)[20]。木犀草素能下調(diào)CASP3、CASP8的表達，干預(yù)流感病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡[8]。因此，荊防顆粒治療流感的作用機制可能與抑制流感病毒復(fù)制，干預(yù)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答有關(guān)。

GO功能富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，荊防顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)信號受體結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合和分子功能等過程，參與調(diào)控細胞死亡、細胞對相關(guān)刺激的反應(yīng)，發(fā)揮抗流感病毒的作用。甲型流感信號通路圖顯示，荊防顆粒參與了流感病毒的先天免疫逃避、細胞因子抗感染、細胞死亡、流感病毒RNP的輸出和流感病毒蛋白的表達等過程，并涉及到MAPK信號通路。MAPK通路是生物體內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，可以將細胞外刺激信號，如細胞因子、炎癥反應(yīng)等信號，從細胞膜傳導(dǎo)至細胞核內(nèi)，參與多種生理病理過程，影響細胞生長的各階段，如細胞的生長、增殖和遷移等活動都會受到MAPK通路的調(diào)控[21-22]。說明荊防顆粒治療流感可能與干預(yù)細胞死亡、抑制流感病毒的表達和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，初步揭示了荊防顆粒治療流感的分子機制，為進一步的研究提供了基礎(chǔ)。