張玉琳 楊澤毅 李超程 黃星宇 張凡凡* 馬春暉*
(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,石河子 832000;2.新疆科構(gòu)生物科技有限公司,石河子 832000)
構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)又稱殼樹、褚樹等,為多年生落葉喬木,營養(yǎng)價值高,適應(yīng)性強,其葉片中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量高,粗纖維含量低,且富含各種氨基酸,是一種優(yōu)質(zhì)的非常規(guī)飼料資源。雜交構(gòu)樹是由中國科學(xué)院植物研究所通過現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種技術(shù)培育出的優(yōu)質(zhì)樹種[1-2],目前主要包括中科1號、中科2號、中科3號、雜交構(gòu)樹101、雜交構(gòu)樹201等品種,各品種在保持構(gòu)樹原有優(yōu)良特性的同時,兼具耐貧瘠、耐刈割、營養(yǎng)價值高等特點,極具開發(fā)價值[3]。當(dāng)前,我國諸多地區(qū)都相繼開展了雜交構(gòu)樹的栽培和利用研究,而新疆地區(qū)未見相關(guān)研究報道。因此,開展雜交構(gòu)樹加工研究和實際生產(chǎn)對本地區(qū)實現(xiàn)“經(jīng)濟-社會-生態(tài)”協(xié)調(diào)持續(xù)發(fā)展和鄉(xiāng)村振興具有重要現(xiàn)實意義。
目前雜交構(gòu)樹莖葉分離機械作業(yè)成本高,不易實現(xiàn),因此其主要以全株刈割進行利用,雖全株構(gòu)樹的營養(yǎng)價值低于葉片,但諸多研究通過發(fā)酵手段對全株構(gòu)樹進行加工利用也能使育肥豬、肉牛、奶牛等表現(xiàn)出較好的生產(chǎn)性能[4-6]。雜交構(gòu)樹的原料特征與苜蓿類似,表面附著乳酸菌數(shù)量較少(<1×105CFU/g),干物質(zhì)和可溶性碳水化合物含量較低,緩沖能高,直接青貯較難成功[7],而添加外源微生物制劑尤其是乳酸菌制劑是改善青貯品質(zhì)最為便捷和有效的方式[8-10],其主要作用是通過調(diào)節(jié)青貯原料微生物區(qū)系,確保青貯營養(yǎng)成分的保存,保證青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和穩(wěn)定性;同時促進多糖和纖維的轉(zhuǎn)化,提高青貯的消化率及適口性[11]。其中,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarumas)屬同型發(fā)酵乳酸菌,其生長繁殖較快,對于發(fā)酵底物利用率高、競爭力強,在發(fā)酵初期能夠產(chǎn)生大量乳酸,使得發(fā)酵體系迅速形成酸性環(huán)境,抑制有害微生物的生長繁殖,最大程度地保存青貯原料的營養(yǎng)物質(zhì)[12]。
有研究報道稱,在雜交構(gòu)樹葉中接種植物乳桿菌,隨著其添加量的增加青貯品質(zhì)更佳[13];或?qū)⒅参锶闂U菌、異型發(fā)酵乳酸菌布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、各類纖維素酶(纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶)、糖蜜聯(lián)合接種時,青貯品質(zhì)最優(yōu)[14];但也有報道稱,雜交構(gòu)樹青貯單獨添加糖蜜青貯品質(zhì)最優(yōu)[15]。那么在實際生產(chǎn)中,單獨接種植物乳桿菌對裹包全株雜交構(gòu)樹的青貯品質(zhì)有何影響?從經(jīng)濟角度出發(fā),是否添加最低劑量(1×105CFU/g)的植物乳桿菌即可達到改善青貯品質(zhì)的目的?目前尚無定論。鑒于此,本研究在實際生產(chǎn)作業(yè)中添加低劑量植物乳桿菌,研究其對全株雜交構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)、微生物數(shù)量、瘤胃體外產(chǎn)氣特性及有氧暴露過程中青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量的影響,為加工調(diào)制優(yōu)質(zhì)雜交構(gòu)樹青貯飼料提供指導(dǎo),同時促進本地區(qū)雜交構(gòu)樹的高效加工利用。
青貯原料于2020年9月份采自新疆維吾爾自治區(qū)石河子地區(qū)143團雜交構(gòu)樹種植示范基地(N44°52′,E85°50′,海拔335 m),人工種植的雜交構(gòu)樹(雜交構(gòu)樹201)待株高長至1.5 m左右,利用青飼料收獲機進行全株收割粉碎(圖1-A),留茬高度為15~20 cm,粉碎長度1~2 cm。植物乳桿菌購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。
試驗分為2個處理,分別為對照處理(CK處理,不添加任何菌劑)和植物乳桿菌處理(LP處理,添加1×105CFU/g植物乳桿菌)。將菌種在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),平板計數(shù)后確定其數(shù)量,按比例配制菌液,以鮮重為基礎(chǔ)進行添加。用水槍均勻地噴灑至待貯青貯原料表面(CK處理噴灑等量的水)(圖1-B)。噴灑完畢后立刻混勻進行裹包青貯(圖1-C),原料含水量76.35%,裹包密度500 kg/m3,每個處理10包。裹包規(guī)格半徑50 cm,高100 cm,裹包膜厚度0.1 mm,裹包層數(shù)8~10層,裹包完成后放置于室外發(fā)酵60 d后開包(圖1-D),隨后測定全株雜交構(gòu)樹青貯的發(fā)酵品質(zhì)、微生物數(shù)量和瘤胃體外產(chǎn)氣模型參數(shù),并在開包后的第0(開包當(dāng)天)、4、8、12天檢測全株雜交構(gòu)樹青貯的發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量。
A:克拉斯收割機收割作業(yè);B:噴灑菌劑;C:全株雜交構(gòu)樹青貯拉伸膜裹包作業(yè);D:全株雜交構(gòu)樹青貯感官情況。A:the harvesting operation of Crass harvester;B:spraying microbial inoculum;C:the stretching film wrapping operation of whole-plant hybrid Broussonetia papyrifera silage;D:the sensory condition of whole-plant hybrid Broussonetia papyrifera silage.圖1 全株雜交構(gòu)樹生產(chǎn)加工過程Fig.1 Production and processing process of whole-plant hybrid Broussonetia papyrifera
1.3.1 營養(yǎng)成分分析
全株雜交構(gòu)樹鮮樣及青貯營養(yǎng)成分主要測定干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、可溶性碳水化合物(WSC)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)含量。其中,DM含量采用105 ℃烘干法測定(DHG-9620A鼓風(fēng)干燥機,上海合恒儀器設(shè)備有限公司);CP含量采用凱氏定氮法測定(Kjeltec 8400 FOSS全自動凱氏定氮儀,美國福斯公司);WSC測定采用蒽酮比色法測定(722可見分光光度計,上海精密科學(xué)儀器有限公司);NDF和ADF含量采用范氏洗滌纖法測定(自制纖維袋,專利號:ZL201621382211.7和ZL201621382214.0);EE含量采用索氏提取法測定(玻璃索氏提取器,上海壘固有限公司);Ash含量采用550 ℃灼燒法測定(XL-3000型高效節(jié)能智能一體馬弗爐,上海合恒儀器設(shè)備有限公司)[16]。
1.3.2 發(fā)酵特征指標(biāo)分析
發(fā)酵特性指標(biāo)主要測定pH、氨態(tài)氮(NH3-N)、乳酸(lactic acid,LA)、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propanoic acid,PA)、丁酸(butyric acid,BA)。pH用酸度計測定(PHSJ3F酸度計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);LA、AA、PA、BA含量采用液相色譜法(Agilent1260高效液相色譜儀HPLC,美國安捷倫科技公司)測定;NH3-N含量采用苯酚-次氯酸比色法測定[16-17]。
1.3.3 微生物數(shù)量分析
微生物主要測定好氧細菌(aerobic bacteria,AB)、乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)、酵母菌(yeast)和霉菌(mold)數(shù)量。AB、LAB、酵母菌、霉菌數(shù)量分別采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、麥芽糖浸粉瓊脂培養(yǎng)基和高鹽察氏培養(yǎng)基進行培養(yǎng),所有培養(yǎng)基均購自北京路橋集團有限公司,培養(yǎng)結(jié)束后進行平板計數(shù),并計算微生物數(shù)量[18]。
1.3.4 綿羊瘤胃體外產(chǎn)氣分析
選擇3只健康、體重接近的哈薩克羊作為瘤胃液供體。試驗飼糧由200 g精料(玉米51.0、麩皮24.0%、豆粕18.0%、碳酸氫鈣2.5%、預(yù)混料2.0%、尿素1.5%、食鹽1.0%)和1.8 kg青貯玉米組成,每天晨飼(08:00),自由飲水,持續(xù)飼喂1個月。飼喂結(jié)束后,在晨飼前宰殺采集瘤胃液,采集時將瘤胃液以4層紗布初步過濾到預(yù)熱過的保溫瓶中,迅速帶回實驗室處理,再次用4層紗布過濾瘤胃液后棄去過濾后的殘渣,置于39 ℃水浴鍋中待使用。參照Menke等[19]的方法配制人工瘤胃液,將人工瘤胃液與瘤胃液以2∶1的比例進行混合,用分液器分別向所有培養(yǎng)管注入30 mL混合培養(yǎng)液,將培養(yǎng)管進液端豎直向上排盡管內(nèi)氣體,用止水夾夾住前端硅橡膠管,并記錄相應(yīng)的初始刻度值(mL)。將培養(yǎng)管迅速放入已預(yù)熱(39 ℃)的水浴箱中,待加液完畢后所有培養(yǎng)管同時轉(zhuǎn)入人工瘤胃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。按照盧德勛等[20]的方法測定第0(初始發(fā)酵時)、2、4、6、8、10、12、18、24、30、36、42、48 h的產(chǎn)氣量,同時分析有機物消化率(OMD)和代謝能(ME),計算公式如下:
OMD=0.986×GP+0.060 6×CP+11.03;ME=0.1639×GP+0.007 9×CP+0.023 9×EE+0.04。
式中:GP為24 h的產(chǎn)氣量(mL);CP為粗蛋白質(zhì)含量(%);EE為粗脂肪含量(%)[21]。
試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,差異顯著者用Duncan氏法進行多重比較,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。瘤胃體外產(chǎn)氣模型參數(shù)采用DPS V7.05軟件中一元非線性回歸模型(Gompertz模型)進行計算。采用Origin 2017軟件進行繪圖。計算公式[22]如下:
X2=C1×exp[-C2×exp(-C3×X1)]。
式中:X2為產(chǎn)氣量(mL);C1為理論最大產(chǎn)氣量(mL);C2為產(chǎn)氣速率(mL/h);C3為產(chǎn)氣延滯時間(h);X1為體外培養(yǎng)時間(h)。
由表1可知,發(fā)酵60 d時,LP和CK處理的pH和CP、WSC、NDF、ADF含量及酵母菌、霉菌、AB數(shù)量均顯著低于青貯原料(P<0.05),NH3-N、Ash、LA、AA含量及LAB數(shù)量均顯著高于青貯原料(P<0.05),DM、EE含量與青貯原料差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵60 d時,LP處理的pH、ADF含量、AB數(shù)量顯著低于CK處理(P<0.05),而LA含量、LAB數(shù)量顯著高于CK處理(P<0.05),PA、BA在發(fā)酵結(jié)束時均未檢測出。CK處理和LP處理之間NH3-N、DM、Ash、CP、WSC、NDF、AA含量及酵母菌、霉菌數(shù)量均差異不顯著(P>0.05)。
表1 植物乳桿菌對雜交構(gòu)樹發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量情況的影響Table 1 Effects of Lactobacillus plantarum on fermentation quality and microbial quantity of whole-plant hybrid Broussonetia papyrifera silage
如圖2所示,隨著體外產(chǎn)氣時間的延長,各處理產(chǎn)氣量逐漸升高,在48 h達到頂峰。在發(fā)酵的0~48 h,各處理在不同時間點的產(chǎn)氣量均差異不顯著(P>0.05)。
由表2可知,LP處理的OMD、產(chǎn)氣速率顯著高于青貯原料和CK處理(P<0.05);青貯原料、CK處理和LP處理之間理論最大產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣延滯時間和ME均差異不顯著(P>0.05)。各處理產(chǎn)氣模型為:
表2 植物乳桿菌對雜交構(gòu)樹青貯有機物消化率、代謝能和產(chǎn)氣模型參數(shù)的影響Table 2 Effects of Lactobacillus plantarum on OMD,ME and gas production model parameters of Broussonetia papyrifera silage
青貯原料,X2=72.01×exp[-1.08×exp(-0.18×X1)](F=329.89,P=0.001,R2=0.99);CK處理,X2=72.22×exp[-1.03×exp(-0.17×X1)](F=286.93,P=0.001,R2=0.98);LP處理,X2=72.44×exp[-1.11×exp(-0.16×X1)](F=343.69,P=0.001,R2=0.99)。
式中:X2為產(chǎn)氣量(mL);X1為體外培養(yǎng)時間(h)。
數(shù)據(jù)點無標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。Value points with no label mean no significant difference (P>0.05).圖2 各處理0~48 h體外產(chǎn)氣規(guī)律Fig.2 Gas production in vitro of 0 to 48 h in each treatment
由表3可知,LP和CK處理的pH、NH3-N含量及4類主要微生物(AB、LAB、酵母菌、霉菌)數(shù)量在開包后逐漸增加,AA、PA含量呈先上升后下降的趨勢,僅LA含量隨開包后時間的延長逐漸減少。其中,LP處理的pH在開包后第0、4、8、12天顯著低于CK處理(P<0.05)。LP處理的LA含量在開包后第0天顯著高于CK處理(P<0.05),AA含量在開包后第8天顯著高于CK處理(P<0.05)。LP處理的LAB數(shù)量在開包后第0、8天顯著高于CK處理(P<0.05),而AB數(shù)量則顯著低于CK處理(P<0.05)。BA在開包后未檢測出。CK處理和LP處理之間開包后NH3-N、PA含量和酵母菌、霉菌數(shù)量差異均不顯著(P>0.05)。
表3 植物乳桿菌對開包后雜交構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量的影響Table 3 Effects of Lactobacillus plantarum on fermentation quality and microbial quantity of whole-plant hybrid Broussonetia papyrifera silage after bags opened
青貯飼料干物質(zhì)的損失始于細胞的呼吸作用,需氧微生物利用碳水化合物產(chǎn)生水、熱量和二氧化碳,破壞分解養(yǎng)分[14]。本研究中,接種低劑量植物乳桿菌未顯著影響發(fā)酵底物干物質(zhì)含量,即一定程度減少了發(fā)酵底物營養(yǎng)物質(zhì)損失。青貯飼料中CP含量的變化與pH高低密切相關(guān)[23]。本研究開包時LP處理pH顯著低于CK處理,但CK處理和LP處理之間CP和NH3-N含量均無顯著差異,這與以往研究結(jié)果[13]相同,表明接種植物乳桿菌未顯著影響發(fā)酵體系蛋白質(zhì)的腐敗。LP和CK處理的CP和NH3-N含量較初始發(fā)酵時有顯著變化,其原因可能由于梭菌(Clostridiumspp.)未被完全抑制,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解所致[6]。另外,本研究LP和CK處理的WSC含量較初始發(fā)酵時顯著下降,其主要原因為青貯體系微生物對底物糖類物質(zhì)的利用所致[4];LA、AA含量較初始發(fā)酵時顯著上升,這說明雜交構(gòu)樹表面附著乳酸菌可基本滿足厭氧發(fā)酵條件;而LP處理的LA含量顯著高于CK處理,且CK處理和LP處理之間WSC含量差異不顯著,這說明青貯中被消耗的WSC主要被植物乳桿菌等同型發(fā)酵乳酸菌用以產(chǎn)生LA[24],且低劑量的植物乳桿菌接種可消耗更少WSC產(chǎn)生LA。
以往研究表明,添加劑對青貯NDF和ADF含量均有不同程度改善效果[25-26],主要由于大多數(shù)添加劑如LAB、纖維素酶、糖蜜等不僅能為飼料中的微生物提供底物,同時能加速其利用底物,能快速產(chǎn)生豐富的具有溶解纖維活性的微生物酶,降解植物中NDF和ADF[27]。這與本研究的結(jié)果一致。本研究中,LP和CK處理的NDF和ADF含量較初始發(fā)酵時顯著降低,LP處理的ADF含量顯著低于CK處理,說明接種低劑量植物乳桿菌即可顯著降低ADF含量。EE、Ash含量較發(fā)酵前有所升高,原因可能是由于水分、營養(yǎng)物質(zhì)等的損失,造成青貯底物總質(zhì)量下降,使得這些成分的比例有略微升高。此外,發(fā)酵60 d時,酵母菌、霉菌、AB數(shù)量均較初始發(fā)酵時顯著降低,僅LAB數(shù)量顯著升高,且LP處理的LAB數(shù)量顯著高于CK處理,這說明低劑量植物乳桿菌的接種即可達到提高發(fā)酵體系LAB數(shù)量的目的,以促使LA和AA的生成,迅速形成酸性環(huán)境和厭氧環(huán)境,抑制好氧致腐微生物的生長繁殖[11]。發(fā)酵結(jié)束時未檢測到PA與BA,這是由于發(fā)酵底物充足,LAB占主導(dǎo)地位形成了較低pH環(huán)境抑制了有害微生物的增殖[28],同時也可能與構(gòu)樹本身具有黃酮類物質(zhì),而黃酮類物質(zhì)具有抑菌作用有關(guān)[29]。
瘤胃體外產(chǎn)氣法可有效地通過飼料降解過程中的產(chǎn)氣量較準(zhǔn)確地評價飼料在動物體內(nèi)的消化率,是反映青貯飼用價值的重要體現(xiàn)[11,18]。本研究中接種低劑量植物乳桿菌即能使得OMD顯著提高;此外,LP處理的產(chǎn)氣速率顯著高于CK處理,這說明植物乳桿菌的接種有助于加速瘤胃微生物的活動,從而改善消化能力,在泌乳奶牛生產(chǎn)中也得到相似結(jié)論[6]。飼料在瘤胃體中發(fā)酵時產(chǎn)氣的來源主要是有機物中的CP、EE、NDF、WSC等,這些物質(zhì)在瘤胃中被分解代謝從而產(chǎn)生CO2、CH4等氣體后引起反應(yīng)空間的體積變化[30]。全株雜交構(gòu)樹CP、EE、NDF含量均較高,WSC含量低,因此在本研究中,隨著發(fā)酵時間的延長,各處理產(chǎn)氣量逐漸增加,這與部分學(xué)者的研究結(jié)果[31-32]相一致,主要反映出發(fā)酵底物中營養(yǎng)物質(zhì)的消化和瘤胃微生物代謝情況。
有氧暴露后,pH的增加是衡量青貯飼料是否變質(zhì)的一個重要指標(biāo)[33]。本研究中pH在發(fā)酵結(jié)束和開包過程中始終未降到優(yōu)質(zhì)青貯的標(biāo)準(zhǔn)(pH<4.4),其原因主要由于青貯體系含水量和緩沖能高[14]。此外,本研究中所有處理的pH均隨開包時間的延長逐漸增加,而接種低劑量植物乳桿菌可維持pH在較低水平,這與前人研究結(jié)果[34-35]類似,主要由于植物乳桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生較多LA,開包后雖然有所損失,但仍可以維持較低pH環(huán)境[36];此外,可能由于植物乳桿菌的接種促進了開包后異型發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)AA的含量。有氧暴露后,使得NH3-N含量有所增加,主要由于pH升高,不良微生物開始活動,氨基酸被分解成氨、硫化氫和胺類,降解率增大[37],而接種低劑量的植物乳桿菌可減少NH3-N的產(chǎn)生,這與以往研究結(jié)果[33,38]一致。青貯中有機酸含量的變化反映碳水化合物的轉(zhuǎn)化情況。本研究中LA含量隨開包時間的延長逐漸減少,而AA含量隨開包時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,其原因可能是在有氧暴露期間LA易被酵母菌利用,導(dǎo)致青貯的二次發(fā)酵;另外,青貯本身附著的異型發(fā)酵乳酸菌分解LA產(chǎn)生AA,在一定程度上維持雜交構(gòu)樹青貯中低pH水平[39]。有氧暴露后,無論是否添加植物乳桿菌,發(fā)酵體系的PA含量逐漸增加,其原因可能為有氧環(huán)境使好氧微生物的活動性增強,其利用青貯發(fā)酵底物產(chǎn)生水、CO2和熱量[40],從而產(chǎn)生少量PA。
青貯發(fā)酵過程中乳酸菌起主導(dǎo)作用。本研究發(fā)現(xiàn)雜交構(gòu)樹青貯中接種低劑量的植物乳桿菌有助于增加開包過程中LAB數(shù)量,維持其繼續(xù)利用底物進行生長繁殖,而有氧環(huán)境使得LAB生長速度減緩,這與以往研究結(jié)果[24]。相同。由于植物乳桿菌產(chǎn)生的能夠抑制酵母菌、霉菌等生長繁殖的短鏈脂肪酸的數(shù)量非常少,導(dǎo)致開包后酵母菌、霉菌的數(shù)量逐漸增加,這與以往研究結(jié)果[41]相同,其也認(rèn)為好氧微生物數(shù)量的增長主要由于LA源為同化型酵母菌提供了生長繁殖所需的底物。開包過程中,無論植物乳桿菌添加與否,AB數(shù)量都有不同程度的增加,主要由于pH的升高為好氧微生物創(chuàng)造了有利的環(huán)境,同時好氧微生物直接接觸青貯底物,造成青貯營養(yǎng)成分的進一步損失[24]。
在實際裹包作業(yè)中接種1×105CFU/g植物乳桿菌可提高全株雜交構(gòu)樹青貯發(fā)酵中乳酸菌數(shù)量和乳酸含量,降低pH,抑制好氧細菌增殖,從而利于青貯營養(yǎng)物質(zhì)的有效保存;且可通過促進開包8 d內(nèi)乳酸菌的生長和乙酸的生成,以維持酸性環(huán)境,減少好氧細菌生長,延緩二次發(fā)酵;同時可顯著降低酸性洗滌纖維含量,提高有機物消化率。