張燕迪，任紅艷，畢延震

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064）

隨著對基因轉(zhuǎn)錄的深入研究及高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，不斷有研究表明多數(shù)物種的基因組普遍被轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致LncRNA的不斷產(chǎn)生。最開始，研究者認(rèn)為LncRNA作為轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物被表達(dá)出來，是基因序列中的“垃圾”，沒有任何的生物學(xué)功能。但是，隨后的研究中不斷有證據(jù)表明LncRNA能夠調(diào)控基因表達(dá)，是多種生物學(xué)過程的重要調(diào)節(jié)劑。近年來利用RNA-seq技術(shù)對哺乳動物著床前胚胎進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)有大量LncRNA表達(dá)，這些LncRNA在早期胚胎發(fā)育的不同階段具有明顯的時空表達(dá)特異性［1］。進(jìn)一步研究證明LncRNA對胚胎正常發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用，它參與生物體生長、發(fā)育、衰老、死亡等各種生物進(jìn)程，其功能的異常會導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生［2-4］。目前為止，只有少數(shù)研究解析LncRNA對胚胎發(fā)育的功能，對于LncRNA在胚胎發(fā)育中的具體作用機制認(rèn)識還不夠全面。

1 LncRNA簡介

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200核苷酸（Nucleotide，nt）、無蛋白質(zhì)編碼能力但具有生物學(xué)功能的RNA［5］。由日本科學(xué)家Okazaki等［6］通過對小鼠cDNA文庫進(jìn)行大規(guī)模測序時首次發(fā)現(xiàn)并命名。隨機復(fù)制、染色體重排、轉(zhuǎn)座子隨機插入、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座作用和蛋白編碼基因閱讀框的改變是LncRNA產(chǎn)生的五種機制［7］。LncRNA與mRNA相似，由RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNAPⅡ）轉(zhuǎn)錄，有5′端帽子、3′端多聚腺苷酸（polyA）尾［8，9］。與mRNA不同的是，大多數(shù)LncRNA外顯子數(shù)目少且較長，主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，保守性和表達(dá)豐度低，在細(xì)胞和組織中呈現(xiàn)特異性表達(dá)模式［10，11］。LncRNA分類標(biāo)準(zhǔn)多樣，根據(jù)LncRNA與蛋白質(zhì)編碼基因在基因組上的相對位置分為正義鏈LncRNA（sense LncRNA）、反義鏈LncRNA（antisense LncRNA）、雙向鏈LncRNA（bidirectional LncRNA）、內(nèi)含子LncRNA（intronic LncRNA）和基因間LncRNA（intergenic LncRNA）五類［12］。根據(jù)LncRNA發(fā)揮的生物學(xué)功能分為信號分子（signal molecule）、引導(dǎo)分子（guid molecule）、支架分子（scaffold molecule）和誘餌分子（decoy molecule）［13，14］。cRNA在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在基因組印記、X染色體失活、細(xì)胞周期調(diào)控等過程中起著重要作用［15，16］。

LncRNA通過表觀遺傳修飾（Epigenetic modification）參與轉(zhuǎn)錄前調(diào)控，就是通過DNA甲基化、組蛋白甲基化及乙酰化等調(diào)節(jié)有關(guān)基因表達(dá)［17］。LncRNA-Xist招募多梳蛋白抑制復(fù)合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）到X染色體，與AUCG四環(huán)結(jié)構(gòu)作用，激活染色質(zhì)修飾復(fù)合體中的甲基轉(zhuǎn)移酶，引起組蛋白H3賴氨酸27三甲基化（H3K27me3），導(dǎo)致X染色體失活。LncRNA-Xist還可以與SHARP相互作用促進(jìn)這種沉默［18］。來源于與胚胎發(fā)育相關(guān)的HOX基因座的LncRNA-HOTAIR與LSD1（賴氨酸特異性脫甲基酶1）和PRC2結(jié)合后，靶向基因組，引起H3K27甲基化和H3K4去甲基化，抑制基因表達(dá)［18，19］。

LncRNA主要通過調(diào)節(jié)增強子或啟動子活性、轉(zhuǎn)錄因子及絕緣子功能等介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。從增強子反義鏈轉(zhuǎn)錄來的LncRNA-Evf2通過與Dlx2形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，激活Dlx5和Dlx6的 增 強 子，促 進(jìn)Dlx5和Dlx6基 因 表 達(dá)［20，21］。LncRNA-Airn能夠覆蓋在Igf2r啟動子上，通過連續(xù)轉(zhuǎn)錄，阻止Igf2r啟動子的轉(zhuǎn)錄起始。同時，Airn通過募集組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EHMT2到基因組的基因座上來調(diào)控Slc22a3表達(dá)［22］。有研究稱脂多糖誘導(dǎo)的非編碼RNA（LINoCR）通過解除下游絕緣子對增強子的抑制而激活靶基因LYZ的表達(dá)［23］。

LncRNA通過影響mRNA轉(zhuǎn)運、剪接、降解等過程在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。LncRNA-MALAT1通過與SR（serine-and arginine-rich proteins family，富含絲氨酸/精氨酸的剪接調(diào)控蛋白家族）蛋白作用調(diào)節(jié)剪切因子磷酸化狀態(tài)，使前體mRNA發(fā)生選擇性剪切［24］。LncRNA-1/2-sbs RNA與3′端非編碼區(qū)含有Alu元件的mRNA結(jié)合，促進(jìn)mRNA與STAU1結(jié)合，引起Staufen1介導(dǎo)的降解（Staufen1-mediated decay，SMD）途徑，導(dǎo)致mRNA降解［25］。LncRNANEAT1可以調(diào)控已經(jīng)分化細(xì)胞中有關(guān)mRNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運［26］。高表達(dá)于胃癌細(xì)胞中的LncRNA-GHET1能提高c-MycmRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)其表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖［27］。

2 胚胎發(fā)育簡介

動物的胚胎發(fā)育是一個連續(xù)發(fā)展變化的過程，精卵融合使得父源遺傳物質(zhì)進(jìn)入成熟卵母細(xì)胞，在生物學(xué)中將已受精的卵母細(xì)胞稱為受精卵，其是由一個細(xì)胞組成的胚胎，包含著生物體生長發(fā)育所需的全部信息，在母體環(huán)境合適的條件下，經(jīng)過卵裂期→桑椹胚→囊胚→原腸胚，有組織地對這些信息進(jìn)行編碼修飾，最終增殖發(fā)育成為一個新的個體［28］。胚胎發(fā)育過程復(fù)雜且有序，是在許多編碼蛋白基因和非編碼蛋白基因選擇性特異時空表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物相互作用形成精確調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的條件下完成的，某些基因的改變可能會引起胚胎發(fā)育異常，甚至導(dǎo)致先天畸形的發(fā)生，因此研究胚胎發(fā)育時期LncRNA調(diào)控功能具有重要作用。

胚胎發(fā)育過程中有一系列重要且獨特的事件影響著胚胎的正常發(fā)育，例如MZT，其通過兩個相互關(guān)聯(lián)的過程將終末分化的精子和卵母細(xì)胞重編程到全能性，即母體蛋白及轉(zhuǎn)錄本mRNA的消除和胚胎發(fā)育所必需的ZGA［29，30］。從精子與成熟卵子受精到胚胎第一次分裂，胚胎發(fā)育是由卵母細(xì)胞中積累的母源RNA和蛋白質(zhì)控制的，二細(xì)胞形成后，母源物質(zhì)的表達(dá)下調(diào)，合子基因產(chǎn)生，合子基因組逐漸發(fā)揮主要調(diào)控作用，發(fā)育由母源基因產(chǎn)物控制轉(zhuǎn)向合子基因產(chǎn)物控制，若這個過渡不能順利完成，就會造成胚胎發(fā)育的阻滯。由于原始存留的蛋白質(zhì)和RNA量及種類的不同，導(dǎo)致各物種之間MZT所處的時間點不同［31］。合子基因組激活也是一個很重要的過程，改變了胚胎內(nèi)基因組的表達(dá)模式，是胚胎具備形成各種細(xì)胞類型能力的關(guān)鍵，與染色質(zhì)狀態(tài)、細(xì)胞周期、核質(zhì)成分比例變化等胚胎事件協(xié)調(diào)發(fā)生。ZGA通常包括兩個階段，開始的低水平轉(zhuǎn)錄和隨后的爆發(fā)式表達(dá)。有三類模型用于研究ZGA的調(diào)控機制：第一類是母源調(diào)控模型；第二類是核質(zhì)比模型；第三類是染色質(zhì)重塑模型［32］。Assou等［33］研究表明內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)層分離也是胚胎發(fā)育過程中的一個重要事件。

3 LncRNA參與胚胎發(fā)育

在胚胎發(fā)育過程中，通過胚胎和祖細(xì)胞中關(guān)鍵基因的精確時空激活來實現(xiàn)細(xì)胞譜系的規(guī)格和分化。不斷有研究發(fā)現(xiàn)動物和人類植入前胚胎中存在一些與胚胎發(fā)育相關(guān)的LncRNA，但其功能研究相對缺乏。敲除牛胚胎中某些特定的LncRNA會影響胚胎的生長，導(dǎo)致胚胎發(fā)育率的提高和囊胚體積的增大。利用鎖核酸（Locked nucleic acid，LNC）對豬胚胎發(fā)育中的lincRNA-TCONS-00166370進(jìn)行功能缺失實驗，發(fā)現(xiàn)TCONS-00166370影響胚胎正常紡錘體的形成，造成豬早期胚胎卵裂異常［34］。在小鼠中，siRNA介導(dǎo)的啟動子相關(guān)LncRNA（promoter-associated noncoding RNAs，pancRNAs）沉默在二細(xì)胞期胚胎中特異表達(dá)，導(dǎo)致胚胎死亡，這種表型可以通過表達(dá)與這種LncRNA相互作用的蛋白質(zhì)來挽救。對人植入前胚胎單細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞（hESCs）RNA-seq數(shù)據(jù)的 分析 表明，有3 405個LncRNAs表達(dá)，其中2 733個是潛在的基因間非編碼RNA。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)早期人類胚胎和分化細(xì)胞中有相當(dāng)明顯的LncRNA譜，LncRNAs是人類早期胚胎發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄表達(dá)動態(tài)變化的一部分，也是胚胎發(fā)育過程中形態(tài)發(fā)生劇烈變化的原因之一。由于在胚胎發(fā)育的特定和關(guān)鍵階段檢測到了一些LncRNAs，所以它們可作為胚胎發(fā)育能力和ZGA的候選標(biāo)記物［35］。上述研究結(jié)果表明LncRNA在胚胎發(fā)育過程中具有重要作用，但大部分LncRNA的功能和機制還需進(jìn)一步研究。

3.1 LncRNA參與卵母細(xì)胞成熟與精子發(fā)生

卵母細(xì)胞質(zhì)量影響著胚胎發(fā)育能力，卵母細(xì)胞中的LncRNA對卵母細(xì)胞起到調(diào)控作用。Yerushalmi等［36］報道在生發(fā)泡期（germinal vesicle，GV）和成熟（MII）期卵母細(xì)胞以及高質(zhì)量和劣質(zhì)的植入前胚胎中，都有特異性LncRNA在卵丘細(xì)胞中差異表達(dá)，而且這些LncRNA在胚胎發(fā)育過程中呈現(xiàn)動態(tài)變化。此外，與無多囊卵巢綜合征的女性相比，多囊卵巢綜合征患者的卵丘細(xì)胞異常表達(dá)LncRNA，提示LncRNA的表達(dá)可能影響卵母細(xì)胞的能力。LncRNA可通過調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、高度不飽和脂肪酸的合成、細(xì)胞表面信號傳導(dǎo)以及顆粒細(xì)胞表面蛋白參與細(xì)胞粘附等過程，從而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟。LncRNA的表達(dá)譜不僅可以反映胚胎的發(fā)育階段，也可以反映顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞的發(fā)育階段，用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)對卵丘細(xì)胞中表達(dá)的LncRNA進(jìn)行分析［35］。精子是由精原干細(xì)胞分化而來的，研究報道Mrhl（Miotic recombination hot spot locus）、Neat1（Nuclear paraspeckle assembly transcript 1）和HongrES2等LncRNA調(diào)控精子發(fā)生過程。Mrhl通過與p68相互作用抑制Wnt通路，從而調(diào)控精子發(fā)生，干擾Neat1的表達(dá)會降低曲精小管中精子含量，HongrES2利用其產(chǎn)生的一段與miRNA類似的片段抑制CES7表達(dá)，導(dǎo)致精子獲能受到影響［14］。

3.2 LncRNA參與合子基因組激活

合子基因組激活（ZGA）對胚胎發(fā)育具有重要作用，LncRNA參與調(diào)控ZGA過程。Wang等［37］發(fā)現(xiàn)與內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄（Endogeneous retrovirues，ERVs）相關(guān)的Linc-GET對小 鼠ZGA過程至 關(guān)重 要，Linc-GET表達(dá)于小鼠胚胎著床前二細(xì)胞晚期到四細(xì)胞階段，其通過與ILF2（Interleukin enhancer binding factor 2）、FUBP1（Far upstream element binding protein 1）及hnRNPU（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U）形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，啟動ERVK、GLN和MERVL長末端重復(fù)序列順式調(diào)控活動，同時可降低ILF2、FUBP1和hnRNPU的表達(dá)，抑制RNA的可選擇性剪接。功能缺失實驗結(jié)果表明，Linc-GET缺失不僅會抑制MAPK信號通路，也會造成小鼠胚胎阻滯于二細(xì)胞時期G2階段。所以說Linc-GET對小鼠胚胎二細(xì)胞階段正確轉(zhuǎn)錄、合子激活、RNA可變剪接具有重要的調(diào)控作用。Hamazaki等［38］研究發(fā)現(xiàn)ZGA時期特定的LncRNA-Il17d（pancRNA）能夠順式增強其鄰近蛋白質(zhì)編碼基因白細(xì)胞介素家族成員Il17d的表達(dá)，從而驅(qū)動后續(xù)胚胎發(fā)育，敲低LncRNA-Il17d會導(dǎo)致胚胎死亡，過表達(dá)Il17d可以挽救上述致死現(xiàn)象。Linc28也被認(rèn)為是人和小鼠EGA網(wǎng)絡(luò)中的一個關(guān)鍵基因，其缺失會造成小鼠胚胎二細(xì)胞到四細(xì)胞階段的發(fā)育停滯。LncRNA-Gtl2在胚胎發(fā)育不同時期的表達(dá)模式及亞細(xì)胞定位有所變化，其對胚胎發(fā)育具有潛在重要作用，對囊胚細(xì)胞分化和體外擴張能力有影響，干細(xì)胞多能性因子和組蛋白修飾可以調(diào)控其表達(dá)［39］。以上研究表明LncRNA參與調(diào)控胚胎發(fā)育。

3.3 LncRNA參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞多能性

胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESCs）是具有多能性和自我更新能力的細(xì)胞，其可以分化為任何一種身體細(xì)胞類型，在研究胚胎發(fā)育過程中具有重要作用。為了研究LncRNA在ESCs中的作用及機制，研究人員通過微陣列和Chip-seq實驗，在小鼠體內(nèi)獲得了第一批將LncRNA與ESCs調(diào)控聯(lián)系起來的數(shù)據(jù)，研究表明，小鼠ESCs具有特定的LncRNA信號在分化過程中丟失，Guttman等［40］在小鼠ESCs中發(fā)現(xiàn)了1 000多個能夠編碼基因的LncRNAs。其中許多LncRNAs是由多能相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Sox2（sex determining region Y）、Oct4（Octamer-binding transcription factor 4）和Nanog調(diào)控，LncRNA表達(dá)水平的變化會改變Sox2、Oct4和Nanog的表達(dá)，導(dǎo)致小鼠ESCs發(fā)生轉(zhuǎn)錄組變異，進(jìn)而影響ESCs多能性和分化。以上研究表明LncRNA參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞多能性，其機制主要有結(jié)合表觀修飾物、吸附miRNA、與RNA結(jié)合蛋白作用這三種［14］。

4 展望

由于LncRNA所具有的多種分子生物學(xué)功能和其表達(dá)的時空特異性，有理由相信LncRNA在胚胎發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，但目前的研究多局限于LncRNA與疾病相關(guān)的方面，LncRNA參與調(diào)控胚胎發(fā)育的研究仍處于早期階段，與胚胎中已發(fā)現(xiàn)的LncRNA數(shù)量相比，現(xiàn)有的研究成果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，其如何調(diào)控胚胎發(fā)育過程的機制至今尚不完全清楚，有待科研工作者進(jìn)一步研究。所以鑒定多種物種胚胎中更多的LncRNA，并闡明關(guān)鍵LncRNA的調(diào)控機理將會是今后的主要研究方向，這將為疾病的早期預(yù)警及控制治療提供參考，為解決醫(yī)學(xué)難題開創(chuàng)新思路。