葉 暉，馮珍蘭，程 贏，蔡建明，蔣建明

(1.海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院，上海 200433;2.溫州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，浙江 溫州 325035;3. 海軍軍醫(yī)大學海軍醫(yī)學系，上海 200433)

電離輻射作為一種公認的環(huán)境致癌因素，在電離輻射暴露后的遠后效應中，輻射致癌是公眾關注的焦點。輻射致癌是一個十分復雜的過程[1-3]。流行病學研究表明，長期暴露于較低劑量輻射的人群患癌風險會增加，高劑量或高劑量率的電離輻射會顯著增加癌癥罹患率[4]。為進一步研究輻射致癌機制，我們以BALB/c小鼠為研究對象，建立了輻射誘導胸腺淋巴瘤(Radiation Induced Thymic Lymphoma, RITL)模型[5]。在該模型中，我們發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-200c等miRNAs在RITL組織中異常表達，而在正常胸腺組織中表達水平較低[6-7]。

miRNAs是一類長度約22個核苷酸、內(nèi)源性、呈單鏈短發(fā)卡結構的非編碼小RNA分子，可以沉默靶標mRNA，并以轉(zhuǎn)錄后方式調(diào)控靶標基因的表達[8-10]。研究表明，miRNAs廣泛參與人類癌癥進程，miRNAs的缺失或功能障礙會導致癌癥的進展。例如，miR-143和miR-145作為腫瘤抑癌基因，在胃腸道腫瘤、乳腺癌、肺癌腦轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[11-13]。

為了探討miR-200b在輻射誘導胸腺淋巴瘤中的作用與初步機制，在本研究中，我們首先建立RITL動物模型，檢測miR-200b在RITL樣本中的表達水平，隨后通過構建miR-200b敲低和過表達細胞系，檢測miR-200b表達變化對細胞增殖及凋亡的影響，并在此基礎上利用miRNA數(shù)據(jù)庫TargetScan預測miRNA潛在靶點，以進一步探究其可能的通路，最終明確miR-200b在輻射誘導胸腺淋巴瘤中的作用及其初步機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

胎牛血清購自美國Gibco公司，培養(yǎng)基、EDTA-胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Hyclone公司，電轉(zhuǎn)試劑(Amaxa Cell Line Nucleofector Kit)購自德國Amaxa公司，CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑購自日本同仁化學試劑公司，Annexin V-FITC/PI-PE凋亡試劑盒購自北京全式金公司，TRIzol試劑購自美國InvitroGen公司，miR-NC、miR-200b、Anti-miR-NC、Anti-miR-200b、TBK1質(zhì)粒為上海吉瑪公司產(chǎn)品。雙熒光素酶報告系統(tǒng)購買自Promega公司。熒光定量PCR儀為美國Thermofisher產(chǎn)品，流式細胞儀為美國Backman產(chǎn)品，酶標儀為BioTek產(chǎn)品。

1.2 動物飼養(yǎng)與模型建立

4～5周齡，雄性BALB/c小鼠購自海軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。每籠小鼠5～7只，體重(16±2) g，養(yǎng)于日夜交替采光、24 ℃恒溫動物房中。采取小鼠全身分隔照射的方式構建小鼠RITL模型，1.75 Gy/次(劑量率：0.58 Gy/min)，1次/周，共4周。照射后15個月后檢測BALB/c小鼠成瘤情況。照射源為海軍軍醫(yī)大學輻照中心60Co γ射線源。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC, American Type Culture Collection)，培養(yǎng)條件為DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日換液，隔日傳代。按照轉(zhuǎn)染miRNAs的不同將細胞分為miR-NC、miR-200b、Anti-miR-NC、Anti-miR-200b四組，隨后采用電穿孔法轉(zhuǎn)染miRNAs。miRNAs序列如下：miR-200b: 5’ -UAAUACUGC CUGGUAAUGAUGA-3’；anti-miR-200b: 5’-AU CAUUACCAGGCAGUA UAAAU-3’；miR-NC: 5’-UUCUCCGAACGUGUCAGGUTT-3-3’；anti-miR-NC: 5’ -UUGUACUACACAA AAGUACUG-3’。

1.4 RNA提取及QRT-PCR

采用Trizol法按照說明書提取總RNA，采用260/280 nm比值法測定樣品的RNA純度和濃度。采用上海吉瑪公司的Hairpin-itTM miRNA反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒。以GAPDH為內(nèi)參，使用比較Ct法計算miRNA的相對表達水平。miR-200b-3p引物：R 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA GGTATTTCGCACTGGATACGACTCATCA-3’，F(xiàn) 5’-GCCGGT AGCTTATCAGACTGA-3’。GAPDH引物：F 5’-AATGGATTTGGACGCATTGGT-3’，R 5’-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3’。

1.5 細胞活力與凋亡檢測

miRNAs轉(zhuǎn)染后24小時進行細胞活力與細胞凋亡的檢測。細胞活力利用酶標儀，采用CCK-8試劑進行檢測，相對細胞活力(%)=(A處理-A空白)/(A對照-A空白)×100%。細胞凋亡采用流式細胞術進行檢測，細胞進行Annexin V-FITC/PI-PE雙染色，室溫孵育15 min后進行流式細胞術分析，凋亡率=100%-左下象限%(FITC-/PE-)。

1.6 miRNA靶點預測和熒光素酶測定

利用miRNA數(shù)據(jù)庫TargetScan(http://www.targetscan.org/index.html)分析miRNA潛在靶點。采用Promega公司雙熒光素酶報告系統(tǒng)按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.7 TBK1蛋白水平流式檢測

細胞消化后離心，經(jīng)75%乙醇固定、 0.5% Triton-X打孔后，使用PBS重懸，按照1∶1 000的抗體濃度標記胞內(nèi)TBK1，室溫孵育15 min后采用流式細胞儀檢測。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均值±單次測量標準差表示。兩組之間的差異情況采用兩獨立樣本t檢驗進行比較。單因素方差分析(ANOVA)用于符合正態(tài)分布且方差齊的3組及3組以上之間差異的比較。采用Spearman相關分析方法分析TBK1蛋白與miR-200b表達水平的相關性，p<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-200b在RITL組織的表達情況

為了檢測miR-200b在RITL組織中的表達，我們首先在3對RITL組織樣本(樣本T1、T2和T3)中進行micro-array，以小鼠的正常胸腺組織樣本(N1、N2、N3)作為對照，結果示于圖1。如圖1A所示，miR-200b在RITL樣本(T1、T2、T3)中的表達水平顯著下降。隨后對9對RITL組織和正常胸腺組織中的miR-200b進行qRT-PCR驗證，如圖1B所示，在RITL組織中miR-200b水平明顯低于正常胸腺組織。表明miR-200b在RITL組織中顯著下調(diào)，提示miR-200b可能在RITL中發(fā)揮作用。

(A) miR-200b在RITL和正常胸腺組織中的表達水平；(B) qRT -PCR檢測9對RITL組織和正常胸腺組織中miR-200b的相對表達，將每對正常胸腺組織中miR-200b的相對表達水平歸一化為1；N：正常胸腺組織，T：RITL組織。

2.2 過表達與敲低miR-200b細胞模型的建立

隨后以NIH/3T3細胞為實驗對象，通過轉(zhuǎn)入miR-NC、miR-200b、Anti-miR-NC、Anti-miR-200b構建miR-200b過表達與敲低細胞模型，并采用qRT-PCR驗證，結果示于圖2。如圖2所示，miR-200b電轉(zhuǎn)可上調(diào)NIH/3T3細胞內(nèi)miR-200b水平8倍左右，而Anti-miR-200b電轉(zhuǎn)可下調(diào)NIH/3T3內(nèi)miR-200b表達水平約40%～50%。

圖2 miR-200b過表達與敲低細胞模型的建立

2.3 過表達或敲低miR-200b對細胞增殖及凋亡的影響

為了檢測miR-200b表達水平對細胞增殖的影響，我們采用CCK-8檢測細胞增殖，結果示于圖3。如圖3A/B所示，過表達miR-200b可抑制NIH/3T3細胞增殖，敲低miR-200b則促進NIH/3T3細胞增殖。隨后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)如圖3C/D所示過表達miR-200b后NIH/3T3細胞凋亡率顯著升高，而敲低miR-200b后NIH/3T3細胞凋亡率降低。這表明過表達miR-200b可明顯抑制細胞增殖，增加細胞凋亡，而下調(diào)miR-200b后可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。

(A/B) CCK-8檢測細胞活力，(C/D) 流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.4 miR-200b潛在作用靶點的預測與驗證

為了探討miR-200b的潛在作用靶點，我們利用miRNA數(shù)據(jù)庫TargetScan進行預測，發(fā)現(xiàn)TBK1的3’UTR序列能夠與miR-200b序列互補配對，這提示TBK1可能是miR-200b的潛在作用靶點。隨后通過突變TBK1的3′UTR結合位點(圖4A)，發(fā)現(xiàn)與無miRNAs組和陰性對照組相比，miR-200b使野生型TBK1 3′UTR組的熒光素酶活性顯著降低，而對突變TBK1 3′UTR組的熒光素酶活性沒有顯著影響(圖4B)，這表明miR-200b可能以3’UTR依賴的方式靶向TBK1。

(A)通過miRNA數(shù)據(jù)庫TargetScan分析miR-200b潛在靶點；(B)雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)。

2.5 RITL組織中TBK1與miR-200b表達水平的相關關系

為了進一步探討miR-200b與TBK1的關系，我們通過流式細胞術檢測9對RITL組織和正常胸腺組織單細胞懸液中TBK1的蛋白表達水平，并通過qRT -PCR檢測這9對RITL組織和正常胸腺組織中miR-200b的表達水平。研究結果如圖5所示，RITL組織內(nèi)TBK1表達顯著上調(diào)，TBK1蛋白表達水平與miR-200b表達呈負相關關系，這提示miR-200b通過抑制TBK1的mRNA翻譯來靶向抑制TBK1，即miR-200b轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控TBK1表達。

(A/B/C/D) 流式細胞術和QRT-PCR檢測9例RITL組織和胸腺組織中TBK1和miR-200b的表達水平；(E) Spearman相關分析檢測TBK1和miR-200b表達水平的相關性。

2.6 TBK1對miR-200b介導生物學作用的影響

為了進一步研究TBK1是否介導了miR-200b的作用，將miR-200b與TBK1共轉(zhuǎn)染NIH/3T3細胞，結果如圖6所示。流式細胞術結果顯示，與對照組相比，miR-200b組TBK1蛋白表達降低，而miR-200b+TBK1組TBK1蛋白表達升高。與miR-200b組相比，miR-200b+TBK1組細胞顯著增殖、凋亡率下降。這表明TBK1逆轉(zhuǎn)了miR-200b促凋亡和抑制增殖的作用。

(A) 流式細胞儀檢測TBK1相對表達水平；(B) CCK-8法檢測細胞活力；(C) 流式細胞儀檢測細胞凋亡。

3 討論

輻射致癌是輻射暴露后嚴重的遠后效應之一，越來越受到輻射相關專業(yè)人員和公眾的關注。電離輻射作為一種強致癌因素，可誘發(fā)、促進腫瘤進展。對廣島和長崎原子彈爆炸幸存者進行的流行病學研究發(fā)現(xiàn)，高劑量和高劑量率電離輻射顯著增加了患實體瘤和白血病的風險[14-16]。Kei Nakachi等對原子彈爆炸后幸存者中結直腸癌患者研究發(fā)現(xiàn)，輻射暴露可能通過微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)促進結直腸癌的發(fā)生[15]。此外，長期受到較低劑量輻射照射的輻射工作者群體的隨訪結果也提示罹患腫瘤的風險增加[17-18]。盡管輻射可致腫瘤發(fā)生的風險增加這一事實已被公認，但輻射致癌的機制尚不清楚[19-20]。國內(nèi)外圍繞這一難點開展過不少研究，既往研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射暴露會導致腫瘤微環(huán)境內(nèi)的“炎癥轉(zhuǎn)換”，會激活促存活的腫瘤相關通路，通過影響HIF-1α調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中輻射誘導的缺氧與血管生成、通過調(diào)節(jié)金屬基質(zhì)蛋白酶重構細胞外基質(zhì)等。其中NF-κB、HIF和STAT信號通路是調(diào)控輻射致癌進程中的關鍵信號通路，可通過調(diào)控多個下游基因介導輻射誘導的癌變[21]。

作為輻射致癌的一種，輻射誘導的胸腺淋巴瘤不僅是事故性暴露人群中常見的輻射遠后效應之一，也是臨床上胸部腫瘤患者放療后急需關注的重要問題之一。目前關于輻射致癌的具體機制仍不清楚。miRNA作為一種非編碼RNA小分子，已被證明在腫瘤發(fā)生、腫瘤進展等生物學進程中發(fā)揮關鍵作用，這使得識別癌癥特異性或與相關miRNA及其靶點對于更好地理解腫瘤發(fā)生機制至關重要[22-23]。本課題組通過構建RITL模型，已發(fā)現(xiàn)多條在RITL的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用的miRNAs，包括miR-21、miR-143、miR-486等[5,7]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與正常胸腺組織相比，miR-200b在RITL中顯著下調(diào)，這提示miR-200b可能為抑癌miRNA。隨后通過構建敲低與過表達細胞株，通過CCK-8與流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染miRNAs的NIH/3T3細胞的增殖與凋亡情況，以確定miR-200b對體外細胞的影響。結果顯示，過表達miR-200b可明顯抑制細胞增殖，增加細胞凋亡，而下調(diào)miR-200b后可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。

TANK結合激酶1(TBK1)作為非經(jīng)典IκB激酶(IKK)，在核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號通路中發(fā)揮著重大作用，且不同于經(jīng)典IKK，TBK1能夠磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)，調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素表達水平，在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重大作用[24-26]。TBK1在腫瘤、免疫、自噬等發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用[27-28]，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的潛在治療靶點[29-30]。本研究通過miRNA靶點預測和雙熒光素酶報告基因的使用，確認TBK1為miR-200b的直接作用靶點，且TBK1蛋白表達量與miR-200b表達量呈負相關。隨后通過功能回復實驗發(fā)現(xiàn)TBK1可部分逆轉(zhuǎn)miR-200b促進細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用，證明miR-200b通過靶向TBK1發(fā)揮促進細胞凋亡和抑制細胞增殖的生物學效應，提示miR-200b可能通過抑制TBK1，從而發(fā)揮抗RITL的作用(見圖7)。

圖7 下調(diào)miR-200b通過靶向TBK1促進輻射誘導的胸腺淋巴瘤進展

綜上所述，我們的結果表明，輻射誘導胸腺淋巴瘤組織中miR-200b表達下調(diào)，而其直接靶點TBK1表達上調(diào)，這提示靶向調(diào)控miR-200b/TBK1，可為防治輻射誘導胸腺淋巴瘤提供一種潛在的新途徑。