馬學(xué)峰，茹超，劉雨晴，宋雪，魯周民

（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

植物精油是芳香植物的高度濃縮提取物，油狀液體物質(zhì)，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，具有揮發(fā)性，存在于植物根、莖、葉和花果中，其主要化學(xué)成分有單萜、倍半萜烯、酯、醛、酮、醇等，有特殊氣味[1]。提取植物精油的方法主要有壓榨法[2]、水蒸氣蒸餾法[3]、有機(jī)溶劑萃取法[4-5]、超臨界CO2萃取法[6-7]等。有機(jī)溶劑萃取法是利用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑與材料在連續(xù)提取器中加熱，低溫蒸去提取液溶劑，殘留精油[8]，具有設(shè)備簡(jiǎn)單，精油提取率高，對(duì)有效成分有良好的選擇性等優(yōu)點(diǎn)[9]，被廣泛應(yīng)用于檸檬[10]、千層金[11]、玫瑰[12]等植物精油的提取。超聲輔助提取技術(shù)是利用超聲波的能量破除植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而加速溶質(zhì)溶出擴(kuò)散，提高植物有效組分從固相到液相的傳質(zhì)速率，實(shí)現(xiàn)精油的高效提取[13]。超聲波輔助提取與傳統(tǒng)的萃取法相比，具有萃取率高、減少耗能、處理量大、成分易于分離、凈化等優(yōu)點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)單、安全性好，被用于柑橘葉[14]、丁香[15]、洋蔥[16]等植物精油的提取研究。

獅頭柑（Citrusreticulata Blanco cv.Manau Gan）屬于蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus.L）中的柑類，為陜西安康特有經(jīng)濟(jì)林果[17]。獅頭柑果面粗糙，形似獅子頭，由此而得名[18]。其果肉晶瑩剔透、汁多渣少、酸甜適度、后味微苦，具有降火明目、清熱解毒、生津止咳等多重功效[19]。近年來(lái)，有關(guān)獅頭柑研究的文獻(xiàn)報(bào)道逐漸增多，趙丹等[20]以獅頭柑皮為原料，研究獅頭柑皮果醬的制作方法；王杰[21]利用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)獅頭柑果皮和果肉的總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究；孟瑤瑤等[22]利用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化獅頭柑籽油的提取工藝，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定獅頭柑籽油中的脂肪酸組分；張涵[19]對(duì)獅頭柑果肉、果皮的香氣成分進(jìn)行檢測(cè)，并將香氣成分與市場(chǎng)上常見(jiàn)的柑橘品種蘆柑、臍橙、砂糖桔進(jìn)行了比較。但在果皮提取精油方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究以陜西安康地區(qū)的獅頭柑果皮為原料，采用超聲輔助溶劑萃取法在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)，篩選獅頭柑精油的最優(yōu)提取工藝參數(shù)，并對(duì)獅頭柑精油的成分進(jìn)行分析，旨在為獅頭柑果皮的利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獅頭柑果皮樣品：2020年12月采摘自安康北亞熱帶經(jīng)濟(jì)林果樹(shù)試驗(yàn)示范站，皆為隨機(jī)采摘。選取果形飽滿、成熟度一致、無(wú)機(jī)械損傷的獅頭柑洗凈晾干后剝出其果皮作為樣品，置于-15℃冰箱內(nèi)密封保存?zhèn)溆谩?/p>

石油醚（沸程60℃～90℃）、乙酸乙酯、正己烷、無(wú)水乙醇、異丙醇（以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純）：成都市科隆化學(xué)藥品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（JJ500Y型，精度0.01）：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；電子分析天平（R200D型，精度0.0001）：德國(guó)Sartorious公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGG-9140型）：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；冰箱（BCD-215DC型）：中國(guó)海爾集團(tuán)；數(shù)控超聲波清洗器（KH-500DE型）：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀（1310型）：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；佳聲多功能粉碎機(jī)（800C）：永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；真空泵（SHB-Ⅲ）：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-201D型）：上海秋佐科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萃取工藝流程

參照葉征美等[11]的方法萃取獅頭柑果皮精油，并稍作修改。

獅頭柑果皮樣品（鮮樣去白皮）→加液氮冷凍粉碎2 min→統(tǒng)一粒徑小于20目并將所有樣品混合均勻→取一定質(zhì)量的樣品加有機(jī)溶劑混合→超聲輔助萃取→抽濾得提取液→50℃減壓旋蒸至冷凝器1 min內(nèi)無(wú)液體滴落→稱量→計(jì)算獅頭柑精油提取率→置于4℃冰箱內(nèi)密封保存。

1.3.2 提取溶劑的選擇

提取方法與選用溶劑的種類參考文獻(xiàn)[8，23]。取獅頭柑果皮樣品5份，每份30g，分別溶于石油醚、正己烷、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、異丙醇中，在料液比 1∶5（g/mL），超聲溫度50℃，超聲功率60 W條件下超聲90 min，測(cè)定獅頭柑精油提取率。取不同溶劑提取物，滴一滴于雙圈定性濾紙上，測(cè)定擴(kuò)散直徑，重復(fù)3次。

1.3.3 料液比對(duì)獅頭柑精油提取率的影響

取獅頭柑果皮樣品5份，每份30 g，放入旋蓋廣口瓶中，分別以料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入不同體積的石油醚，在超聲溫度50℃，超聲功率50 W的條件下超聲120 min，測(cè)定獅頭柑精油提取率，重復(fù)3次。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)條件參考文獻(xiàn)[24]，并根據(jù)實(shí)際情況稍作修改。

1.3.4.1 不同超聲時(shí)間對(duì)獅頭柑精油提取率的影響

取獅頭柑果皮樣品6份，每份30 g，放入旋蓋廣口瓶中，以料液比1∶15（g/mL）加入石油醚，在超聲溫度50℃，超聲功率50 W的條件下，分別超聲30、60、90、120、150、180 min，測(cè)定獅頭柑精油提取率，重復(fù)3次。

1.3.4.2 不同超聲溫度對(duì)獅頭柑精油提取率的影響

取獅頭柑果皮樣品6份，每份30 g，放入旋蓋廣口瓶中，以料液比1∶15（g/mL）加入石油醚，超聲功率50W，分別在超聲溫度 30、35、40、45、50、55 ℃條件下超聲90 min，測(cè)定獅頭柑精油提取率，重復(fù)3次。

1.3.4.3 不同超聲功率對(duì)獅頭柑精油提取率的影響

取獅頭柑果皮樣品6份，每份30g，放入旋蓋廣口瓶中，以料液比1∶15（g/mL）加入石油醚，超聲溫度50℃，分別在超聲功率為 50、60、70、80、90、100 W 條件下超聲90 min，測(cè)定獅頭柑精油提取率，重復(fù)3次。

1.3.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，在萃取溶劑為石油醚，料液比 1∶15（g/mL）的條件下，參考文獻(xiàn)[25]，選取超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率3個(gè)因素，按照表1中的因素水平，以獅頭柑精油提取率為指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交優(yōu)化試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.3.6 精油提取率計(jì)算

式中：m1為提取精油質(zhì)量，g；m2為稱取獅頭柑樣品質(zhì)量，g。

1.3.7 獅頭柑精油成分測(cè)定與分析

1.3.7.1 獅頭柑精油成分測(cè)定

將萃取所得精油用正己烷將濃度稀釋為0.1%，裝入樣品瓶中供GC-MS分析使用。

色譜分析條件：TG-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始柱溫為 50 ℃，保持 1 min，以3.0℃/min升溫至130℃，保持1 min，以2℃/min升溫至150℃，保留1 min，以10℃/min升溫至280℃，保持5 min，高純氦氣作載氣，載氣為恒流模式，載體流量1.000 mL/min，進(jìn)樣口溫度 250 ℃，分流比 40∶1。

質(zhì)譜條件：EI（70 eV），接口和離子源的溫度分別為280℃和270℃，掃描范圍為40 aum～460 aum。

1.3.7.2 數(shù)據(jù)篩選

利用Xcalibur系統(tǒng)NIST 2014譜庫(kù)（美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院2014譜庫(kù)）對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)檢索對(duì)照，根據(jù)所得到的各個(gè)物質(zhì)的分子式、CAS號(hào)以及分子結(jié)構(gòu)確定每個(gè)化學(xué)成分并利用面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與統(tǒng)計(jì)，采用Origin 2021進(jìn)行制圖，使用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同肩標(biāo)小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑選擇試驗(yàn)結(jié)果

不同溶劑浸提精油的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同溶劑浸提精油的結(jié)果Table 2 Results of essential oil extraction in different solvents

由表2可知，不同有機(jī)溶劑的提取效果不同，精油提取率存在明顯差異，精油性狀也有較大不同。從溶劑極性來(lái)看，無(wú)水乙醇>異丙醇>乙酸乙酯>石油醚>正己烷，獅頭柑精油的主要成分D-檸檬烯、萜品烯等屬于弱極性或中等極性物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，石油醚與正己烷萃取的效果較好。從結(jié)果來(lái)看，使用正己烷和石油醚作為萃取溶劑，萃取的獅頭柑精油品質(zhì)較好，精油呈現(xiàn)澄清的金黃色，擴(kuò)散性好，具有獅頭柑特有的芳香氣息。乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、異丙醇等作為萃取溶劑時(shí)均存在不同程度的雜質(zhì)，這是由于獅頭柑中的一些蠟、油脂、膠質(zhì)、樹(shù)脂等成分在回流中溶解在有機(jī)溶劑中，抽濾未能完全除去。此外，使用石油醚比使用正己烷具有更低的成本。綜上所述，選取石油醚作為最優(yōu)萃取溶劑。

2.2 料液比對(duì)獅頭柑精油提取率的影響

料液比對(duì)獅頭柑精油提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)獅頭柑精油提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil

隨溶劑體積的增加，獅頭柑精油提取率提高，在料液比為1∶15（g/mL）時(shí)達(dá)到最大，為2.38%。這可能是增加溶劑用量時(shí)，溶劑中獅頭柑精油的濃度會(huì)降低，從而增大了獅頭柑精油與溶劑接觸界面處的濃度差，即增大了傳質(zhì)推動(dòng)力，提高了傳質(zhì)速率[24]。之后隨著溶劑體積的不斷增加，旋蒸濃縮時(shí)間增加，造成獅頭柑精油的部分低沸點(diǎn)成分隨溶劑旋蒸出去，獅頭柑精油提取率下降。綜合考慮，較適宜的料液比為1∶15（g/mL）。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 超聲時(shí)間對(duì)獅頭柑精油提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)獅頭柑精油提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)獅頭柑精油提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的增加，獅頭柑精油的提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在90min時(shí)達(dá)到最大，為2.41%。這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)加劇細(xì)胞破碎，利于獅頭柑精油在有機(jī)溶劑中的溶出。而繼續(xù)延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間，獅頭柑精油的提取率基本保持不變。為確保有機(jī)溶劑盡可能地旋蒸出去，超聲處理時(shí)間選擇90 min。

2.3.2 超聲溫度對(duì)獅頭柑精油提取率的影響

超聲溫度對(duì)獅頭柑精油提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)獅頭柑精油提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on yield of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil

由圖3可知，獅頭柑精油提取率隨著超聲溫度的增加而增加，在50℃時(shí)達(dá)到最大，為2.42%。繼續(xù)增加溫度，提取率反而下降。這可能是因?yàn)?，?dāng)溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致獅頭柑精油中熱敏性物質(zhì)的氧化和揮發(fā)，從而造成提取率的下降[24]。另外，升高溫度會(huì)加大能耗和成本，50℃是比較適宜的超聲溫度。

2.3.3 超聲功率對(duì)獅頭柑精油提取率的影響

超聲功率對(duì)獅頭柑精油提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲功率對(duì)獅頭柑精油提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil

由圖4可知，獅頭柑精油提取率隨著超聲功率的增加而先增加后減少，在60 W時(shí)達(dá)到最大，為2.27%，這是由于空化作用和機(jī)械剪切作用增強(qiáng)，分子擴(kuò)散速度增強(qiáng)，有利于精油的提取[26]。繼續(xù)增加功率，提取率下降，這可能是因?yàn)楣β蔬^(guò)高導(dǎo)致空化作用繼續(xù)增加，使獅頭柑原料停留在超聲場(chǎng)中的時(shí)間減少，減小了水溶劑向獅頭柑組織內(nèi)滲透的幾率，導(dǎo)致精油得率下降[26]。另外，升高功率則會(huì)加大能耗和成本，綜合考慮，選擇超聲功率為60 W。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率3個(gè)因素，以精油提取率為指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果如表3所示，影響?yīng){頭柑果皮精油提取率各因子的方差分析見(jiàn)表4。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test

表4 影響?yīng){頭柑精油提取率各因子的方差分析Table 4 Analysis of variance（ANOVA）of factors affecting the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan

從表3極差R值可以看出，獅頭柑精油提取率影響因素的大小順序?yàn)槌暅囟?gt;超聲功率>超聲時(shí)間。由表4方差分析結(jié)果可知，超聲溫度影響差異顯著。試驗(yàn)組合A3B2C2是最優(yōu)組合，即超聲時(shí)間120 min，超聲溫度50℃，超聲功率60 W，經(jīng)過(guò)對(duì)這一組合進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，提取率分別為2.44%、2.48%、2.48%，平均值為2.47%，高于正交試驗(yàn)中的組合。

2.5 有機(jī)溶劑萃取法提取獅頭柑精油的成分分析

對(duì)提取的精油進(jìn)行成分分離與鑒定，總離子流色譜圖如圖5所示。所得質(zhì)譜圖經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)照、根據(jù)相似度指數(shù)（similarity index，SI）和反相相似度指數(shù)（reverse similarity index，RSI）值，人工圖譜分析和可靠性篩選[27-28]后，初步確認(rèn)了19種化學(xué)成分，分析結(jié)果如表5所示。

圖5 獅頭柑精油成分總離子流色譜圖Fig.5 Total ion flow chromatogram of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil components

表5 獅頭柑精油GC-MS分析結(jié)果Table 5 GC-MS analysis of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil

從超聲輔助溶劑提取法制得的獅頭柑精油中共鑒定出19種相對(duì)百分含量較多的目標(biāo)組分，其中幾乎均為單萜類及其氧化物，占?xì)庀喑龇蹇傒腿∥锏?6.67%。其中屬于單萜烯類化合物7種，總含量為96.22%，它們分別是α-蒎烯、左旋-β-蒎烯、α-月桂烯、D-檸檬烯、羅勒烯、萜品烯、α-異松油烯；屬于單萜醇類化合物2種，總含量為0.38%，它們分別是芳樟醇、松油醇；屬于單萜醛類化合物只有1種，為香茅醛，含量為0.07%。

這些被鑒定出的化學(xué)組分多是各種食品添加劑、香料等的有效組分，同時(shí)在其他柑橘精油中可見(jiàn)分布，但含量有所差異。從超聲波輔助溶劑提取法制得的精油中相對(duì)含量最高的物質(zhì)是D-檸檬烯，占?xì)庀喑龇蹇傒腿∥锏?1.23%，但在對(duì)柑橘精油的相關(guān)研究中可知，D-檸檬烯對(duì)柑橘精油香味的貢獻(xiàn)很小，而其他萜烯類、醇類、醛類和酯類相對(duì)含量雖然很低，但它們卻是果實(shí)香味主要來(lái)源[29]。

3 結(jié)論

超聲輔助溶劑萃取獅頭柑精油的適宜溶劑為石油醚、適宜料液比為1∶15（g/mL），在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為超聲溫度50℃，超聲功率60 W條件下超聲120 min，獅頭柑精油的提取率為2.47%。氣相色譜-質(zhì)譜分析表明，獅頭柑精油中共鑒定出19種化學(xué)成分，分別含有烯、醇、酯、醛、芳香、烷烴類等化合物，其中D-檸檬烯為主成分，間二甲苯、α-蒎烯、α-月桂烯、萜品烯、芳樟醇相對(duì)含量較高，這些物質(zhì)的共同作用形成了獅頭柑精油特有的香味。