黃艷麗，李成華，楊永林，周曉龍，尹錦榮，虞志君，趙猛*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665000；2.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)健康科普工作站，云南 普洱 665000）

多依果又稱栘衣果，是薔薇科栘[木衣]屬熱帶植物云南栘[Docynia delavayi（Franch.）Schneid.]的果實(shí)，在我國(guó)主產(chǎn)于云南、貴州等地[1-3]。其藥食兼用，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和多酚類活性成分，具有健胃消食和抗衰老等功能[4-6]。多依果是云南地方特色水果，僅云南糯扎渡鎮(zhèn)種植面積就達(dá)12 000多畝。

多依果的常見吃法是舂碎后拌以調(diào)料生吃，但因質(zhì)地酸澀不符合外地人口味，受限于地域環(huán)境難以推廣。其傳統(tǒng)加工方式有泡果、果醬、果飲料等多種形式[7-9]，但方式簡(jiǎn)單，附加值低。相關(guān)研究表明，多依果富含抗氧化活性成分[10-18]，將其釀造成果醋，盡可能的保存其功能性成分，可大大增加多依果的經(jīng)濟(jì)效益，推動(dòng)多依果產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展。

10月份～12月份是多依果的成熟采摘期，此時(shí)云南普洱室溫（17℃～24℃）可滿足多依果發(fā)酵溫度條件。本研究以云南特色水果多依果為原料，室溫（17℃～24℃）條件下，經(jīng)過醋酸發(fā)酵，以總酸度、可溶性固形物含量及感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化多依果醋的釀造工藝參數(shù)，并對(duì)其總黃酮成分和體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，旨在釀造一款較好保存多依果抗氧化活性功能的果醋，為多依果的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多依果（成熟期）：市售；安琪果酒酵母：安徽中科中佳公司；醋酸菌：山東和眾康源生物科技有限公司。

焦亞硫酸鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆?。兌燃?jí)別≥98%）、DPPH、ABTS（分析純）：合肥博美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LH-B55數(shù)顯折光儀：杭州陸恒生物科技有限公司；GMK-702R糖度測(cè)定儀：北京西諾遠(yuǎn)大科技有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；pH-100手持式pH計(jì)：上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多依果醋加工工藝流程及操作要點(diǎn)

1.3.1.1 加工工藝流程

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

（1）鮮果準(zhǔn)備：挑選成熟期多依果鮮果，洗凈，晾干。

（2）打漿：鮮果去皮、切塊，按料液比 1∶2（g/mL）稱重、加水、打漿。

（3）酶解：果漿中添加0.2%的果膠酶，室溫（17℃～24℃）酶解 6 h。

（4）糖度調(diào)整：添加26%的白砂糖，以達(dá)到多依果酒精發(fā)酵所需的酒精度（10.8%vol）要求。

（5）滅菌：添加二氧化硫（60 mg/kg）進(jìn)行滅菌。

（6）酵母菌接種：稱取4%的酵母菌粉，水浴活化30 min，接入發(fā)酵液中。

（7）初始pH值調(diào)整：加入檸檬酸，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值為3.4。

（8）酒精發(fā)酵：室溫（17℃～24℃）發(fā)酵6 d。

（9）酒精度調(diào)整：加水稀釋多依果酒至試驗(yàn)所需酒精度。

（10）醋酸菌接種：按試驗(yàn)所需稱取醋酸菌粉，活化培養(yǎng)48 h，接入發(fā)酵液中。

（11）裝料：按試驗(yàn)所需比例將調(diào)配好的原料裝入發(fā)酵罐中。

（12）醋酸發(fā)酵：室溫（17℃～24℃）發(fā)酵試驗(yàn)所需時(shí)間。

（13）過濾：發(fā)酵液紗布過濾，得多依果醋成品。

1.3.2 多依果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，得初始發(fā)酵適宜條件為初始酒精度7%vol、醋酸菌接種量0.3%、裝料量40%，室溫（17℃～24℃）發(fā)酵15 d。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以可溶性固形物含量、酸度和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察初始酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol）、醋酸菌添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、裝料量（20%、30%、40%、50%、60%）和發(fā)酵時(shí)間（9、12、15、18、21 d）對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響。

1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)，選擇初始酒精度（A）、醋酸菌接種量（B）、裝料量（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為考察因子，以感官評(píng)分為響應(yīng)值（Y），采用Box-Behnken試驗(yàn)方法進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 多依果醋釀造工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of D.delavayi fruit vinegar

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.3.1 感官評(píng)定

多依果醋感官評(píng)定參照NY/T 2987—2016《綠色食品果醋飲料》中感官檢驗(yàn)與要求制定，具體評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 多依果醋酸發(fā)酵感官評(píng)分Table 2 Sensory evaluation standards of D.delavayi fruit vinegar

1.3.3.2 理化和微生物指標(biāo)

總酸參照GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定》中酸堿指示劑滴定法測(cè)定；可溶性固形物含量參考GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中折光計(jì)法測(cè)定；菌落總數(shù)參考GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定；大腸菌群計(jì)數(shù)參照GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》測(cè)定。

1.3.3.3 總黃酮含量的測(cè)定

總黃酮含量參考SN/T 4592—2016《出口食品中總黃酮的測(cè)定》測(cè)定。

1.3.3.4 體外抗氧化活性測(cè)定

抗氧化性參考GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性測(cè)定 DPPH和ABTS法》測(cè)定。

樣品溶液多依果醋的制備：采用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)釀造的多依果產(chǎn)品；原果汁：果肉與水料液比1∶2（g/mL）；維生素 C：0.15%維生素 C 水溶液。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design-Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始酒精度對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響

初始酒精度對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響見圖1。

圖1 初始酒精度對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of initial alcohol content on acetic fermentation of D.delavayi fruit

由圖1可知，初始酒精度在5%vol～9%vol時(shí)，隨著酒精度的增加，多依果醋的總酸度呈先上升后趨于平緩的趨勢(shì)，感官評(píng)分和可溶性固形物含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在初始酒精度為7%vol時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高（89分），總酸度為4.0 g/100 mL。酒精度大于7%vol后，產(chǎn)酸量逐步放緩，也影響果醋的口感[19]。因此，綜合考慮選取醋酸發(fā)酵初始酒精度為7%vol。

2.1.2 醋酸菌接種量對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響

醋酸菌接種量對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 醋酸菌接種量對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of acetic acid bacteria on acetic fermentation of D.delavayi fruit

由圖2可知，醋酸菌接種量在0.1%～0.5%時(shí)，隨著醋酸菌的增加，多依果醋的總酸度呈先上升后趨于平緩的趨勢(shì)，感官評(píng)分和可溶性固形物含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在醋酸菌接種量為0.4%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高（91分），總酸度為4.2 g/100 mL。醋酸菌接種量大于0.4%后，產(chǎn)酸量變化很小，果醋的口感反而下降。因此，綜合考慮選取醋酸菌接種量為0.4%。

2.1.3 裝料量對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響

裝料量對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響見圖3。

圖3 裝料量對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of loading amount on acetic fermentation of D.delavayi fruit

由圖3可知，裝料量在20%～60%時(shí)，隨著裝料量的增加，多依果醋的總酸度和可溶性固形物含量均呈先上升后趨于平緩的趨勢(shì)，感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在裝料量為40%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高（88分），總酸度為4.3 g/100 mL。裝料量大于40%后，雖然產(chǎn)酸量增多，但果醋的口感下降。因此，綜合考慮選取醋酸發(fā)酵裝料量為40%。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多依果醋發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of fermentation time on acetic fermentation of D.delavayi fruit

由圖4可知，發(fā)酵時(shí)間在9 d～21 d時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，多依果醋的總酸度呈先上升后平緩的趨勢(shì)，感官評(píng)分和可溶性固形物含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵時(shí)間為15 d時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高（91分），總酸度為4.5 g/100 mL。發(fā)酵15 d后，總酸度變化較小，果醋口感反而下降。因此，選取醋酸發(fā)酵時(shí)間為15 d。

2.2 醋酸發(fā)酵響應(yīng)面優(yōu)化與分析

感官評(píng)價(jià)是果醋的重要指標(biāo)，因此醋酸發(fā)酵試驗(yàn)以感官評(píng)分為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 醋酸發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 3 Experimental result of response surface design of acetic fermentation

表4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

感官評(píng)分（Y）回歸擬合方程：Y=92.60+0.67A+0.75B+1.08C-1.00D+0.50AB+1.50AC-3.00AD-1.50BC+0.25BD+1.75CD-6.63A2-3.76B2-7.51C2-4.63D。由表4可知，模型P值＜0.000 1，達(dá)到高度顯著水平，表明所得方程有意義；失擬項(xiàng)P值為0.880 8，不顯著，表明所構(gòu)建的模型合理，與試驗(yàn)的差異較??；相關(guān)系數(shù)R2pred為0.947 0，調(diào)整系數(shù)R2adj為0.971 4，變異系數(shù)＜3%，表明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值有較好的相關(guān)性，誤差較小；模型的信噪比為25.906，遠(yuǎn)大于4，則表明該模型適用于多依果醋酸發(fā)酵感官評(píng)分的預(yù)測(cè)。在該模型中，一次項(xiàng)A、B、C、D 和交叉項(xiàng) AC、AD、BC、CD 以及二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其他因素組合對(duì)結(jié)果無(wú)顯著影響（P＞0.05）。根據(jù)F值大小可知，4個(gè)因素對(duì)多依果酒發(fā)酵影響的順序：初始酒精度（A）＞裝料量（C）＞發(fā)酵時(shí)間（D）＞醋酸菌接種量（B）。

根據(jù)回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得多依果醋酸發(fā)酵的最優(yōu)條件：初始酒精度7.18%vol，醋酸菌接種量0.41%，裝料量40.6%，發(fā)酵時(shí)間14.52 d，在此工藝條件下，多依果醋的感官評(píng)分理論值為92.88分。根據(jù)實(shí)際情況將工藝參數(shù)修正為初始酒精度7%vol，醋酸菌接種量0.4%，裝料量40%，發(fā)酵時(shí)間15 d。按修正后的工藝參數(shù)值進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到多依果醋的實(shí)際感官評(píng)分為94分，與理論值相對(duì)誤差為1.20%。由此可知，采用響應(yīng)面法優(yōu)化多依果醋釀造工藝條件是準(zhǔn)確可行的，模型可用。

2.3 多依果醋品質(zhì)分析

對(duì)按照最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)制備的多依果醋進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定和品質(zhì)分析。

2.3.1 感官評(píng)定

多依果醋為黃橙色，具有多依果的特征香氣，酸甜適中，口感諧調(diào)，感官評(píng)分為94分。

2.3.2 理化和微生物指標(biāo)測(cè)定

多依果醋可溶性固形物含量為（11.3±0.03）%，總酸含量為（4.42±0.15）g/100 mL，菌落總數(shù)為（12.5±1.1）CFU/mL，大腸菌群未檢出。多依果果醋各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均符合NY/T 2987—2016《綠色食品果醋飲料》的標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.3.3 活性成分總黃酮含量分析

黃酮類化合物有保護(hù)心血管系統(tǒng)和提高人體免疫力的功效，而且在清除自由基方面也作用明顯[20]。以蘆丁含量y（mg/mL）為縱坐標(biāo)，吸光度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.030 2x-0.000 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 050。經(jīng)計(jì)算得多依果醋中總黃酮含量為（3.83±0.12）mg/L。

2.3.4 多依果醋體外抗氧化活性分析

將多依果醋對(duì)DPPH和ABTS+自由基的清除能力與多依果的原果汁、維生素C相比較，結(jié)果如圖5所示。

圖5 多依果醋、原果汁和維生素C對(duì)DPPH和ABTS+自由基清除能力Fig.5 The free radical scavenging ability of DPPH and ABTS+of fruit vinegar，raw juice and vitamin C

多依果醋、原果汁和維生素C對(duì)DPPH和ABTS+自由基清除能力變化趨勢(shì)基本一致，隨著樣品用量的增加而逐漸增大，均呈現(xiàn)持續(xù)上升后趨于平緩的總體趨勢(shì)。維生素C作為純凈物，對(duì)DPPH和ABTS+自由基清除能力始終略高于多依果醋和多依果的原果汁。從圖5A可知，樣品用量在0.4 mL～1.6 mL時(shí)，多依果醋、原果汁對(duì)DPPH自由基的清除率持續(xù)上升，且多依果醋對(duì)DPPH自由基的清除能力略高于原果汁；隨后變化趨勢(shì)趨于平緩，果醋對(duì)DPPH自由基的清除率最高達(dá)到86.8%。從圖5B可知，樣品用量在0.1 mL～0.3 mL時(shí)，多依果醋、原果汁對(duì)ABTS+自由基的清除率持續(xù)上升，較低量時(shí)多依果醋對(duì)ABTS+自由基的清除能力略低于原果汁，但隨著樣品用量的增加，多依果醋的清除率逐漸高于原果汁；隨后變化趨勢(shì)趨于平緩，多依果醋對(duì)ABTS+自由基的清除率最高達(dá)到80.2%。由此可知，多依果醋較好的保留了多依果的抗氧化活性成分。

3 結(jié)論

多依果室溫（17℃～24℃）下經(jīng)酒精發(fā)酵得果酒，酒精稀釋后進(jìn)一步醋酸發(fā)酵制得多依果醋。通過Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)和優(yōu)化多依果醋酸發(fā)酵工藝，以感官評(píng)分為響應(yīng)值確定最佳醋酸發(fā)酵工藝參數(shù)為初始酒精度7%vol、醋酸菌接種量0.4%、裝料量40%和發(fā)酵時(shí)間15d。在此優(yōu)化釀造工藝條件下，多依果醋為黃橙色，具有多依果的特征香氣，酸甜適中，口感諧調(diào)，感官評(píng)分為 94分，總酸含量為（4.42±0.15）g/100 mL，各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均符合NY/T 2987—2016《綠色食品果醋飲料》的標(biāo)準(zhǔn)要求。同時(shí)，測(cè)得多依果醋中總黃酮含量為（3.83±0.12）mg/L，對(duì) DPPH 和 ABTS+自由基的清除率最高可達(dá)86.8%和80.2%，果醋自由基清除率與多依果的原果汁相近而略低于維生素C。多依果醋較好的保留了多依果的總黃酮和抗氧化活性成分。