張靜文， 李紅

(上海中醫(yī)藥大學(xué) 附屬龍華醫(yī)院 內(nèi)分泌科, 上海 200032)

Graves眼病(Graves’ ophthalmopathy，GO)是一種累及眼眶的自身免疫性炎癥性疾病，重者會(huì)影響患者的視力[1]，并且會(huì)影響患者的心理健康，導(dǎo)致患者自殺風(fēng)險(xiǎn)增加2.71倍[2-3].由于缺乏統(tǒng)一公認(rèn)的動(dòng)物模型，該病病因與發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明確，建立理想的GO模型對(duì)進(jìn)一步探究GO非常關(guān)鍵.一個(gè)理想的GO動(dòng)物模型，應(yīng)具備如下特征:(1)存在有活性的促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)抗體，至少有促甲狀腺激素結(jié)合抑制性免疫球蛋白(thyrotropin binds to inhibitory immunoglobulin, TBII)，最好是甲狀腺刺激性抗體(thyroid stimulating antibody, TSAb).(2)甲狀腺有相應(yīng)的病理改變.(3)有類似于GO的眼部特征，如突眼、眼裂增大、上眼瞼攣縮、眼球運(yùn)動(dòng)受限或伴球結(jié)膜充血.(4)出現(xiàn)類似于GO的眼部組織病理改變：如眼外肌肥大水腫、眼外肌結(jié)構(gòu)的破壞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和眼眶脂肪積聚.(5)眼部改變特征持久穩(wěn)定.目前的造模方法存在與人類疾病表現(xiàn)和特征不相符、成模率低、造模周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、重復(fù)性差等缺點(diǎn).國(guó)內(nèi)外學(xué)者為求建立理想GO動(dòng)物模型進(jìn)行了不同建模方法的探索，下面就國(guó)內(nèi)外關(guān)于GO建模方法作一匯總.

最早的突眼模型構(gòu)建可追溯到1936年，Smelser[4]采用垂體提取物聯(lián)合甲狀腺切除術(shù)，使實(shí)驗(yàn)豚鼠發(fā)生嚴(yán)重突眼，且眼眶內(nèi)容物重量增加40%，病理提示眼眶組織水腫、糖胺聚糖積聚以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn).而此造模方法切除了甲狀腺組織，與臨床所見GO患者甲狀腺解剖完整的特征不符，所以未被認(rèn)可.自此，國(guó)內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了不同造模方式的探索，目前，GO建模方法主要有(1)TSHR直接免疫.(2)基因免疫.包括用TSHR的全長(zhǎng)cDNA和TSHR A亞基免疫，細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式包括①直接肌肉注射;②基因槍法;③脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法;④電穿孔轉(zhuǎn)染法;⑤腺病毒感染.(3)細(xì)胞免疫.(4)藥物誘導(dǎo).(5)蛋白免疫.(6)蛋白聯(lián)合藥物免疫.(7)其他.

Nagayama等[5]以編碼全長(zhǎng)TSHR的腺病毒為載體，將該病毒肌內(nèi)注射于BALB/c、C57BL/6、CBA/J、SJL/J和DBA/1J品系小鼠，3周免疫一次，共免疫3次，55%的雌性BALB/c和33%的雄性BALB/c和25%的雌性C57BL/6小鼠血清甲狀腺素4 (thyroxine 4，T4)水平升高，且促甲狀腺素受體抗體(thyrotropin receptor antibody, TRAb)陽(yáng)性，而雌性CBA/J、DBA/1J、SJL/J小鼠均未出現(xiàn)Graves病(Graves disease, GD)或TRAb陽(yáng)性.Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，BALB/c小鼠攜帶一種顯性基因，所以較C57BL/6小鼠更容易誘發(fā)甲狀腺功能亢進(jìn).Moshkelgosha等[7]使用人促甲狀腺激素受體(human thyroid stimulating hormone receptor, hTSHR)A亞基質(zhì)粒電穿孔法在BALB/c (H-2d)和C57BL/6小鼠中進(jìn)行遺傳免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠誘發(fā)甲狀腺功能亢進(jìn)的頻率較低且眼眶病理正常，BALB/c小鼠眼眶組織出現(xiàn)炎癥和脂肪生成.綜上，BALB/c小鼠為GO易感品系，故目前造模小鼠品系多采用BALB/c小鼠.目前有國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)哺乳動(dòng)物獼猴與小鼠的GD動(dòng)物模型進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，獼猴生理生化及免疫指標(biāo)更接近人類，但相較于小鼠，其造模周期長(zhǎng)，造模率低[8]，通過哺乳動(dòng)物構(gòu)建GO模型有待進(jìn)一步探索.

1 TSHR直接免疫

目前認(rèn)為，GO中T細(xì)胞的初始活化是由自身抗原啟動(dòng)的，前脂肪細(xì)胞中表達(dá)的TSHR可能是甲狀腺細(xì)胞與受感染的外周組織共同的抗原[9].Costagliola等[10]用人類TSHR的胞外結(jié)構(gòu)域(extracellular domain, ECD)免疫BALB/c小鼠后，15只雌性小鼠中僅4只存活，甲狀腺均有嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，主要包括活化的T細(xì)胞，也有B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞存在，此造模方式雖出現(xiàn)甲狀腺的病理改變，但缺乏眼征的描述.

2 基因免疫

基因免疫是目前認(rèn)可度最高且使用最廣的造模方式，TSHR是目前比較公認(rèn)的GO自身抗原，TSHR是G蛋白耦聯(lián)受體之一，具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，由胞外A亞基、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)B亞基組成，通過二硫鍵連接在一起形成異源二聚體[11].Chen等[12]研究表明，與全長(zhǎng)TSHR免疫相比，體內(nèi)TSHR A亞基可增加GD疾病的發(fā)病率.pUBC和pCDNA3.1(+)均為常用質(zhì)粒，前者含泛素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，后者含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，龍文[13]使用上述兩種質(zhì)粒脂質(zhì)轉(zhuǎn)染構(gòu)建GD小鼠模型，再次證實(shí)TSHR A亞基較全長(zhǎng)TSHR有更高的誘導(dǎo)率，所以現(xiàn)基因免疫多選擇TSHR A亞基.基因免疫的原理主要是基于動(dòng)物對(duì)外來抗原的反應(yīng)性，自身免疫激活后，激活的T淋巴細(xì)胞通過識(shí)別甲狀腺與眼眶的交叉抗原進(jìn)入甲狀腺及眼眶，導(dǎo)致甲狀腺和眼眶病變.國(guó)內(nèi)外學(xué)者近年來采用不同的轉(zhuǎn)染方式提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，試圖增加成模率.Costagliola等[14]通過肌肉注射表達(dá)人TSHR的重組質(zhì)粒免疫雌性BALB/c小鼠，免疫方案為每3周注射1次，共免疫3次，18周處死老鼠，結(jié)果10(10/14)只小鼠表現(xiàn)出TBII及TBAb活性，F(xiàn)T4水平正常，甲狀腺出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為B淋巴細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，但是甲狀腺濾泡細(xì)胞未見破壞，并且推斷未能誘發(fā)TSAb及甲狀腺功能亢進(jìn)可能與使用近交系小鼠的遺傳背景有關(guān).所以Costagliola等[15]采用相同方式免疫遠(yuǎn)交系NMRI小鼠，每4周注射1次，共注射4次，16周處死小鼠，結(jié)果5(5/29)只雌性小鼠血清總T4水平升高，TSH水平降低，相比之下，1(1/30)只雄性小鼠血清總T4升高，TSH值無法檢測(cè).5(5/29)只雌性小鼠TSAb升高，1(1/30)只雄性小鼠TSAb升高，甲狀腺功能亢進(jìn)的動(dòng)物出現(xiàn)甲狀腺腫大，并伴有廣泛的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn).此外，這些動(dòng)物表現(xiàn)出與GO相似的眼部癥狀，包括眼外肌纖維水腫、因無定形物質(zhì)(可能為糖胺聚糖)沉積而出現(xiàn)分離，脂肪細(xì)胞出現(xiàn)肥大細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn).此研究證明了遺傳因素在發(fā)病中的作用，并顯示了性別因素對(duì)發(fā)病的影響.后來，學(xué)者通過基因免疫或細(xì)胞免疫誘發(fā)了近交系BALB/c小鼠甲亢及TSAb水平升高.

余毅愷等[16]對(duì)比研究基因槍金顆粒包裹質(zhì)粒免疫與普通質(zhì)粒肌肉注射發(fā)現(xiàn)，基因槍質(zhì)粒組FT4水平及TRAb活性明顯高于質(zhì)粒肌肉注射組，此造模方式甲狀腺病理未改變，且未描述眼征，但可推測(cè)基因槍法細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于肌肉注射，為我們提供了一種新的細(xì)胞轉(zhuǎn)染思路.龍文[13]通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建GD小鼠模型，研究結(jié)果顯示8只小鼠中1只濾泡腔擴(kuò)大，1只濾泡上皮細(xì)胞水腫，6只甲狀腺未見明顯病理改變，未描述眼征.近年來大量學(xué)者采用過表達(dá)TSHR A單位的重組質(zhì)粒電穿孔體內(nèi)轉(zhuǎn)染BALB/c小鼠，每3周免疫1次，共免疫4次，末次免疫后2周處死小鼠，免疫小鼠出現(xiàn)甲狀腺功能亢進(jìn)，T4及TRAb水平顯著升高，甲狀腺增大，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞肥大和增生，伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并且造模小鼠出現(xiàn)眼裂增寬，眼外肌和球后組織可見淋巴細(xì)胞、透明質(zhì)酸和脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變[17-21].Schluter等[22]用TSHR A亞基質(zhì)粒免疫雌雄小鼠，所有小鼠均出現(xiàn)TSAbs、T4值升高，甲狀腺增生，眼部出現(xiàn)炎癥改變，眼球突出，但雄鼠比雌鼠早；vivo1H/19f系列磁共振成像顯示炎癥浸潤(rùn)升高，脂肪體積增加，糖胺聚糖沉積，且最顯著的是雌性小鼠；組織學(xué)上，雄性小鼠表現(xiàn)為T細(xì)胞浸潤(rùn)、棕色脂肪增生及膠原沉積，雌性小鼠的肌肉和結(jié)締組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、肌肉肥大，提示性別可能影響疾病的表型.前期該項(xiàng)目組以TSHR為抗原，將人TSHR基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過脛骨前肌肉注射聯(lián)合電穿孔方式對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行基因免疫，造模第18周小鼠眼眶周圍出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，眶周紅腫；HE染色顯示甲狀腺呈炎癥改變，濾泡增生變大，部分濾泡腔內(nèi)物質(zhì)吸收，濾泡腔可見均勻紅染的膠質(zhì)，間質(zhì)明顯增多，有數(shù)量不等的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，眼球后出現(xiàn)大量脂肪堆積和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；血清TRAb升高，成模率約50%.綜上，電穿孔轉(zhuǎn)染法構(gòu)建的模型優(yōu)于其他兩種轉(zhuǎn)染方式構(gòu)建的模型，眼征表現(xiàn)與人類類似，但成模率仍有待提高.

Nagayama等[5]通過腺病毒免疫BALB/c、C57BL/6、CBA/J、SJL/J、DBA/1J品系小鼠誘導(dǎo)Graves甲亢，55%雌性、33%雄性BALB/c[H-2(d)]和25%雌性C57BL/6[H-2(b)]小鼠出現(xiàn)血清甲狀腺素T4水平升高，幾乎所有甲狀腺功能亢進(jìn)小鼠均出現(xiàn)TSAb水平升高，56%雄性、84%雌性BALB/c[H-2(d)]出現(xiàn)TBII水平升高，甲狀腺出現(xiàn)濾泡細(xì)胞肥大及增生，但此模型小鼠眼肌未見明顯變化.湯陽(yáng)等[23]通過人TSHR A亞基構(gòu)建的重組腺病毒(Ad-TSHR289)注射誘導(dǎo)GD模型，于第1、4周2次免疫7周成模，成模率100%，較2017年3次免疫10周成模，時(shí)間縮短3周[24].腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠甲亢發(fā)病率及抗體陽(yáng)性率較高，但以上幾種造模方式均未見眼征描述.既往國(guó)外學(xué)者采用TSHR A亞基重組腺病毒構(gòu)建GO模型，僅觀察到小鼠眼外肌纖維化[25]，但最近有國(guó)內(nèi)學(xué)者采用表達(dá)人TSHR A亞基的重組腺病毒構(gòu)建GO模型，9次免疫注射后，小鼠出現(xiàn)眼外肌纖維化、球后脂肪堆積、眼球突出、結(jié)膜發(fā)紅、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)及眼征改變[26].

TSHR為目前比較公認(rèn)且研究最多的自身抗原，近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其他可能導(dǎo)致GO的自身抗原進(jìn)行了研究.胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)被認(rèn)為是Graves眼病的第二種抗原[27-29]，近期研究發(fā)現(xiàn)，替妥木單抗——一種可抑制IGF-1R的人源單克隆抗體，已成為GO的新興靶向治療藥物，可明顯改善患者的突眼度、活動(dòng)性評(píng)分及生活質(zhì)量評(píng)分[30-32].但有研究學(xué)者利用IGF1R A亞基重組質(zhì)粒通過電穿孔方式免疫雌性BALB/c小鼠，未能誘發(fā)Graves眼病相關(guān)表型[33]，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

G2S為一種新發(fā)現(xiàn)的眼外肌抗原，在甲狀腺、眼外肌、骨骼肌均有表達(dá)，Yamada等[34]采用表達(dá)hTSHR及G2S的重組質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BALB/c雌性小鼠及CD-1(雜合子)雌性小鼠，單獨(dú)或聯(lián)合使用 IL-4及IL-12的cDNA，每4周免疫1次，共免疫4次,結(jié)果大多數(shù)BALB/c小鼠均出現(xiàn)眼肌異常，眼肌纖維游離水腫，肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，但兩種小鼠均未出現(xiàn)甲狀腺病理改變，所有CD-1小鼠均出現(xiàn)上述眼征變化.

3 細(xì)胞免疫

自身免疫性甲狀腺疾病中，主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ, MHCⅡ)在甲狀腺上皮細(xì)胞上的異常表達(dá)首先由Bottazzo等[35]發(fā)現(xiàn).因此，同時(shí)表達(dá)TSHR和MHCⅡ的甲狀腺細(xì)胞可能可作為非專職抗原呈遞細(xì)胞，在自身免疫性甲狀腺疾病的誘導(dǎo)和/或加重發(fā)展過程中發(fā)揮作用.基于這種原理，Shimojo等[36]通過同時(shí)轉(zhuǎn)染人TSHR和MHCII類分子的成纖維細(xì)胞對(duì)APK/N雌性小鼠進(jìn)行免疫，每2周免疫1次，共免疫6次，多數(shù)雌鼠(80%～93%)產(chǎn)生TBII，20%小鼠出現(xiàn)TSAb，21%小鼠出現(xiàn)T4水平升高，甲狀腺出現(xiàn)GD樣病理性改變：甲狀腺腫大，甲狀腺細(xì)胞增生并侵入濾泡腔.Kita-Furuyama等[37]用表達(dá)人TSHR的重組腺病毒感染的同源骨髓來源的樹突狀細(xì)胞重復(fù)免疫雌性BALB/c小鼠，每3周免疫2次或3次，14周處死小鼠，29%小鼠出現(xiàn)TSAb升高，71%小鼠產(chǎn)生TBII,36%小鼠出現(xiàn)T4水平升高，甲狀腺病理顯示：彌漫性甲狀腺腫大，甲狀腺細(xì)胞增生、肥大、侵入濾泡腔，病理顯示眼外肌完整.Kaithamana等[38]用表達(dá)小鼠或人TSHR的hM12細(xì)胞免疫BALB/c小鼠，免疫小鼠在第90天產(chǎn)生對(duì)TSHR的自身抗體，在第180天出現(xiàn)甲狀腺功能亢進(jìn).上述細(xì)胞免疫造模方式證明，專職抗原呈遞細(xì)胞及非專職抗原呈遞細(xì)胞可能參與疾病的形成過程，雖均未描述或出現(xiàn)眼眶病理改變，卻是細(xì)胞免疫造模的突破性嘗試，為造模方式提供了一種新思路.

張琳[39]用 hTSHR 活化的脾細(xì)胞免疫同源 BALB/c小鼠構(gòu)建GO模型，免疫后4周處死動(dòng)物，與重組質(zhì)粒免疫組相比，成模率提高25%，約50%小鼠眼眶組織出現(xiàn)明顯黏液變性、水腫，并且眼眶局部出現(xiàn)纖維組織和脂肪組織增生，肌纖維透明變性斷裂，與人類GO眼征更相符，雖有甲狀腺功能亢進(jìn)的血清學(xué)表現(xiàn)，但TRAb沒有升高.李秀娟[40]通過脾細(xì)胞免疫BALB/c 小鼠構(gòu)建GO模型，52.6%造模組小鼠出現(xiàn)眼眶組織病理學(xué)改變，脂肪組織增生，眼眶組織水腫，肌纖維局灶性透明變形，伴有少量、散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，電鏡提示眼外肌原纖維排列紊亂，血清學(xué)指標(biāo)提示模型組TT4水平較對(duì)照組明顯升高，TSH顯著降低，TRAb與對(duì)照組無差異.Nakahara等[41]發(fā)現(xiàn)敲除TSHR的KO小鼠容易被GD的自身抗原TSHR免疫.然而，由于TSHR KO小鼠缺乏內(nèi)源性TSHR，這些小鼠不可能發(fā)生類似于GD的甲狀腺功能亢進(jìn).所以用小鼠TSHR 的A亞基通過腺病毒免疫TSHR KO小鼠，將小鼠TSHR活化的脾細(xì)胞免疫裸鼠，結(jié)果2(2/9)只小鼠出現(xiàn)TSAB陽(yáng)性，2(2/9)只小鼠眼眶脂肪組織及眼外肌組織中出現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn).綜上，脾細(xì)胞免疫成模率較高，眼征與人類類似，但TRAb水平未見升高.

4 藥物免疫

臨床經(jīng)過I131治療的患者常出現(xiàn)GO表現(xiàn)，為模擬臨床治療過程，涂云海等[42-43]用I131灌胃大鼠制造甲狀腺功能低下狀態(tài)后，用含左旋T4藥物混懸液灌胃制備GO模型，HE染色示處理組大鼠眼外肌局部出現(xiàn)淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，血管數(shù)量增多，電鏡示眼眶組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯，并可見巨噬細(xì)胞，出現(xiàn)甲狀腺功能亢進(jìn)的血清學(xué)表現(xiàn)，TRAb升高，此造模方式在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與血清學(xué)指標(biāo)方面與人類疾病表現(xiàn)相似，但與人類眼眶病理特征仍有差異.

5 蛋白免疫

岳瑞宏[44]通過采用TSHR胞外段羧基端免疫BALB/c 小鼠，每2周免疫1次，共免疫4次，第60天處死小鼠，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠T4水平下降，TRAb陽(yáng)性，甲狀腺出現(xiàn)病理改變，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞形狀飽滿，膠質(zhì)含量豐富.此造模方式未描述眼征.

6 蛋白聯(lián)合藥物免疫

李方都等[45]采用腹腔注射hTSHR，8周后腹腔注射I131構(gòu)建甲狀腺功能減退及甲狀腺相關(guān)眼病模型，實(shí)驗(yàn)組眼眶組織出現(xiàn)水腫，肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，且隨著I131劑量增加，出現(xiàn)脂肪組織及纖維組織增生，肌纖維變形斷裂，此研究證實(shí)甲減可伴甲狀腺相關(guān)眼病存在，但此造模方式與GO發(fā)病機(jī)制仍有差異.

7 其他

近來有學(xué)者為評(píng)估CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性自身免疫過程是否參與了GO的發(fā)病機(jī)制，用酵母菌酶A處理SKG小鼠，小鼠表現(xiàn)為眼眶組織的炎癥反應(yīng)和眼眶脂肪的增加，但在眼外肌沒有發(fā)現(xiàn)表型變化[46]，為構(gòu)建GO模型提供了一種新思路，并且從新角度探索了疾病的發(fā)病機(jī)制.

8 小結(jié)

各種方法構(gòu)建的模型各有優(yōu)點(diǎn)和不足，目前基因免疫是認(rèn)可度和使用度最廣的造模方式，其中使用TSHR A亞基質(zhì)粒通過電穿孔方式構(gòu)建的模型成模率還有待提高，近來有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境可能會(huì)影響模型的特征.腺病毒免疫構(gòu)建的模型眼征方面描述較少，但甲亢發(fā)病率及抗體陽(yáng)性率較高，此模型有待進(jìn)一步探索完善.TSHR A亞基重組腺病毒構(gòu)建的GO模型眼征表現(xiàn)與人類相似，但共需免疫9次，造模周期較其他方式明顯延長(zhǎng).hTSHR A亞基活化脾細(xì)胞免疫構(gòu)建的模型病理表現(xiàn)與人類基本相符，但TRAb水平未見升高.綜上，TSHR A亞基質(zhì)粒電穿孔方式、TSHR A亞基重組腺病毒注射免疫及脾細(xì)胞過繼免疫方式是目前相對(duì)理想的造模方式，但如何構(gòu)建與人類疾病更相符、成模率更高的模型，還需進(jìn)一步探索.

作者貢獻(xiàn)聲明

張靜文：撰寫論文；李紅：提出研究思路和框架，修改論文.

利益沖突聲明

本研究未到任何第三方企業(yè)、公司的資助，不存在任何利益沖突.