李曉梅，羅 清

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤研究室，遵義 563003

目前針對(duì)乳腺癌的早期監(jiān)測(cè)及治療體系日趨成熟，但乳腺癌患者的死亡率仍然位居女性惡性腫瘤死亡率的首位。復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是引起乳腺癌患者死亡率升高的主要原因。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與腫瘤內(nèi)存在一群數(shù)量極少，但有腫瘤起始能力的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)密切相關(guān)[1]，CSCs較多的乳腺癌患者生存率普遍較低[2]。更重要的是，CSCs可引起患者對(duì)現(xiàn)有治療方法的耐藥，導(dǎo)致乳腺癌患者面臨“少藥”甚至“無(wú)藥”的難題[3]。鑒于CSCs在乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥中具有重要的作用，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)CSCs并開(kāi)發(fā)靶向CSCs的治療藥物對(duì)乳腺癌治療具有重要的臨床意義。本文對(duì)乳腺癌干細(xì)胞在乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥以及治療方面的最新研究進(jìn)行了總結(jié)，旨在為消滅乳腺癌干細(xì)胞，抑制乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展提供依據(jù)。

1 乳腺癌干細(xì)胞的分離和鑒定

乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells，BCSCs)是乳腺癌腫瘤內(nèi)極少數(shù)具有自我更新與多向分化能力的干細(xì)胞亞群，它的分離和鑒定是基于獨(dú)特的細(xì)胞表面標(biāo)志物，目前公認(rèn)且最常用的是CD44/CD24和乙醛脫氫酶1(ALDH1)。CD44+CD24-和(或)ALDH1+細(xì)胞構(gòu)成的乳腺癌干細(xì)胞樣群體，可以通過(guò)流式細(xì)胞儀[4]、免疫磁珠[5]以及無(wú)血清微球體懸浮培養(yǎng)[6]等方式富集。在乳腺癌組織的原代培養(yǎng)細(xì)胞中CD44+CD24-、ALDH1+、CD44+CD24-ALDH1+細(xì)胞比例分別為7.2%、4.6%、1.5%，其自我更新、增殖、侵襲及成瘤能力依次由弱至強(qiáng)[7]。此外，以CD44+CD24-為特征的間充質(zhì)樣BCSCs主要是靜止的，定位于腫瘤浸潤(rùn)前端，而上皮樣BCSCs表達(dá)ALDH，具有增生性，且位于更中心位置[8]?？捎昧魇郊?xì)胞儀對(duì)分選和富集的細(xì)胞進(jìn)行鑒定與CSCs陽(yáng)性率的統(tǒng)計(jì)[9]，用于下游功能研究。

2 乳腺癌干細(xì)胞對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響

2.1 乳腺癌干細(xì)胞與乳腺癌復(fù)發(fā)

復(fù)發(fā)是指腫瘤經(jīng)過(guò)放化療或手術(shù)等治療后腫瘤再次出現(xiàn)的現(xiàn)象。盡管乳腺癌的治療取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，但乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍然高達(dá)23.4%，其原因與BCSCs密切相關(guān)[10-12]。常規(guī)的放化療只能針對(duì)增殖活躍的BCSCs，但對(duì)靜息狀態(tài)BCSCs無(wú)殺滅作用。因此可能不足以完全根除BCSCs，而殘留的BCSCs在被適當(dāng)?shù)男盘?hào)激活后往往會(huì)引起腫瘤復(fù)發(fā)。

BCSCs可在某些轉(zhuǎn)錄因子以及炎癥因子刺激下促進(jìn)乳腺癌的復(fù)發(fā)。Hong等[13]研究表明，轉(zhuǎn)錄因子RUNX1通過(guò)抑制BCSCs活性以及直接下調(diào)ZEB1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制小鼠乳腺脂肪墊內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，慢性炎癥在乳腺癌復(fù)發(fā)的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[14]。Segatto等[15]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者手術(shù)后傷口排出的液體富含細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，它們可通過(guò)STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)具有干細(xì)胞樣表型的BCSCs富集，進(jìn)而引起術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)。

近年來(lái)研究也表明BCSCs參與乳腺癌復(fù)發(fā)往往離不開(kāi)一些信號(hào)通路的調(diào)控。Baker等[16]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者經(jīng)長(zhǎng)期曲妥珠單抗治療后，乳腺癌耐藥株中BCSCs數(shù)量明顯增多，這一結(jié)果是通過(guò)Notch-1-PTEN-ERK1/2信號(hào)通路的激活導(dǎo)致的。其研究顯示，當(dāng)敲除Notch-1基因后，BCSCs成球能力隨之降低，而這種效應(yīng)在敲除PTEN基因時(shí)，被一定程度的抑制。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MEK1/2抑制劑可完全抑制轉(zhuǎn)染Notch-1、PTEN或Notch-1和PTEN siRNA細(xì)胞的成球能力，表明Notch-1通過(guò)PTEN抑制使ERK1/2過(guò)度激活，進(jìn)一步激活體內(nèi)外BCSCs，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[16]。另外，Wnt信號(hào)通路與BCSCs介導(dǎo)的乳腺癌復(fù)發(fā)有關(guān)。Choi等[17]發(fā)現(xiàn)，CSCs調(diào)節(jié)因子CDK12的高表達(dá)可激活Wnt或ErbB-PI3K-AKT信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)BCSCs的自我更新和激活腫瘤形成能力，導(dǎo)致乳腺癌的復(fù)發(fā)。

2.2 乳腺癌干細(xì)胞與乳腺癌轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的標(biāo)志，也是導(dǎo)致乳腺癌患者及其他癌癥患者死亡的主要原因之一[18]。BCSCs可能是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，當(dāng)特殊的干性標(biāo)志物高表達(dá)或在腫瘤微環(huán)境(趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子以及蛋白)作用下可促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

CD44和ALDH的表達(dá)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移正相關(guān)。研究表明，在異種移植模型中，來(lái)自肺轉(zhuǎn)移的乳腺癌腫瘤細(xì)胞CD44表達(dá)明顯升高，且與ALDH-細(xì)胞相比，ALDH+細(xì)胞具有更高的轉(zhuǎn)移能力。此外，CD44+CD24-細(xì)胞的數(shù)量與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也顯著相關(guān)。研究表明，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌患者中有69.0%檢測(cè)到CD44+CD24-表型，而無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌患者中有51.7%檢測(cè)到CD44+CD24-[19-20]。同樣，與非轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織相比，轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中CD44高表達(dá)，而CD24的表達(dá)水平較低[21]?？梢?jiàn)，BCSCs可能是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，當(dāng)CD44和ALDH等干性標(biāo)志物高表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

此外，BCSCs在一些特定的腫瘤微環(huán)境作用下可發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，這一轉(zhuǎn)變使BCSCs獲得某些特性從而促進(jìn)了乳腺癌的轉(zhuǎn)移。在腫瘤微環(huán)境中，TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT與侵襲遷移的主要誘因[22-23]。Katsuno等[24]發(fā)現(xiàn)，BCSCs生成和治療抗性的增加，與TGF-β促進(jìn)乳腺上皮和癌細(xì)胞中穩(wěn)定的EMT有關(guān)。相反，抑制TGF-β能抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT和BCSCs形成；從而降低乳腺癌肺轉(zhuǎn)移[25]。

值得注意的是，BCSCs發(fā)生增殖與轉(zhuǎn)移也可直接由某些趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子及蛋白調(diào)控。研究顯示，在BCSCs亞群中趨化因子受體CXCR3B明顯上調(diào)，異位表達(dá)CXCR3B可增加ALDH活性或CD44+CD24-的BCSCs數(shù)量，并增加細(xì)胞克隆形成能力，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移與侵襲[26]。此外，Sirkisoon等[27]研究顯示，BCSCs中CD44、Nanog、Sox2和OCT4等干性基因可被轉(zhuǎn)錄因子TGLI1轉(zhuǎn)錄激活，導(dǎo)致BCSCs的更新，促進(jìn)轉(zhuǎn)移起始部位BCSCs發(fā)生腦轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)，休眠BCSCs在自噬相關(guān)蛋白7(ATG7)、ATG3或p62/sequestosome-1低表達(dá)時(shí)，調(diào)控BCSCs中6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3異常表達(dá)，從而導(dǎo)致增殖程序和轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的重新激活，促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[28]。

2.3 乳腺癌干細(xì)胞與乳腺癌耐藥

耐藥仍然是癌癥治療中的持續(xù)挑戰(zhàn)，常常導(dǎo)致抗癌療效的減低。BCSCs本身對(duì)新輔助化療具有內(nèi)在抗性[29]。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)ALDHs或CD44細(xì)胞群的乳腺癌患者對(duì)化療具有更高的耐受性，因?yàn)樵摷?xì)胞具有BCSCs的特征，對(duì)常規(guī)化療具有耐藥性[30]。Ryoo等[31]發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CD44導(dǎo)致CD44+的BCSCs中p62相關(guān)的NRF2激活，進(jìn)一步促進(jìn)了CD44+BCSCs的耐藥。ALDH1活性的增加與介導(dǎo)多藥耐藥相關(guān)，抑制ALDH1能增加乳腺癌患者對(duì)紫杉醇的敏感性[32]。同樣，ALDH1+的BCSCs在化療藥物順鉑治療抵抗中也起重要作用，當(dāng)減少ALDH+的BCSCs時(shí)，順鉑的化療效果顯著增強(qiáng)[33]。此外，BCSCs中ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)增高可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的多藥耐藥[34]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，乳腺癌組織中ABCC1與ABCC3轉(zhuǎn)錄水平較高；并且在化療或抗癌藥物治療后兩種蛋白的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步增加，當(dāng)將ABCC1或ABCC3兩個(gè)蛋白敲除后，BCSCs干性基因的表達(dá)降低，化療敏感性明顯增加。而ABCC3敲除還降低了CD44+CD24-的BCSCs亞群，增加了異種移植小鼠模型體內(nèi)阿霉素的敏感性。ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的高表達(dá)可將治療藥物從細(xì)胞中外排，導(dǎo)致BCSCs治療抵抗，通過(guò)抑制ABCG2可促進(jìn)BCSCs死亡，減少治療耐藥[35]?？梢?jiàn)，BCSCs中ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)增高會(huì)導(dǎo)致腫瘤治療的多藥耐藥，反之，抑制BCSCs中ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)可減少治療腫瘤時(shí)多藥耐藥的發(fā)生。

長(zhǎng)期以來(lái)，活性氧(ROS)的產(chǎn)生一直被認(rèn)為是化療耐藥的重要介質(zhì)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，BCSCs可能通過(guò)增強(qiáng)ROS促進(jìn)乳腺癌患者的耐藥[36]。Yang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，ALDH+的BCSCs和ALDH-的癌細(xì)胞具有不同水平的ROS，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成可增加順鉑的化療敏感性。同樣，Lee等[37]發(fā)現(xiàn)化療后，BCSCs中MYC和MCL1過(guò)表達(dá)，MYC和MCL1可促進(jìn)線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致BCSCs耐藥性增加。

3 乳腺癌干細(xì)胞的靶向治療策略

BCSCs在介導(dǎo)乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥中具有關(guān)鍵作用，目前BCSCs靶向治療策略主要有：細(xì)胞靶向治療、基因靶向治療以及納米靶向治療等。靶向清除BCSCs可能是克服乳腺癌患者治療失敗和提高患者預(yù)后的有效策略。

例如，在細(xì)胞靶向治療中，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)已成為一種有前景的靶向CSCs治療劑[38]。Mandal等[39]使用海藻酸鈉將圍產(chǎn)期組織沃頓膠(WJMSCs)中的MSCs封裝到微珠中，以研究其對(duì)BCSCs的影響。結(jié)果顯示，用封裝的WJMSCs(eWJMSCs)處理BCSCs降低了細(xì)胞活力，抑制遷移并發(fā)揮抗血管生成作用。進(jìn)一步基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，eWJMSCs能抑制BCSCs增殖標(biāo)志物、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、EMT相關(guān)標(biāo)志物和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。此外，研究也發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和microRNA(miRNA)可調(diào)控CSCs增殖，在靶向惡性腫瘤治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[40-42]。lncRNA CCAT2通過(guò)促進(jìn)OCT4、Nanog和KLF4等干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，增加乳腺球的形成，誘導(dǎo)三陰性乳腺癌中ALDH+BCSCs數(shù)量[43]。miR-205在CD44+CD24-的BCSCs中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-205可降低乳腺癌細(xì)胞中CD44+CD24-群百分比與細(xì)胞活性[44]。在HER2+乳腺癌中，miR-200c的高表達(dá)可導(dǎo)致CD44+CD24-的BCSCs細(xì)胞數(shù)量明顯減少[45]。分析BCSCs和患者轉(zhuǎn)移性腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，在BCSCs中miR-200c的表達(dá)水平降低，而miR-30c的表達(dá)水平升高，這與接受新輔助治療的Ⅱ/Ⅲ期患者中分離出的乳腺腫瘤組織表達(dá)水平相似[46]。因此，針對(duì)miRNA可能有助于開(kāi)發(fā)靶向BCSCs的治療藥物。

近期一種靶向BCSCs的方法應(yīng)用分子導(dǎo)向納米技術(shù)有效地控制藥物輸送和釋放，不但提高了CSCs對(duì)藥物的吸收，而且增加了藥物在細(xì)胞內(nèi)的停留和釋放。Das等[47]研究發(fā)現(xiàn)，Wedelolactone-encapsulated納米可通過(guò)下調(diào)Sox2和ABCG2增強(qiáng)藥物的停留。此外，它能阻止EMT，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，降低BCSCs比例,抑制腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。當(dāng)它與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可增加紫杉醇化療敏感性，降低ALDH+BCSCs比例。用載于納米金蛋白冠上的SAHA/Wnt-b Catenin拮抗劑能靶向BCSCs，抑制BCSCs數(shù)量[48]。此外，使用靶向干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的RNA納米顆粒遞送抗miRNA[49]，以及載有偶聯(lián)的DNA納米序列TA6NT-AKTin-DOX均對(duì)BCSCs治療具有靶向性[50]。因此，靶向納米技術(shù)治療可為清除BCSCs提供一種有效的藥物傳遞途徑。

值得注意的是，隨著系統(tǒng)生物學(xué)與分子生物的革命性進(jìn)展，生物信息學(xué)與“組學(xué)”在研究腫瘤特性方面的作用越來(lái)越顯著，這將對(duì)BCSCs靶向治療提供重要的思路[51-52]。富集BCSCs，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，可研究BCSCs向多分化的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程，并在人群BCSCs中篩選調(diào)控的差異基因[53]。另外，Cheng等[54]利用Hydro-Seq追蹤了21例乳腺癌患者組織中BCSCs的表達(dá)以及EMT標(biāo)記的單個(gè)細(xì)胞，可見(jiàn)，基于“組學(xué)”平臺(tái)的最新研究可識(shí)別與篩選BCSCs耐藥性和轉(zhuǎn)移相關(guān)的不同細(xì)胞群、靶點(diǎn)以及基因，開(kāi)啟了理解BCSCs的新視角，這對(duì)靶向BCSCs治療的研究尤為重要。

4 小結(jié)

乳腺癌是一種在世界范圍內(nèi)女性中具有較高發(fā)病率和死亡率的腫瘤性疾病。盡管乳腺癌治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是由BCSCs引起的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥仍然是目前治療所面臨的最大挑戰(zhàn)。因此尋求靶向BCSCs的治療策略對(duì)于乳腺癌治療顯得尤為關(guān)鍵。通過(guò)總結(jié)BCSCs在復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥中的研究，以及部分靶向BCSCs的主要策略，我們可以展望：①在大多數(shù)情況下，治療期間的活檢很難實(shí)施，因此必須開(kāi)發(fā)新的策略來(lái)檢測(cè)BCSCs標(biāo)記；②基于液體活檢中的癌癥標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，在血液/血清中鑒定BCSCs標(biāo)記對(duì)于開(kāi)發(fā)個(gè)性化BCSCs治療可能更有效，也對(duì)乳腺癌的早期診斷及治療有重要價(jià)值；③多種靶向治療策略聯(lián)合：生物信息學(xué)與“組學(xué)”基于“疾病-基因-靶標(biāo)-藥物”的相互作用，與小分子靶向藥物“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的特點(diǎn)不謀而合，這將為開(kāi)發(fā)靶向BCSCs的小分子藥物提供新視角；④將全基因組轉(zhuǎn)錄分析轉(zhuǎn)化為藥物發(fā)現(xiàn)，從而在將來(lái)獲得更好的治療效果。因此，對(duì)BCSCs更為系統(tǒng)全面的認(rèn)識(shí)，必將有助于提高乳腺癌的臨床治愈率。