李莎莎，趙博

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

泛素(Ubiquitin，Ub)是含有76個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，可以通過E1-E2-E3級聯(lián)反應(yīng)傳遞至底物蛋白，介導(dǎo)蛋白質(zhì)的泛素化[1-2]。其中，泛素活化酶E1通過水解ATP使其半胱氨酸殘基和泛素C末端形成高能硫酯鍵，接著將活化的Ub以硫酯鍵結(jié)合的方式傳遞至泛素結(jié)合酶E2上，最后在泛素連接酶E3的作用下，Ub以共價結(jié)合的方式傳遞至底物蛋白的賴氨酸上,使得底物蛋白泛素化[3-4]。在真核細胞中，泛素化(ubiquitination)是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，它可以通過26S蛋白酶體介導(dǎo)底物蛋白的降解，或者調(diào)節(jié)底物蛋白的生物學(xué)功能[3,5]。

UBE4B(簡稱E4B)是U-box家族泛素連接酶的一員，其基因位于人類染色體1p36上[6]，是酵母細胞中E4酶UFD2的哺乳動物同源物，因此E4B也具有E4的功能[7]。在人類細胞中，E3s的數(shù)量超過600個，且E3s決定了底物蛋白識別的特異性，然而600多種E3s和底物蛋白之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系使得鑒定特定E3s的底物變得尤為困難。實驗室前期開發(fā)了正交泛素傳遞(orthogonal ubiquitin transfer,OUT)的方法來探索E3s底物特異性。在OUT途徑中，突變的Ub(xUb)在HEK293細胞內(nèi)可以通過突變的E1，E2和E3(xE1，xE2，xE3)轉(zhuǎn)移至特定E3的底物上，將細胞裂解后通過Ni-NTA和鏈霉親和素樹脂串聯(lián)親和層析純化xUb偶聯(lián)的蛋白，富集的蛋白質(zhì)經(jīng)胰酶消化得到一系列的肽段，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)的方法對肽段進行檢測分析即可得到E4B的潛在底物蛋白[8]。通過該方法，我們檢測到聚合酶δ相互作用蛋白2(Polymerase δ-interacting protein 2，POLDIP2)可能是泛素連接酶E4B的潛在底物，但仍需通過其他方法進一步驗證E4B是否能夠介導(dǎo)POLDIP2的泛素化。

為了鑒定POLDIP2是否是真核細胞中E4B的底物，本研究設(shè)立了體外蛋白泛素化反應(yīng)，并在HEK293細胞、E4B敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株(shE4B)、E4B過表達細胞株(E4B OE)中檢測E4B表達量的變化是否影響POLDIP2的泛素化水平。其次，我們進一步探究E4B泛素化POLDIP2能否介導(dǎo)其通過26S蛋白酶體進行降解，以期進一步闡明泛素化降解對于POLDIP2在真核細胞中行使功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞(HEK293)購自中國科學(xué)院細胞庫；胎牛血清、DEME高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基均購自Gibco公司；Anti-UBE4B抗體(ab126759)、Anti-HA抗體(ab182009)購自abcam公司；Anti-GAPDH 抗體(60004-1-Ig)購自proteintech公司；Anti-FLAG(M2))抗體(F1804)購自美國sigma-Aldrich公司；山羊抗兔熒光二抗(111-655-144)及山羊抗鼠熒光二抗(115-005-072)購自Jackson ImmunoResearch公司；Anti-FALG(M2)affinity gel (A2220) 購自Sigma-Aldrich公司；膠回收試劑盒、小提質(zhì)粒試劑盒均購自O(shè)mega公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA ligase均購自NEB公司；感受態(tài)細胞由實驗室制作并保存；蛋白酶體抑制劑MG132(HY-13259)、蛋白酶抑制劑混合物PIC均購自MCE公司;N-ethymaleimide(NEM)購自 Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1 PCR擴增獲取目的基因

根據(jù)NCBI中POLDIP2的全長基因序列，按照引物設(shè)計原則設(shè)計上下游引物，為與載體連接，分別在上下游引物中引入BamHⅠ和NotⅠ 酶切位點，引物設(shè)計如下(表1)。以cDNA為模板，進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下：1 μL cDNA模板、上下游引物各1 μL、1 μL KOD-Plus- Neo、5 μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus- Neo、5 μL 2 mmol·L-1dNTPS、3 μL 25 mmol·L-1MgSO4、加入ddH2O補至50 μL。將各組分輕輕混合，經(jīng)預(yù)變性94 ℃ 2min，變性98 ℃ 10 s，復(fù)性(Tm-5) ℃ 30 s,引物延伸68 ℃ 30 s/kb，35個循環(huán)之后，便得到目的基因片段。該基因片段經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒進行回收。

表1 目的基因引物序列

1.2.1.2 His-pET28a、Flag-pcDNA3.1載體酶切及酶連

使用BamH Ⅰ和NotⅠ對His-pET28a、Flag-pcDNA3.1載體及上述PCR基因片段進行酶切，體系如下：1μg基因、5 μL 10×NEBuffer、1 μLBamHⅠ、1 μLNotⅠ、ddH2O補齊至50 μL，于37 ℃酶切2～3 h。酶切后的載體經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒回收，而酶切之后的目的基因片段直接使用膠回收試劑盒進行回收。分別得到載體和目的基因的酶切產(chǎn)物，接著使用T4 DNA ligase進行酶連。酶連體系如下：載體和基因片段按照摩爾比1∶7加入相應(yīng)量的體積、1 μL T4 DNA Ligase Buffer (10×)、0.5 μL T4 DNA ligase，加入ddH20補齊至10 μL，于室溫反應(yīng)1 h，即得到酶連產(chǎn)物：pET28a-Flag-POLDIP2、pcDNA-Flag-POLDIP2。取5 μL酶連產(chǎn)物經(jīng)過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法，將重組質(zhì)粒與50 μL DH5α感受態(tài)細胞混合均勻，冰上孵育30 min，42 ℃熱擊90 s，冰敷2 min，加入1 mL培養(yǎng)基混合，于37 ℃搖床復(fù)蘇1 h，接著將感受態(tài)細胞均勻涂在相應(yīng)抗性的細菌培養(yǎng)板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆細胞，提取質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒經(jīng)過DNA測序確定其是否為正確的目的基因序列。

1.2.2 蛋白表達及純化

第一天，將經(jīng)過測序的正確重組質(zhì)粒，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法，轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細胞中，涂布于含有kana抗生素的細菌培養(yǎng)板上，過夜培養(yǎng)。第二天，挑取單克隆細胞于5 mL LB中，37 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)過夜。第三天，將上述細菌培養(yǎng)液接種于1 L相應(yīng)抗性的LB中，于37 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)至細菌的OD600=0.6～0.8，接著加入1 mL 1 M IPTG至終濃度為1 mmol·L-1,于16 ℃誘導(dǎo)表達10～16 h。第四天，將上述完成蛋白表達的菌液于4 ℃，7 000 r·min-1離心10 min收集細胞，棄上清。加入10 mL Lysis Buffer (50 mmol·L-1Tris Base,500 mmol·L-1NaCl,5 mmol·L-1Imidazole,pH 8.0) 將細胞重懸，高壓破碎細胞。將細胞裂解液于4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min 收集上清，并加入500 μL提前處理好的鎳性填料，于4 ℃轉(zhuǎn)盤結(jié)合2 h。

將上述混合物加入提前處理好的重力柱中，流出的裂解液即為流穿液，需保留。依此用15 mL Lysis Buffer 洗一次，15 mL Wash Buffer (50 mmol·L-1Tris Base,500 mmol·L-1NaCl,100 mmol·L-1Imidazole,pH 8.0)洗兩次，以上洗脫液均需要保留。接著用3～5 mL Elution Buffer (50 mmol·L-1Tris Base,500 mmol·L-1NaCl,250 mmol·L-1Imidazole,pH 8.0) 洗脫蛋白。將上述得到的BL21裂解液、裂解液離心后的上清、流穿液和最終洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮藍染色，將含有目的蛋白條帶的洗脫液進行下一步操作。加入合適大小的透析袋中，于1 L 透析液(25 mmol·L-1Tris Base,150 mmol·L-1NaCl,0.5 mmol·L-1DTT,pH 8.0)4 ℃搖床透析4 h,接著更換1 L新的透析液，4 ℃搖床透析過夜。第5天，取出透析袋，在透析袋外部撒適量的PEG-20 000，濃縮蛋白溶液。接著吸出蛋白質(zhì)溶液，分裝于EP管中，取少量測濃度，其余蛋白于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

液氮凍存的HEK293細胞經(jīng)37 ℃水浴復(fù)蘇，使用含有10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細胞狀態(tài)，及時換液和傳代，一般情況3 d傳代1次。一般傳代3次之后，細胞狀態(tài)趨向穩(wěn)定，此時使用胰酶消化細胞并計數(shù)，取2.3×106個細胞鋪于6 cm 細胞培養(yǎng)皿中，使其細胞匯合度為70%～80%，第二天進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h，將細胞培養(yǎng)基換成Opti-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。用一定體積Opti-MEM稀釋質(zhì)粒，輕輕吹打混勻，標記為A液；用相應(yīng)體積的Opti-MEM稀釋轉(zhuǎn)染試劑PEI，輕輕吹打混勻，標記為B液，一般情況下，質(zhì)粒與PEI的體積之比為1∶3。A液和B液在室溫靜置5 min，然后將B液滴入A液中，輕輕吹打混勻，室溫放置20 min以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物輕輕均勻滴入細胞中，并輕輕晃動細胞培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，然后將Opti-MEM培養(yǎng)基換為DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)細胞，一般情況下，細胞轉(zhuǎn)染48 h 時用合適的細胞裂解液裂解細胞。

1.2.4 免疫共沉淀

細胞轉(zhuǎn)染48 h后用含有蛋白酶抑制劑PIC及PMSF(對于細胞內(nèi)泛素化鑒定，則需另外加入去泛素化酶抑制 NEM(100 μmol·L-1)和O-Phenanthroline(100 μmol·L-1)的RIPA細胞裂解液(50 mmol·L-1Tris,150 mmol·L-1NaCl 1% NP-40,0.1% SDS,EDTA，pH 7.4)將細胞裂解，棄細胞培養(yǎng)基，加入2 mL預(yù)冷PBS輕輕洗兩遍細胞，接著加入適量RIPA裂解液，冰上放置10 min，用細胞刮刀刮下細胞置于EP管中。將細胞裂解液置于冰上，于搖床搖晃EP管進一步裂解30 min，然后于4 ℃，13 000 r·min-1離心15 min，上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中。使用BCA試劑盒測蛋白濃度，取1 mg 總蛋白用于免疫共沉淀。免疫共沉淀分為3個步驟：(1)beads預(yù)處理:每個樣品取15 μL Anti-Flag (M2) affinity gel 的50% 混懸液，7 000 g離心1 min，棄上清。加入1 mL預(yù)冷的TBS，輕輕搖晃EP管，于4 ℃，7 000 g,離心1 min，接著重復(fù)清洗兩次；(2)孵育：取1 mg 總蛋白于EP管中，加入將上述清洗過的Anti-Flag (M2) affinity gel，于4 ℃ 轉(zhuǎn)盤結(jié)合4 h；(3)清洗beads:取出EP管，于4 ℃，7 000 g，離心1 min,將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，-40 ℃保存。Beads 中加入1 mL 預(yù)冷的TBS-T，輕輕搖晃EP管，于4 ℃，7 000 g,離心1 min，接著重復(fù)清洗四次。最后一次棄全部上清，加入30 μL TBS,9 μL 5×SDS 上樣緩沖液，Vortex 10 s,然后7 000 g，離心1 min。樣品經(jīng)99 ℃煮樣15 min，7 000 g，離心1 min，取適量上清進行western blot，剩余上清于-40 ℃保存。

1.2.5 POLDIP2與E4B相互作用

為檢測POLDIP2與E4B在HEK293細胞中是否存在相互作用，將HEK293細胞鋪至6 cm皿，共轉(zhuǎn)染2 μg pcDNA-Flag-POLDIP2質(zhì)粒與2 μg pLVX-E4B質(zhì)粒，只轉(zhuǎn)染2 μg pLVX-E4B質(zhì)粒的細胞為陰性對照。轉(zhuǎn)染后48 h使用RIPA將細胞裂解，分別取1 mg總蛋白進行免疫共沉淀，使用anti-Flag (M2) affinity gel 拉下Flag-POLDIP2,在western blot 中使用anti-E4B抗體檢測E4B是否與POLDIP2存在相互作用。

1.2.6 胞外泛素化反應(yīng)

為驗證POLDIP2是泛素連接酶E4B的的底物，設(shè)置了體外泛素化反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：10 μmol·L-1Flag-POLDIP2、14 μmol·L-1Ub、1 μmol·L-1E1(Uba1),5 μmol·L-1E2(UbcH5b),1 μmol·L-1E3(E4B)、50 mmol·L-1MgCl2和1.5 mmol·L-1ATP，加入TBS補齊至50 μL，于室溫反應(yīng)2 h，加入12.5 μL 5×SDS上樣緩沖液，99 ℃煮樣10 min。同時設(shè)置五組陰性對照：分別不含E1、E2、E3、Ub和底物蛋白。反應(yīng)產(chǎn)物進行western blot，使用anti-Flag抗體對POLDIP2的泛素化進行檢測。

1.2.7 胞內(nèi)泛素化鑒定

為在HEK293細胞內(nèi)鑒定POLDIP2是否為E4B的底物，E4B敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株(shE4B)、HEK293、E4B過表達(E4B OE)3種細胞株分別瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA-Flag-POLDIP2質(zhì)粒及pcDNA-HA-Ub質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48 h裂解細胞，收樣前4 h 用終濃度為10 μM 的MG132處理細胞。取1 mg 總蛋白進行免疫共沉淀，使用anti-Flag (M2) affinity gel 拉下Flag-POLDIP2，在western blot 中使用anti-Ub抗體對POLDIP2的泛素化進行檢測。

1.2.8 E4B介導(dǎo)POLDIP2的泛素化降解

為檢測HEK293細胞內(nèi)E4B對于POLDIP2蛋白穩(wěn)定性的影響，在HEK293細胞中瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA-Flag-POLDIP2質(zhì)粒，同時轉(zhuǎn)染依次增量的pLVX-E4B質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h收樣。另一方面，也可以利用CHX Chase 實驗檢測E4B對于POLDIP2的降解作用。將1×106個HEK293細胞鋪板于六孔板，分別共轉(zhuǎn)染1.5 μg pcDNA-Flag-POLDIP2質(zhì)粒和1 μg pLVX-E4B質(zhì)粒或1.5 μg pcDNA-Flag-POLDIP2質(zhì)粒和1 μg pLVX空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48 h收樣。每組設(shè)立五個對照，分別在收樣前0、2、4、6、8 h加入CHX (終濃度50 μg·mL-1)。在western blot 中使用anti-E4B及anti-Flag抗體檢測細胞裂解液中E4B及POLDIP2的水平，以鑒定E4B能否影響POLDIP2蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 POLDIP2目的基因獲取及重組質(zhì)粒構(gòu)建

以人胚腎細胞HEK293提取的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。接下來，以該cDNA為模板，通過PCR獲取POLDIP2目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，發(fā)現(xiàn)目的基因條帶大小正確(圖1A)。目的基因和pET28a載體及pcDNA載體分別經(jīng)BamHⅠ 和NotⅠ 雙酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定(圖1B、1C)，通過T4連接酶進行酶連，得到的重組質(zhì)粒經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離驗證，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒大小明顯大于空載,且測序結(jié)果顯示構(gòu)建成功。

A：以cDNA為模板，通過PCR獲取POLDIP2基因；B：泳道3為正常His-Flag-pET28a載體，泳道4為雙酶切后的pET28a載體; C：泳道5為正常Flag-pcDNA，泳道6為雙酶切后的pcDNA載體。圖1 POLDIP2 基因獲取及重組質(zhì)粒構(gòu)建

2.2 POLDIP2蛋白表達純化及體外泛素化驗證

為了驗證POLDIP2是否為泛素連接酶E4B的底物，首先設(shè)置了體外蛋白質(zhì)泛素傳遞反應(yīng)，即在體外分別表達POLDIP2、E1(Uba1)、E2(UbcH5b)、E3(E4B)、Ub蛋白，在ATP提供能量的情況下，觀察Ub能否通過E1、E2、E3最終傳遞至POLDIP2上，從而初步判斷POLDIP2是否為E4B底物。我們將BL21裂解液、BL21離心后的上清、鎳柱吸附后的流穿液以及Elution Buffer的洗脫液經(jīng)過SDS-PAGE跑膠分離，發(fā)現(xiàn)可以得到分子量為42KDa的較為純凈的POLDIP2蛋白(圖2A)。實驗室前期已有E1、E2、E3、Ub蛋白，因此設(shè)置體外泛素化反應(yīng)體系，反應(yīng)一共分為六組，第一組為完整的反應(yīng)體系，其余組分依次缺少E1、E2、E3、Ub、POLDIP2，這樣做的目的是為了形成陰性對照，避免出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。由于表達的POLDIP2蛋白帶有Flag標簽，因此在western blot中，我們使用anti-Flag抗體來檢測POLDIP2的泛素化。結(jié)果表明，相對于其他陰性對照組，第一組的POLDIP2的泛素化smear條帶是最強的(圖2B，泳道1)，而沒有POLDIP2存在時，沒有任何條帶(圖2B)，這就說明Ub能夠通過E1、E2、E3將Ub傳遞至POLDIP2上，初步說明POLDIP2是E4B的底物。

A：泳道1為BL21細胞裂解液；泳道2為BL21細胞裂解液離心之后的上清，保留上清液的目的是為了判斷POLDIP2是否為可可溶性蛋白； 泳道3為沒有和鎳柱結(jié)合的蛋白質(zhì)溶液；泳道4為含100 mmol·L-1咪唑的Elution Buffer作用鎳柱之后的洗脫液； B：體外蛋白質(zhì)泛素化傳遞的結(jié)果，泳道1為完整的泛素傳遞體系，泳道2、3、4、5、6分別缺失E1、E2、E3、Ub、POLDIP2蛋白。圖2 POLDIP2蛋白表達純化及體外泛素化驗證

2.3 POLDIP2與E4B在HEK293細胞內(nèi)相互作用及胞內(nèi)泛素化驗證

由于原核表達系統(tǒng)所誘導(dǎo)表達的蛋白質(zhì)可能缺乏合適的翻譯后修飾，使得上述體外泛素化反應(yīng)結(jié)果并不能充分說明E4B能夠泛素化POLDIP2，因此，我們進一步在人的胚腎細胞HEK293中驗證POLDIP2是否為E4B的底物。我們首先在HEK293細胞中證明E4B能否和POLDIP2相互作用，在HEK293細胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA-Flag-POLDIP2和pLVX-E4B質(zhì)粒，利用免疫共沉淀拉下POLDIP2蛋白，在western blot 中能夠檢測到E4B蛋白泳道2(圖3A)。在陰性對照組中，只轉(zhuǎn)染pLVX-E4B質(zhì)粒，沒有轉(zhuǎn)染pcDNA-Flag-POLDIP2，目的是為了檢測免疫共沉淀中beads的非特異性結(jié)合，結(jié)果顯示該beads的非特異性結(jié)合非常弱泳道1(圖3A)，說明實驗結(jié)果可信度高。

為進一步在HEK293細胞中驗證E4B能夠?qū)OLDIP2泛素化，實驗室前期利用shRNA敲減E4B并獲得E4B敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株(shE4B),和HEK293細胞相比，shE4B細胞的裂解液中E4B水平明顯下降(圖3B)，同時在HEK293細胞瞬時轉(zhuǎn)染pLVX-E4B質(zhì)粒(E4B OE)，其細胞裂解液中E4B水平明顯升高(圖3B)。在shE4B、HEK293、E4B OE三組細胞中，分別瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA-Flag-POLDIP2和pcDNA-HA-Ub質(zhì)粒，并利用免疫共沉淀拉下POLDIP2蛋白，以檢測與其結(jié)合的Ub的量。在shE4B細胞中，POLDIP2泛素化的smear條帶明顯比HEK293細胞弱，說明E4B的敲減減弱了POLDIP2的泛素化(圖3C，泳道1)；同樣，在E4B OE細胞中，POLDIP2的泛素化smear條帶液明顯比HEK293細胞強(圖3C，泳道3)，說明E4B的過表達增強了POLDIP2的泛素化。以上結(jié)果表明，在HEK293細胞中，E4B能夠和POLDIP2相互作用，并且能夠介導(dǎo)POLDIP2的泛素化，進一步證明POLDIP2是E4B的底物。

A：E4B+POLDIP2共轉(zhuǎn)染細胞和只轉(zhuǎn)染E4B細胞的裂解液中E4B，F(xiàn)lag-POLDIP2,GAPDH表達情況，及細胞裂解液經(jīng)anti-Flag (M2) affinity gel捕獲后孵育anti-E4B抗體檢測E4B和POLDIP2的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；B：shE4B、HEK293、E4B過表達三種細胞 共轉(zhuǎn)染HA-UB、Flag-POLDIP2時，細胞裂解液中各個蛋白質(zhì)的表達情況；C：在(B)中的細胞裂解液經(jīng)anti-Flag (M2) affinity gel捕獲后孵育anti-HA抗體檢測POLDIP2的泛素化修飾水平。圖3 POLDIP2與E4B相互作用及細胞內(nèi)泛素化檢測

2.4 E4B介導(dǎo)POLDIP2的泛素化降解

細胞外泛素傳遞反應(yīng)和細胞內(nèi)泛素化驗證均能夠證實POLDIP2是泛素連接酶E4B的底物。雖然泛素化主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)經(jīng)由26S蛋白酶體降解，但也可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，參與細胞內(nèi)其他生命活動。因此，我們進一步檢測E4B泛素化POLDIP2之后能否介導(dǎo)其通過26S蛋白酶體降解。首先，在HEK293細胞中不斷增加pLVX-E4B的轉(zhuǎn)染量，pcDNA-Flag-POLDIP2的轉(zhuǎn)染量保持不變，可以觀察到隨著E4B表達量不斷升高，POLDIP2的水平不斷下降(圖4A)。說明E4B對POLDIP2的泛素化可能影響其降解過程，隨著E4B表達量增加，對POLDIP2的泛素化不斷加強，使得POLDIP2的水平下降。除此之外，CHX Chase assay是一種經(jīng)典的測定細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解速率的方法，通過放線菌酮(CHX)抑制細胞中新的蛋白質(zhì)合成，我們可以探究細胞內(nèi)已表達蛋白質(zhì)的降解情況。通過比較HEK293細胞、E4B敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株(shE4B)、E4B過表達細胞株(E4B OE)中POLDIP2蛋白降解速率的快慢，我們就可以判斷E4B是否能夠促進POLDIP2的降解過程。如圖，HEK293細胞中的POLDIP2隨著CHX作用時間延長，水平有所降低(圖4B,左圖)，但在E4B過表達細胞中，POLDIP2隨著CHX作用時間的延長，其水平下降的幅度更大(圖4B,右圖)，表明E4B過表達破壞了POLDIP2蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，加速POLDIP2的降解。綜上所述，E4B可以介導(dǎo)POLDIP2的泛素化并促進其經(jīng)由蛋白酶體降解，從而調(diào)節(jié)POLDIP2蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

A：不同E4B轉(zhuǎn)染量情況下，POLDIP2的水平變化；B：CHX Chase實驗， 左圖是HEK293細胞中POLDIP2的水平變化，右圖是E4B過表達細胞中POLDIP2的水平變化。圖4 E4B介導(dǎo)POLDIP2的泛素化降解

3 討論

POLDIP2是由368個氨基酸殘基組成的多功能蛋白質(zhì)[9]，在結(jié)構(gòu)上，POLDIP2由N末端線粒體定位序列及兩個高度保守的結(jié)構(gòu)域組成：ApaG/F box A結(jié)構(gòu)域和半甲基化DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域YccV[10];在定位上，其在細胞內(nèi)的定位因細胞類型不同也有所差異[11]，但主要分布于線粒體中[12]。LIU Li等[9]在2003年首次發(fā)現(xiàn)POLDIP2蛋白，并闡明其與DNA聚合酶以及增殖細胞核抗原(PCNA)的相互作用，此后越來越多的研究證明，POLDIP2是一個多功能蛋白質(zhì)，在生物體內(nèi)承擔十分重要的生物學(xué)功能，對細胞生命活動的正常發(fā)揮至關(guān)重要。例如，POLDIP2的YccV結(jié)構(gòu)域可以和DNA聚合酶結(jié)合，參與調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制、修復(fù)和損傷耐受；此外，POLDIP2也可以調(diào)控細胞周期[10]、參與前體mRNA的加工[13]、調(diào)節(jié)細胞核氧化微環(huán)境[14]、參與調(diào)控線粒體形態(tài)和功能[12]等。同時POLDIP2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、心血管疾病、腫瘤等多種生理和病理生理學(xué)中起到調(diào)節(jié)作用[11]。在哺乳動物中，POLDIP2蛋白的功能無法被其他蛋白質(zhì)所補償，因此POLDIP2基因的敲除對于胚胎是致命的[10,15]。但是，POLDIP2在上述生命活動中發(fā)揮作用的機制還沒有完全闡明，而泛素化作為真核細胞中一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，能夠?qū)е碌孜锏鞍捉?jīng)由26S蛋白酶體降解或者調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。因此，研究POLDIP2的泛素化，繼而探究泛素化是否和POLDIP2在上述生理活動中發(fā)揮的功能相關(guān)，或許是探究其作用機制的一種方法。目前，關(guān)于POLDIP2的泛素化E3還沒有任何報道，因此鑒定POLDIP2是否為E4B的底物具有非常重要的意義。

泛素連接酶E4B作為一種新型E3，同時也可以發(fā)揮E4的功能，從而介導(dǎo)底物蛋白質(zhì)的降解[16]。目前已有許多關(guān)于E4B底物功能的研究，已確認E4B可以參與EGFR[17]、p53[18]等重要蛋白的泛素化降解。此外，E4B可以通過調(diào)節(jié)底物蛋白的泛素化參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，例如鼻咽癌[7]、肝細胞癌[19]、乳腺癌[20]和早幼粒細胞白血病[21]等?？梢姡骄縀4B在真核細胞中的泛素化底物及探究其底物功能具有十分重要的意義。我們前期在正交泛素轉(zhuǎn)移途徑(OUT)中，通過質(zhì)譜鑒定的方法發(fā)現(xiàn)POLDIP2可能是E4B的底物蛋白。在本研究中，我們通過在BL21中純化POLDIP2蛋白，設(shè)置胞外泛素化反應(yīng)，通過western blot鑒定出POLDIP2的泛素化smear條帶，說明Ub可以通過E1-E2-E3級聯(lián)反應(yīng)傳遞至POLDIP2蛋白上。其次，我們通過鑒定HEK293細胞、E4B敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株(shE4B)、E4B過表達細胞株(E4B OE)中POLDIP2泛素化水平的強弱，證明了E4B蛋白水平和POLDIP2的泛素化水平呈正相關(guān)，再次證明POLDIP2是E4B的底物。再者，我們通過CHX Chase實驗證明E4B可以加速POLDIP2的降解，并且隨著E4B在細胞中轉(zhuǎn)染量的增加，POLDIP2的蛋白水平不斷降低，說明E4B可以介導(dǎo)POLDIP2的降解。

總的來說，本研究首次證明了泛素連接酶E4B能夠?qū)OLDIP2泛素化并介導(dǎo)其經(jīng)由蛋白酶體降解。后續(xù)，我們將以POLDIP2的泛素化為基礎(chǔ)，進一步在相應(yīng)細胞模型和疾病模型中探究泛素化對于POLDIP2發(fā)揮功能的影響，并解釋POLDIP2在某種生理活動中起作用的分子機制。