馬 龍，高 偉，欒好安，唐繼偉*，李明悅，黃紹文*

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081；2 天津市農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所, 天津 300192；3 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 河北保定 071000）

目前，我國(guó)蔬菜體系分為設(shè)施蔬菜和露地蔬菜兩類，設(shè)施蔬菜因其產(chǎn)值高、集約化程度高、不受季節(jié)因素干擾而得到迅速發(fā)展。然而，設(shè)施蔬菜生產(chǎn)過(guò)程中普遍存在肥料過(guò)量、施肥模式不合理等導(dǎo)致土壤速效養(yǎng)分(氮、磷等)大量富集、有機(jī)質(zhì)含量下降、地下水硝酸鹽含量嚴(yán)重超標(biāo)等問(wèn)題[1–2]。有報(bào)道稱有機(jī)肥與無(wú)機(jī)肥配施能減輕硝酸鹽污染，且施用高碳氮比有機(jī)物料可加快土壤硝態(tài)氮同化，進(jìn)而將硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為微生物量氮儲(chǔ)存，減少氮損失[3]。針對(duì)上述問(wèn)題，在合理施肥的基礎(chǔ)上使用有機(jī)肥/秸稈替代化肥可使設(shè)施蔬菜化肥減施潛力達(dá)35%以上[4]。

土壤氮循環(huán)包括硝化、反硝化、氮素固定、厭氧氨氧化和硝酸鹽還原過(guò)程。硝化與反硝化過(guò)程是氮素轉(zhuǎn)化的主要過(guò)程[5]。硝化過(guò)程指土壤有機(jī)氮礦化或來(lái)自肥料的銨態(tài)氮在好氧微生物作用下轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮的過(guò)程，反硝化過(guò)程則是利用土壤中的硝態(tài)氮經(jīng)多種酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮的過(guò)程[6]。微生物是驅(qū)動(dòng)土壤氮循環(huán)的重要載體和介質(zhì)，不同氮素循環(huán)過(guò)程均有起主導(dǎo)作用的功能基因，如在N2固定過(guò)程中的NifH、硝化過(guò)程的AmoAB及反硝化過(guò)程的NarG、NapA、NirKS及NosZ，硝酸鹽異化還原過(guò)程的NirBD及NrfAH[7–10]。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，除氣溫、降水外，施肥對(duì)土壤氮循環(huán)過(guò)程影響較大[11–12]，不同施肥方式對(duì)功能性微生物結(jié)構(gòu)和豐度的影響不同，尤其化肥配施有機(jī)肥模式的影響更大[9,13–14]。然而，必須意識(shí)到土壤氮循環(huán)各過(guò)程均是相互關(guān)聯(lián)的，僅研究單一氮循環(huán)功能微生物可能無(wú)法綜合評(píng)估施肥模式對(duì)其影響。近年來(lái)，隨著宏基因組測(cè)序的發(fā)展，可以在一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中同步進(jìn)行多個(gè)氮循環(huán)功能基因研究，即在深度測(cè)序的基礎(chǔ)上通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選出氮循環(huán)過(guò)程功能基因及其豐度，全面綜合評(píng)估由施肥模式引起的氮循環(huán)功能基因豐度差異。設(shè)施菜田由于封閉性、可控性、缺少降雨淋洗等特點(diǎn)，施肥對(duì)土壤氮循環(huán)過(guò)程影響較大[11–12]。盛果期作為果菜生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)土壤養(yǎng)分的需求量較高，土壤微生物代謝活動(dòng)劇烈[15–16]。因此，利用天津市西青區(qū)基地日光溫室蔬菜有機(jī)肥/秸稈替代化肥定位試驗(yàn)，采用宏基因組測(cè)序方法，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)KO00910氮循環(huán)通路(https://www.kegg.jp/pathway/map00910)，研究分析了番茄盛果期不同施肥模式下土壤氮循環(huán)功能基因的主要種類和豐度，旨在分析硝化潛勢(shì)(PNR)、N2O排放及相應(yīng)的功能基因的相互關(guān)系，為設(shè)施菜田制定合理高效的施肥方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

本定位試驗(yàn)位于天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所西青區(qū)辛口鎮(zhèn)第六埠村 (117°0′E，39°13′N)，試驗(yàn)區(qū)屬于暖溫帶半濕潤(rùn)大陸性氣候，全年平均溫度11.6℃，自然降水量586 mm，無(wú)霜期203天，日照總量2810 h。供試日光溫室東西走向，長(zhǎng) 80 m，寬 6.5 m (含 0.5 m 通道)，溫室前部有通風(fēng)口，白天適時(shí)敞開(kāi)通風(fēng)，夜間或降雨時(shí)關(guān)閉。供試土壤類型為中壤質(zhì)潮土。定位試驗(yàn)起始時(shí)間為2009年10月(定位試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)棚齡為7年)，種植制度為春茬番茄–秋冬茬芹菜輪作。定位試驗(yàn)開(kāi)始前0—20 cm 土層基本理化性質(zhì)為：pH 7.9、有機(jī)質(zhì) 25.4 g/kg、硝態(tài)氮 186.2 mg/kg、速效磷 144.6 mg/kg、速效鉀404.0 mg/kg。供試芹菜 (Apium graveolens)品種為‘文圖拉’，番茄(Lycopersicon esculentum)品種為‘朝研299’。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取定位試驗(yàn)來(lái)源于化肥(CF)、有機(jī)肥(M)和玉米秸稈(S)養(yǎng)分比例不同的等氮磷鉀投入量的6個(gè)處理，分別為：4/4CF、3/4CF+1/4M、2/4CF+2/4M、1/4CF+3/4M、2/4CF+1/4M+1/4S、2/4CF+2/4S。番茄茬施用的N、P2O5和K2O總量分別為450、225和600 kg/hm2，芹菜茬施用的N、P2O5和K2O總量分別為450、300和600 kg/hm2。春茬番茄和秋冬茬芹菜各處理的具體氮和碳投入量見(jiàn)表1。試驗(yàn)為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理 3 次重復(fù)，小區(qū)面積 14.4 m2(寬 2.4 m×長(zhǎng)6.0 m)。番茄株、行距分別為0.3和0.6 m，種植密度為25000株/hm2；芹菜株、行距分別為0.20和0.15 m，種植密度為330570株/hm2。為防止小區(qū)間養(yǎng)分和水分的橫向遷移，小區(qū)間埋設(shè)厚度為4 mm PVC 板 (高度 105 cm，其中 100 cm 埋于地下，5 cm露出地面)。

表1 春茬番茄和秋冬茬芹菜各施肥處理中氮、碳投入量(kg/hm2)Table 1 Nitrogen and carbon inputs in each fertilization treatment during spring tomato season and autumn-winter celery season

有機(jī)肥全部基施，化肥除部分基施外，其余部分作追肥施用。番茄季1～6處理所用化肥中20%氮肥、70%磷肥和20%鉀肥基施，剩余氮肥和鉀肥分4次追施(分別在番茄開(kāi)花期、第一穗果膨大期、第二穗果膨大期和第三穗果膨大期)，氮肥追施比例分別為30%、30%、10%和10%，鉀肥追施比例分別為10%、30%、30%和10%，剩余磷肥在第一次和第二次追肥各施入15%。芹菜季1～6處理所用化肥中20%氮肥、70%磷肥和20%鉀肥基施，剩余氮肥和鉀肥在芹菜5～6葉期、8～9葉期和11～12葉期分3次追施，氮肥追施比例分別為35%、35%和10%，鉀肥追施比例分別為10%、35%和35%，剩余磷肥在第一次追肥時(shí)全部施入。

定位試驗(yàn)所施用的化肥為尿素(N 46%)、過(guò)磷酸鈣 (P2O512%)、磷酸二銨 (N 18%、P2O546%)、氯化鉀 (K2O 60%)和磷酸二氫鉀 (P2O552%、K2O 34%)。所用有機(jī)肥(商品豬糞) N、P2O5、K2O和C含量分別為 21.7、13.9、16.3 和 218.0 g/kg (干基)，水分含量為28.9%；所用玉米秸稈N、P2O5、K2O和C含量分別為 10.4、3.2、16.9 和 426.9 g/kg (干基)，水分含量為64.9%。

基施方式為肥料撒施后旋耕入地，追肥方式為肥料溶于水后隨水沖施。各處理均是依據(jù)田間持水量進(jìn)行灌溉，當(dāng)田間持水量低于60%時(shí)進(jìn)行灌溉。為保證灌水量的準(zhǔn)確，每個(gè)小區(qū)均安裝有單獨(dú)的PVC進(jìn)水管，并用水表記錄灌水量。番茄季和芹菜季灌水總量分別為3889和3334 m3/hm2。

1.3 土壤樣品采集及測(cè)定方法

1.3.1 土壤樣品采集 2019年5月23日于定位試驗(yàn)第20茬設(shè)施蔬菜(春茬番茄盛果期，番茄定植后80天)采集土壤樣品。土壤樣品的取樣方法是在每個(gè)小區(qū)內(nèi)按“S”形布設(shè)10個(gè)點(diǎn)，采取0—20 cm土壤樣品，剔除石礫、植物殘根等雜物，混勻裝袋，過(guò)2 mm篩備用。用四分法取10 g左右的鮮土送去測(cè)序公司，進(jìn)行土壤功能微生物(宏基因組)分析測(cè)定；取一部分樣品放入4℃冰箱內(nèi)保存，用于土壤硝化潛勢(shì)及土壤氣體的測(cè)定；剩余土壤樣品風(fēng)干后，過(guò)1 mm篩和0.15 mm篩用于測(cè)定土壤基礎(chǔ)理化指標(biāo)。

1.3.2 土壤微生物宏基因組測(cè)定 使用美國(guó)Omega Bio-Tek 公司的 E.Z.N.A.?Soil DNA Kit (Omega Biotek, Norcross, GA, U.S.)試劑盒提取土壤中微生物總DNA。完成基因組DNA提取后，利用TBS-380檢測(cè)DNA濃度，采用NanoDrop200檢測(cè)DNA純度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。通過(guò)Covaris M220將 DNA 片段化，篩選約 300 bp的片段，利用 TruSeq? DNA Sample Prep Kit試劑盒構(gòu)建PE 文庫(kù)；采用 HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit試劑進(jìn)行橋式PCR分析；使用HiSeq 3000/4000 SBS Kits試劑進(jìn)行l(wèi)luminaHiseq測(cè)序。

使用MetaGene軟件對(duì)拼接結(jié)果中的contigs進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)。選擇核酸長(zhǎng)度大于等于100 bp的基因，并將其翻譯為氨基酸序列；應(yīng)用CD-HIT軟件對(duì)所有樣品預(yù)測(cè)出來(lái)的基因序列進(jìn)行聚類，每類取最長(zhǎng)的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集；使用SOAPaligner軟件，分別將每個(gè)樣品的高質(zhì)量reads與非冗余基因集進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)基因在對(duì)應(yīng)樣品中的豐度信息。使用BLASTP將非冗余基因集序列與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(GENES)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)對(duì)比結(jié)果使用 KOBAS (KEGG Orthology Based Annotation System)進(jìn)行功能注釋，根據(jù)KO、 Pathway、EC、Module對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算對(duì)應(yīng)功能類別的豐度[17]。

1.3.3 土壤硝化潛勢(shì)測(cè)定 采用勻漿法測(cè)定土壤硝化潛勢(shì) ( potential nitrification rate, PNR)。具體方法如下：將 15 g 新鮮土壤與 100 mL 緩存液 (含 1.0 mmol/L NH4+和 1mmol/L PO3?，pH = 7.2)充分混合，在 25℃下于搖床中以200 r/min轉(zhuǎn)速連續(xù)避光震蕩24 h。分別在第 2、4、12、22、24 h 吸取 10 mL 懸漿液，在8000g轉(zhuǎn)速離心8 min，吸取上清液測(cè)定其NO3?-N含量。根據(jù)NO3?-N濃度和時(shí)間的線性回歸斜率計(jì)算PNR [NO3?-N μg/(g?h), 干土]。

1.3.4 土壤N2O氣體樣品采集測(cè)定 取50 g新鮮土樣(過(guò)2 mm篩)于250 mL玻璃瓶(橡膠塞密封)內(nèi)，在生物培養(yǎng)箱內(nèi)25℃下避光培養(yǎng)28 天，每周定期補(bǔ)水(去離子水，保持初始土壤含水量)。分別在第1、3、7、14、28 天采集玻璃瓶?jī)?nèi)氣體。采集方法為在玻璃瓶被封閉后0和4 h收集氣體，用注射器從玻璃瓶中提取氣體樣本(22 mL)，然后轉(zhuǎn)移到真空的血清瓶(10 mL)。N2O的含量由Agilent-7890a氣相色譜儀測(cè)定。

N2O排放量計(jì)算方法[18]為：

式中，C0與 C4為 0、4 h 的瓶?jī)?nèi) N2O 濃度 (μL/L)；44為N2O在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的密度(kg/m3)；273.15為氣態(tài)方程常數(shù)；T為生物培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度(25℃)；22.4為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下N2O的摩爾體積；W為玻璃瓶?jī)?nèi)土壤質(zhì)量 (0.05 kg)。

1.3.5 土壤基礎(chǔ)理化指標(biāo)測(cè)定 土壤硝態(tài)氮采用2 mol/L氯化鉀溶液浸提，紫外分光光度法測(cè)定；銨態(tài)氮采用2 mol/L氯化鉀浸提，靛酚藍(lán)比色法測(cè)定；全氮采用凱氏法消煮半微量滴定法測(cè)定；土壤有機(jī)碳采用重鉻酸鉀–濃硫酸氧化(外加熱法)測(cè)定；土壤pH采用2.5∶1水土比，酸度計(jì)測(cè)定；土壤水溶性鹽總量 (電導(dǎo)率，electrical conductivity, EC)測(cè)定采用水土比5∶1土壤懸液電導(dǎo)法測(cè)定[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 16.0 (SPSS Inc. Chicago，IL)進(jìn)行單因素 ANOVA方差分析、多重比較(Duncan)，制圖通過(guò)Origin 9.0(OriginLab Corporation, Northampton, MA)完成；運(yùn)用R語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)軟件(RStudio)進(jìn)行土壤功能微生物Circlize圖及三角關(guān)系(Spearman)圖制作，使用CANOCO 5 軟件 (CANOCO, Microcomputer Power Inc., Ithaca, NY, USA)進(jìn)行土壤功能微生物的冗余分析 (redundancy analysis, RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式對(duì)設(shè)施春茬番茄盛果期土壤硝化潛勢(shì)的影響

由表2可以看出，設(shè)施蔬菜有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式土壤硝化潛勢(shì)(PNR)均高于單施化肥模式，其中配施有機(jī)肥模式土壤PNR較高。有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式(3/4CF+1/4M、2/4CF+2/4M、1/4CF+3/4M、2/4CF+1/4M+1/4S、2/4CF+2/4S)土壤PNR在NO3–-N 0.80～2.09 μg/(g?h), DW，平均為NO3–-N 1.16 μg /(g?h), DW，較單施化肥模式(4/4CF)平均增加72.9%，其中配施有機(jī)肥模式較單施化肥模式平均增加107.0%。

表2 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤硝化潛勢(shì)Table 2 Soil potential nitrification rate (PNR) at the fullfruit stage of spring tomato in the greenhouse under partial substitution of chemical fertilizer with organic amendments

隨有機(jī)肥用量的增加，土壤PNR呈增加的趨勢(shì)。配施高量有機(jī)肥模式(1/4CF+3/4M)土壤PNR顯著高于配施中量、低量有機(jī)肥模式(2/4CF+2/4M、3/4CF+1/4M)，增幅為84.3%～116.9%，平均增加100.6%。

配施秸稈模式(2/4CF+1/4M+1/4S、2/4CF+2/4S)土壤PNR均低于配施有機(jī)肥模式(3/4CF+1/4M、2/4CF+2/4M、1/4CF+3/4M)，降幅為12.5%～61.7%，平均降低34.4%。

2.2 有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施處理對(duì)土壤氮循環(huán)功能微生物的影響

由圖1可知，不同施肥處理對(duì)土壤氮循環(huán)過(guò)程主要微生物菌屬相對(duì)豐度影響不同。有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式土壤氨氧化古菌屬Nitrososphaera和Nitrosopumilus相對(duì)豐度均低于4/4CF處理，降幅分別為14.3%～33.5%和0.7%～15.7%；氨氧化細(xì)菌屬Nitrosospira和Nitrosococcus相對(duì)豐度均高于4/4CF處理，增幅分別為31.2%～82.9%和17.1%～53.6%；氨氧化細(xì)菌屬Nitrosomonas相對(duì)豐度低于4/4CF處理，降幅為24.9%～54.3%；亞硝酸鹽氧化細(xì)菌屬Nitrobacter、Nitrospina、Nitrospirillum和Nitrospira相對(duì)豐度均高于4/4CF處理，增幅分別為21.6%～85.1%、5.6%～22.8%、41.5%～109.2%和8.9%～13.4%；厭氧氨氧化細(xì)菌屬Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia相對(duì)豐度均高于4/4CF處理，增幅分別為5.6%～27.5%和7.6%～27.9%。

圖1 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤氮循環(huán)功能微生物類群差異(屬水平)Fig. 1 Fertilization affects the relative abundance of functional microbial community related to soil N cycling at the full-fruit stage of spring tomato in the greenhouse (genus level)

2.3 施肥模式對(duì)土壤氮循環(huán)功能基因的影響

2.3.1 硝化過(guò)程功能基因 由圖2可以看出，與4/4CF處理相比，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式降低硝化過(guò)程AmoA、AmoB、AmoC和Hao豐度，降幅分別為8.2%～56.8%、19.0%～70.0%、20.0%～43.3%和51.3%～73.7%，平均分別降低37.9%、46.3%、33.8%、65.5%。其中高碳有機(jī)替代模式1/4CF+3/4M、2/4CF+1/4M+1/4S、2/4CF+2/4S處理的降幅顯著，AmoA、AmoB、AmoC和Hao豐度平均分別降低了53.3%、56.9%、42.5%和71.1%。

圖2 不同施肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤硝化過(guò)程功能基因豐度Fig. 2 The abundance of soil nitrification genes as affected by fertilization treatments at the full-fruit stage of spring tomato in the greenhouse

隨有機(jī)肥施用比例的增加，土壤硝化過(guò)程AmoA、AmoB、AmoC和Hao豐度呈減少的趨勢(shì)。與2/4CF+2/4M、3/4CF+1/4M處理相比，1/4CF+3/4M處理AmoA、AmoB、AmoC和Hao豐度降幅分別為9.2%～35.1%、3.4%～30.7%、26.8%～27.7%和20.2%～39.6%。

配施秸稈模式土壤硝化過(guò)程AmoA、AmoB和Hao豐度均低于配施有機(jī)肥模式，降幅分別為15.6%～53.0%、23.2%～93.4%和10.4%～45.9%。

2.3.2 土壤反硝化過(guò)程功能基因 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式對(duì)土壤反硝化過(guò)程各功能基因豐度的影響不一致(圖3)。與4/4CF處理相比，1/4CF+3/4M及2/4CF+2/4S處理的土壤NarGHI豐度增幅為6.0%～9.2%，平均增加7.6%。高碳有機(jī)替代模式(1/4CF+3/4M、2/4CF+1/4M+1/4S、2/4CF+2/4S)NarGHI豐度高于低碳有機(jī)替代模式(3/4CF+1/4M、2/4CF+2/4M)，增幅為4.8%～18.5%。

圖3 不同施肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤反硝化過(guò)程功能基因豐度Fig. 3 The abundance of soil denitrification genes as affected by fertilization modes at the full-fruit stage of spring tomato in the greenhouse

與4/4CF處理相比，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式NapAB、NirS、NorB和NosZ豐度增幅分別為13.2%～36.3%、6.9%～35.1%、6.4%～46.2%和0.8%～5.5%，平均分別增加19.9%、20.4%、19.1%和2.3%。

不同有機(jī)肥比例下土壤反硝化過(guò)程N(yùn)apAB、NirK和NorB豐度增幅不同。1/4CF+3/4M處理NapAB、NirK和NorB豐度較2/4CF+2/4M、3/4CF+1/4M處理的增幅分別為12.2%～19.6%、12.7%～14.4%和32.2%～37.4%，平均分別增加15.9%、13.5%和34.8%。

配施秸稈模式土壤反硝化過(guò)程N(yùn)osZ豐度均高于僅配施有機(jī)肥模式，增幅為2.0%～4.6%，平均增加3.3%。

2.3.3 硝酸鹽異化還原成銨過(guò)程功能基因 從圖4可以看出，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式增加土壤硝酸鹽異化還原成銨過(guò)程N(yùn)irB豐度，降低NrfH豐度。與4/4CF處理相比，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式NirB豐度增幅為12.0%～38.5%，平均增加25.9%；NrfH豐度降幅為5.6%～11.3%，平均降低8.8%。

圖4 不同施肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤硝酸鹽異化還原成銨過(guò)程功能基因豐度Fig. 4 The abundance of soil dissimilatory nitrate reduction genes as affected by fertilization modes at the full-fruit stage of spring tomato in greenhouse

隨有機(jī)肥施用比例的增加，土壤硝酸鹽異化還原成銨過(guò)程N(yùn)irB、NirD和NrfA基因豐度均呈增加的趨勢(shì)。與2/4CF+2/4M、3/4CF+1/4M處理相比，1/4CF+3/4M處理NirB、NirD和NrfA豐度增幅分別為15.5%～23.7%、1.0%～19.9%和3.3%～6.0%，平均分別增加19.6%、10.4%和4.6%。

2.4 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式對(duì)設(shè)施春茬番茄盛果期土壤N2O排放量的影響

如圖5所示，設(shè)施春茬番茄盛果期各施肥模式土壤N2O排放量總體趨勢(shì)基本一致，均表現(xiàn)出土壤N2O排放量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。在培養(yǎng)期間，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式土壤N2O排放量均高于4/4CF處理，培養(yǎng)1、3、7、14、28天的土壤N2O排放量增幅分別為113.8%～389.83%、6.6%～109.1%、11.2%～95.5%、44.9%～83.6%和29.7%～84.6%，平均分別增加237.3%、34.2%、51.4%、61.7%和62.0%，其中高碳有機(jī)替代模式(1/4CF+3/4M、2/4CF+1/4M+1/4S、2/4CF+2/4S)排放量更高，培養(yǎng)1、3、7、14、28天的土壤N2O排放量較4/4CF處理平均分別增加215.2%、50.1%、67.3%、71.6%和73.8%。

圖5 不同施肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤N2O排放量Fig. 5 Soil N2O emission fluxes as affected by fertilization modes at the full-fruit stage of spring tomato in the greenhouse

隨有機(jī)肥用量的增加，土壤N2O排放量呈增加的趨勢(shì)。與2/4CF+2/4M、3/4CF+1/4M處理相比，1/4CF+3/4M處理培養(yǎng)1、3、7、14、28天的土壤N2O排放量平均分別增加32.4%、90.0%、56.0%、24.9%和29.3%。

從培養(yǎng)第3天開(kāi)始，高碳有機(jī)替代模式(1/4CF+3/4M、2/4CF+1/4M+1/4S、2/4CF+2/4S)土壤N2O排放量高于低碳有機(jī)替代模式(3/4CF+1/4M、2/4CF+2/4M)，培養(yǎng)3、7、14、28天的土壤N2O排放量增幅平均分別為36.5%、33.5%、16.8%和21.7%。

經(jīng)計(jì)算得出培養(yǎng)28 天的土壤N2O累計(jì)排放量(圖6)。有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式土壤N2O累計(jì)排放量均高于4/4CF處理，其中高碳有機(jī)替代模式效果明顯。與單施化肥模式相比，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式土壤N2O累計(jì)排放量增幅為33.6%～90.9%，平均增加59.6%，其中高碳有機(jī)替代模式土壤N2O累計(jì)排放量較單施化肥模式增幅為59.9%～90.9%，平均增加71.3%。

圖6 不同施肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤N2O累計(jì)排放量Fig. 6 Soil N2O cumulative emission fluxes as affected by fertilization modes at the full-fruit stage of spring tomato in the greenhouse

2.5 不同施肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤氮循環(huán)過(guò)程與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

如表3所示，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式較4/4CF處理可提高土壤全氮、有機(jī)碳、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量，增幅分別為20.3%～72.9%、24.0%～67.1%、10.8%～76.9%和107.4%～188.9%。冗余分析(RDA)結(jié)果表明，土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤氮循環(huán)功能微生物影響較大(圖7)。在5個(gè)理化指標(biāo)(全氮、有機(jī)碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和pH)中，硝態(tài)氮(P=0.01)、銨態(tài)氮 (P= 0.03)和有機(jī)碳 (P= 0.05)對(duì)土壤氮循環(huán)功能微生物影響顯著，分別解釋其群落結(jié)構(gòu)變異的34.0%、13.3%和11.3%。

表3 不同施肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤基本理化性質(zhì)Table 3 Soil physicochemical properties as affected by fertilization modes at the full-fruit stage of spring tomato in the greenhouse

圖7 土壤氮循環(huán)功能微生物與土壤理化性狀關(guān)系冗余分析Fig. 7 Redundancy analysis (RDA) of soil N cycling functional microorganisms and soil physicochemical properties

此外，通過(guò)Spearman相關(guān)性分析(圖8)表明，土壤 PNR 與土壤有機(jī)碳 (r= 0.37)、銨態(tài)氮 (r=0.47)、土壤N2O累計(jì)排放量(r= 0.56)以及反硝化過(guò)程功能基因 [NapAB(r= 0.78)、NirK(r= 0.21)和NorB(r= 0.53)]呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與土壤 pH (r=–0.40)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；土壤N2O累計(jì)排放量與土壤有機(jī)碳 (r= 0.90)、全氮 (r= 0.83)、硝態(tài)氮 (r=0.83)、銨態(tài)氮 (r= 0.64)，及反硝化過(guò)程功能基因[NapAB(r= 0.67)、NirK(r= 0.49)、NirS(r= 0.36)和NorB(r= 0.88)]呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與土壤 pH (r=–0.52)和硝化過(guò)程功能基因 [AmoA(r= –0.62)、AmoB(r= –0.64)、AmoC(r= –0.71)和Hao(r=–0.77)]呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖8 土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)、硝化潛勢(shì) (PNR)、N2O累計(jì)排放量及氮循環(huán)功能基因關(guān)系圖Fig. 8 Triangle diagram illustrating relationships among soil properties, potential nitrification rate (PNR), N2O cumulative emission fluxes, and N-cycle functional genes according to Spearman’s correlation coefficient

3 討論

土壤氮循環(huán)過(guò)程中硝化與反硝化過(guò)程是極其重要的環(huán)節(jié)，硝化過(guò)程是將土壤有機(jī)氮礦化產(chǎn)生硝態(tài)氮以及肥料中的銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮的過(guò)程，其產(chǎn)生的硝態(tài)氮易受到反硝化過(guò)程及淋洗損失，對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生消極影響[20–21]。土壤硝化過(guò)程通常分為氨氧化和亞硝酸鹽氧化過(guò)程，氨氧化被認(rèn)為是第一步驟(限速步驟)，也是全球氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，秸稈替代部分化肥模式的土壤PNR均高于單施化肥模式(表2)；單施化肥模式氨氧化古菌屬(AOA)、氨氧化細(xì)菌屬(AOB)豐度及硝化過(guò)程AmoA、AmoB、AmoC及Hao功能基因豐度均高于有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式。功能基因豐度高低可以在一定程度上反映其介導(dǎo)的物質(zhì)循環(huán)過(guò)程發(fā)生的潛力[23]。秸稈的C/N較高，可增加微生物對(duì)無(wú)機(jī)氮的固持作用，使其轉(zhuǎn)化為微生物量氮儲(chǔ)存，進(jìn)而降低土壤有機(jī)氮的礦化作用[20,24]，即配施秸稈模式土壤PNR低于僅配施有機(jī)肥模式；設(shè)施蔬菜具有特殊的生長(zhǎng)環(huán)境(高溫、高濕及高肥)，且取樣時(shí)期為番茄盛果期，此時(shí)作物對(duì)土壤養(yǎng)分需求量大，造成本研究土壤PNR較高且有機(jī)肥/秸稈配施化肥模式增幅較高。AOA富含脲酶基因，對(duì)尿素的響應(yīng)較高，AOB的硝化活性受無(wú)機(jī)氮肥的影響較大[25–26]，本研究施用的化肥N為尿素，單施化肥模式較有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式更有利于AOA和AOB生長(zhǎng)繁殖，故單施化肥模式AOA和AOB豐度較高，進(jìn)而導(dǎo)致硝化過(guò)程功能基因豐度增加。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果(圖7)表明，Amo功能基因豐度均與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及有機(jī)碳含量呈顯著負(fù)相關(guān)，故有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式可能通過(guò)影響土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及有機(jī)碳含量，進(jìn)而影響硝化過(guò)程Amo功能基因的表達(dá)。目前對(duì)編碼羥胺氧化酶Hao基因研究集中在純菌株的基因表達(dá)結(jié)果和功能蛋白[26]，對(duì)復(fù)雜土壤生態(tài)環(huán)境中Hao變化還無(wú)法解釋。設(shè)施蔬菜生產(chǎn)氮損失主要途徑為硝酸鹽淋溶，本研究中有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式降低硝化過(guò)程功能基因豐度，從微生物豐度角度看是減弱硝酸鹽淋溶損失。

土壤反硝化過(guò)程是NO3?還原成N2O或N2的一系列反應(yīng)，主要包括NO3?→NO2?→NO→N2O→N2過(guò)程[27]，參與該過(guò)程的功能基因有NarGHI、NapAB、NirK、NirS、NorB和NosZ。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，設(shè)施蔬菜有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式較單施化肥模式可提高NapAB、NirK、NorB和NosZ豐度。目前的研究表明參與N2O還原成N2過(guò)程僅為NosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶，且NosZ基因存在于細(xì)菌和古菌中，真菌缺少該基因，故真菌無(wú)法完全參與反硝化作用將N2O還原成N2[28–30]；反硝化過(guò)程中 (NirK+NirS)/NosZ值可預(yù)測(cè)N2O排放，通過(guò)提高NosZ基因豐度，降低該比值使N2O還原大于產(chǎn)生，進(jìn)而減少N2O產(chǎn)生潛力[25,31]。本研究表明有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式可增加NosZ基因豐度，且僅2/4CF+1/4M+1/4S模式(NirK+NirS)/NosZ值低于單施化肥模式，可降低N2O產(chǎn)生潛力，進(jìn)而減小反硝化過(guò)程對(duì)環(huán)境污染。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果(圖8)表明土壤硝態(tài)氮和有機(jī)碳對(duì)N2O的排放產(chǎn)生顯著影響，這很好的解釋了N2O排放對(duì)氮源和碳源的響應(yīng)，且反硝化過(guò)程功能基因(NapAB、NirK、NirS、NorB)豐度均與N2O的排放呈顯著正相關(guān)，尤其是NorB(NO→N2O)功能基因?qū)2O的排放影響最大，因此推斷功能基因豐度越高此過(guò)程發(fā)生的程度越大，該結(jié)果可為后續(xù)研究提供啟示；土壤PNR與反硝化過(guò)程功能基因(NapAB、NirK和NorB)呈顯著正相關(guān)，此結(jié)果說(shuō)明硝化過(guò)程增加土壤硝態(tài)氮的積累，進(jìn)而促進(jìn)反硝化過(guò)程的發(fā)生。

此外，硝態(tài)氮還可通過(guò)硝酸鹽異化還原成銨過(guò)程(DNRA)轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮供作物吸收利用，進(jìn)而增加土壤對(duì)氮素的固持[7]。影響該過(guò)程的因素有以下幾點(diǎn)：DNRA途徑主要是通過(guò)有機(jī)質(zhì)發(fā)酵，故土壤中有機(jī)質(zhì)含量是影響該過(guò)程的重要因素，有機(jī)肥/秸稈等外源碳的添加能刺激DNRA發(fā)生；在土壤環(huán)境中，一定范圍內(nèi)C/N越高，DNRA過(guò)程越容易發(fā)生[32]。本研究結(jié)果顯示，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式土壤DNRA過(guò)程功能基因豐度高于單施化肥模式。究其原因?yàn)椋涸谕寥乐惺┯糜袡C(jī)肥或秸稈后，為土壤帶來(lái)新鮮的有機(jī)質(zhì)，刺激DNRA的發(fā)生，進(jìn)而將硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，保護(hù)土壤中的氮素。

綜合本試驗(yàn)結(jié)果及10年定位試驗(yàn)產(chǎn)量數(shù)據(jù)(2/4CF+1/4M+1/4S模式產(chǎn)量最高)[33]，表明化肥―有機(jī)肥―秸稈配施模式(2/4CF+1/4M+1/4S)為設(shè)施菜田可持續(xù)健康發(fā)展的模式。

4 結(jié)論

有機(jī)肥/秸稈替代部分化肥降低土壤硝化基因豐度，增加土壤反硝化、硝酸鹽異化還原成銨過(guò)程功能基因豐度。因而，在養(yǎng)分需求關(guān)鍵時(shí)期，可以提高氮素的循環(huán)和對(duì)作物的供肥強(qiáng)度，減少硝態(tài)氮的淋洗風(fēng)險(xiǎn)。綜合考慮設(shè)施蔬菜產(chǎn)量和土壤氮循環(huán)功能基因指標(biāo)以及實(shí)際可操作性，化肥―有機(jī)肥―秸稈配施模式(2/4CF+1/4M+1/4S)為設(shè)施菜田可持續(xù)發(fā)展的健康、高產(chǎn)施肥模式。