楊海平，咸 洋，韓 彪，王 磊，葛 磊，解孝滿，李文清

（山東省林草種質(zhì)資源中心，山東濟(jì)南250102）

林木種子保存是林業(yè)研究的基礎(chǔ)性、戰(zhàn)略性工作。我國(guó)林木種子保存研究發(fā)展緩慢，除了樹木種類繁多、野外采集困難等基本特征外，一個(gè)重要原因在于木本植物產(chǎn)生大量頑拗性種子。據(jù)報(bào)道，約5%～10%的被子植物種子是頑拗性種子[1]，在熱帶地區(qū)約47%的植物種子為頑拗性種子[2]。頑拗性種子主要是木本植物種子，一般種子體積較大，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，這些種子不耐干燥，無(wú)法低溫保存，是公認(rèn)的世界性難題，頑拗性種子保存技術(shù)是林木種子保存研究的重要方向[3]。目前對(duì)林木種子頑拗性特征研究尚未取得突破性進(jìn)展，種子頑拗性產(chǎn)生機(jī)理和脫水傷害機(jī)制還沒有形成理論體系[4-5]，這是制約林木頑拗性種子保存研究的關(guān)鍵問(wèn)題。

頑拗性林木種子包括橡膠、木薯、油棕等作物；龍眼、荔枝、芒果等熱帶水果；咖啡、桂皮、八角等香(飲)料；板栗、榛子、銀杏等重要經(jīng)濟(jì)林；殼斗科、棕櫚科等用材和觀賞林[6-7]。鑒于頑拗性種子保存對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要性，其頑拗性形成機(jī)理和保存技術(shù)研究顯得迫切而重要。林木頑拗性種子為人類提供了許多寶貴的資源，相關(guān)研究成果已成為種子研究和科普的重要方向[8-9]。

1 頑拗性種子的概念和分布

1.1 種子頑拗性概念產(chǎn)生

Roberts[10]根據(jù)植物種子保存特性將種子劃分為頑拗性種子（recalcitrant seeds）和正常性種子（orthodox seeds）。Farrant[11]提出植物種子頑拗性是連續(xù)的群體，存在低度、中度、高度等不同類型。Ellis[12]認(rèn)為頑拗性種子和正常性種子之間還存在中間性種子（intermediate seeds）。設(shè)施保存庫(kù)低溫保存正常性種子的理論基礎(chǔ)是種子生命力方程，而頑拗性種子的存在則為種子保存行為提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。研究表明，頑拗性種子具有脫水敏感性，大多數(shù)頑拗性種子在成熟脫落時(shí)依然保持較高的含水量，這類種子輕度脫水后種子活力顯著下降[13]，頑拗性種子無(wú)法在低溫和低濕的環(huán)境下長(zhǎng)期保存，因此種子保存庫(kù)無(wú)法保存這類種子，這使得頑拗性種子成為種子保存研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[14,15]。

1.2 頑拗性種子種類和分布

頑拗性種子主要是多年生木本植物的種子及少量水生植物的種子。Farnsworth[16]根據(jù)文獻(xiàn)資料，發(fā)現(xiàn)有195 種植物種子屬于頑拗性種子，分屬78 個(gè)科和195 個(gè)屬；Mayrinck[17]比較了巴西生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)30科79 種植物種子，發(fā)現(xiàn)47.4%的物種產(chǎn)生正常性種子，19.2%產(chǎn)生中間性種子，33.3%產(chǎn)生頑拗種子。劉明航[9]根據(jù)英國(guó)皇家植物園邱園（KEW）種子信息網(wǎng)站公布的種子信息，整理了24781 份種子信息，其中620 種頑拗性種子，149 種中間性種子，23472 種正常性種子，540 種不確定，頑拗性種子和中間性種子約占統(tǒng)計(jì)數(shù)量的3.1%。產(chǎn)生頑拗性種子的植物多分布于熱帶，溫帶的頑拗性種子主要集中在殼斗科和槭樹科，大多數(shù)科的植物種子保存類型通常包括2 種(頑拗、正常)或3 種(頑拗、中間、正常)類型[18]，因此種子的保存特征和其所屬的科屬無(wú)必然的聯(lián)系，沒有明顯的系統(tǒng)分類學(xué)特征[19]。Tweddle[20]對(duì)不同生境條件下植物種子特性研究，發(fā)現(xiàn)溫帶地區(qū)的517 種草本植物種子僅0.2 %的種類不耐脫水，但是886 種木本植物種子有18%的植物種子在干燥后失去活力。處于不同生境的同一物種，其脫水耐受性亦有差別，Chen[21]對(duì)西南地區(qū)野生茶樹（Camellia sinensisL.）脫水耐性的研究表明，不同生境茶樹種子脫水耐性存在明顯差異。Tweddle[20]對(duì)93 科886 種喬（灌）木的種子進(jìn)行研究表明，在熱帶及亞熱帶地區(qū)，常綠雨林47%為脫水敏感性物種，而熱帶沙漠和半沙漠地區(qū)僅2%； 在溫帶地區(qū)，濕潤(rùn)的溫帶森林有23%是頑拗型種子，溫帶沙漠及半沙漠地區(qū)幾乎沒有頑拗性物種。

2 頑拗性種子特征

2.1 頑拗性種子的基本特征

文彬[14]把種子頑拗性的特征劃分為種間、種內(nèi)和個(gè)體發(fā)育3 個(gè)層面，提出種子頑拗性是一種復(fù)合性狀，其核心性狀包括耐脫水、耐低溫及耐保存等方面的內(nèi)容，頑拗性的伴隨性狀包括種子大小、千粒重、含水量、休眠特性、分類地位、地理分布和保護(hù)性物質(zhì)含量等多方面的內(nèi)容。Berjak[22]認(rèn)為不同植物的種子具有不同程度的頑拗性，頑拗性與正常性不是絕然分開的，而是逐漸過(guò)渡的，構(gòu)成一個(gè)種子頑拗性的連續(xù)譜，頑拗性種子和正常性種子位于這個(gè)連續(xù)譜的兩端。就單一物種而言，其種子頑拗性特征應(yīng)該包括脫水敏感性特征、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、細(xì)胞成分特征和分子生物學(xué)特征等方面[8,23]。

2.2 脫水敏感性與臨界含水量

種子頑拗性不僅在不同科、屬、種之間存在差異，同一物種在不同實(shí)驗(yàn)室有時(shí)也會(huì)得到不同的結(jié)論，例如印度苦楝種子曾被劃為頑拗性種子、中間性種子和正常性種子[24-25]。茶[26-27]、小?？Х萚12]、野生稻[28]種子保存特性也有不同的報(bào)道。頑拗性種子在不同發(fā)育階段脫水耐性亦存在差異，板栗[29]、蒲葵[30]等頑拗性種子在成熟前存在一個(gè)脫水耐性相對(duì)較高的階段，但是總體而言，這些種子在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中大部分時(shí)間對(duì)脫水敏感。由于不同實(shí)驗(yàn)室、不同研究人員對(duì)種子（胚）脫水處理方法不同，導(dǎo)致脫水耐性存在較大差異，PEG 滲透脅迫、ABA 預(yù)培養(yǎng)、脫水速度、梯度蔗糖培養(yǎng)等都可以用來(lái)誘導(dǎo)和提高一些頑拗性種子的脫水耐性[31]，因此，建立標(biāo)準(zhǔn)的頑拗性種子脫水技術(shù)是未來(lái)研究頑拗性種子脫水耐性的重要技術(shù)手段。

頑拗性種子特征與含水量具有重要的聯(lián)系，研究表明，頑拗性種子含水量一般較高，成熟期的含水量分布范圍約為36%～90%[32]。林木頑拗性種子脫水臨界含水量一般較高，含水量下降時(shí)，會(huì)導(dǎo)致種子脫水傷害。頑拗性種子內(nèi)部水分多為自由水，這些自由水維持了細(xì)胞旺盛的代謝水平[33]。有些頑拗性林木種子如山紅樹和望天樹，種子含水量很高，本身含水量足以保證萌發(fā)，亦無(wú)萌發(fā)限制因素，種子脫離母株前就可以萌發(fā)，而多數(shù)頑拗性種子脫落之后，在少量降雨后或濕潤(rùn)生境中可以自由萌發(fā)[13,34]。頑拗性種子在成熟時(shí)多保持較高含水量，對(duì)脫水和低溫敏感，是其無(wú)法長(zhǎng)期保存的重要因素[5,35]。目前，已有一些使用差示掃描量熱（DSC）技術(shù)分析種子內(nèi)部水分熱力學(xué)特征的報(bào)道，Hamilton[36]使用DSC 分析了澳大利亞3 種野生植物（C.australasica，C.inodora，C.garrawayi）不同含水量種子熱力學(xué)特征，Al[37]利用DSC 測(cè)定了長(zhǎng)葉金柑（Fortunella polyandra）種子的臨界含水量。綜上所述，使用DSC 等新技術(shù)結(jié)合種子（胚）萌發(fā)率測(cè)定，能夠?qū)ΨN子脫水敏感性和臨界含水量進(jìn)行鑒定，這將是頑拗性種子研究的重大創(chuàng)新，具有較好的應(yīng)用前景。

2.3 頑拗性種子形態(tài)特征

Cerabolini[38]認(rèn)為種子脫水耐性及保存壽命與種子形態(tài)特征有關(guān)。Pritchard[34]通過(guò)對(duì)南洋杉科和龍腦香科頑拗性種子與正常性種子的比較，發(fā)現(xiàn)頑拗性種子表面積與體積比值較小。Daws[6]發(fā)現(xiàn)正常性種子的種皮比頑拗性種子的種皮厚，頑拗性種子的種皮在整個(gè)種子所占的比重小。同屬植物中，頑拗性種子一般大于正常性種子，Gleiser[39]對(duì)46 種槭屬植物種子研究表明，正常性種子千粒重一般小于頑拗性種子千粒重。Hong[32]對(duì)23 種殼斗科植物種子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)16 種正常性種子千粒重小于7 種頑拗性種子千粒重。Xia[40]對(duì)頑拗性櫟屬植物種子研究發(fā)現(xiàn)，櫟屬植物果皮形態(tài)解剖特征決定了果實(shí)水分進(jìn)出的速率，形態(tài)特征對(duì)水分的保持具有重要意義。Walters[41]在研究頑拗性種子脫水時(shí)發(fā)現(xiàn)，脫水過(guò)程中細(xì)胞難以形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞的功能。Wesley-Smith[42-43]對(duì)植物Acer saccharinum低溫保存的胚軸超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察時(shí)認(rèn)為，細(xì)胞在低溫條件下的結(jié)冰現(xiàn)象是影響種子保存活力的重要影響因素，細(xì)胞內(nèi)冰晶會(huì)造成細(xì)胞的物理傷害，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞自噬降解，并可能引起程序性細(xì)胞死亡。韋樹根[23]對(duì)桑寄生頑拗性種子脫水后形態(tài)結(jié)構(gòu)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，種子脫水過(guò)程中細(xì)胞器受到損傷，線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)破裂，核仁逐步降解，脂肪體及淀粉粒分解劣變。目前，頑拗性種子形態(tài)特征研究多集中在種子整體形態(tài)特征或者胚軸細(xì)胞透射電鏡分析，還缺乏細(xì)胞群體層面的觀察和測(cè)定，因此需要對(duì)脫水過(guò)程中細(xì)胞群體形態(tài)變化效應(yīng)進(jìn)行分析，從而更加全面的了解頑拗性種子脫水過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞形態(tài)變化。

2.4 頑拗性種子分子機(jī)制研究

目前，關(guān)于頑拗性種子形成的分子機(jī)制尚無(wú)成熟的理論體系，但是不同的學(xué)者從不同的角度進(jìn)行了研究。頑拗性種子含水量較高，種子脫水過(guò)程中其內(nèi)部活性氧自由基（ROS）的含量逐漸增加，ROS 清除系統(tǒng)的活性與頑拗性產(chǎn)生具有密切聯(lián)系[44-46]。茶樹頑拗性種子減少活性氧自由基可以顯著降低種子脫水過(guò)程引起的損傷，提高種子萌發(fā)率[27]。因此，研究抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)對(duì)頑拗性種子形成機(jī)制研究具有重要意義。研究顯示，正常性種子的脫水耐受性獲得與應(yīng)激防御相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，這些基因包括胚胎后期豐富蛋白（LEA）、抗氧化系統(tǒng)和代謝途徑[47]。頑拗性種子在脫水過(guò)程中抗氧化系統(tǒng)活力下降和脂質(zhì)過(guò)氧化是種子活力喪失的重要表現(xiàn)[48]，Chen[49]進(jìn)一步指出，磷脂酶Dα1 介導(dǎo)的細(xì)胞膜磷脂酸的變化是脫水誘導(dǎo)種子活力喪失的關(guān)鍵決定因素。袁支紅[50]和Sunderlikova[51]分別使用cDNA-AFLP 技術(shù)分別對(duì)茶樹和橡膠頑拗性種子脫水過(guò)程中的差異基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)脫水過(guò)程中的部分差異基因與擬南芥衰老蛋白有很高的同源性，并發(fā)現(xiàn)了一些脫水相關(guān)基因。Kalemba[52]對(duì)槭屬3 種正常性種子和頑拗性種子脫水后的差異蛋白分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)小熱休克蛋白在脫水過(guò)程中高度表達(dá)。

劉迪[53]認(rèn)為種子頑拗性形成與小熱激蛋白（HSPs）和胚胎后期豐富蛋白（LEA）具有一定關(guān)系。李磊[15]指出正常性種子脫水耐性的獲得和保留與LEA 蛋白家族中的D-Ⅱ家族（脫水素）有著密切的關(guān)系。正常性種子脫水時(shí)，由于LEAs 蛋白的親水性，在細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和大分子周圍形成了一層具有保護(hù)作用的水態(tài)膜，從而使種子具有脫水耐性[54]。Julien[55]在對(duì)栗豆樹（Castanospermum australe）頑拗性種子的研究中認(rèn)為L(zhǎng)EA 的缺乏可能是造成其脫水敏感性的重要原因，文彬[14]在分析大量研究的基礎(chǔ)上，認(rèn)為L(zhǎng)EA 蛋白與脫水敏感性具有緊密聯(lián)系，但是不能簡(jiǎn)單的歸類為有和無(wú)的區(qū)別。目前尚無(wú)充分證據(jù)顯示種子頑拗性與缺乏某種蛋白相關(guān)，也缺乏頑拗性種子不同含水量梯度下蛋白質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量差異的系統(tǒng)研究，因此需要對(duì)頑拗性種子脫水過(guò)程中不同含水量種子（胚軸）蛋白質(zhì)組的變化進(jìn)行測(cè)定，找出關(guān)鍵差異蛋白，并研究關(guān)鍵差異蛋白在脫水過(guò)程中的作用，從而為揭示種子頑拗性的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

3 頑拗性種子保存技術(shù)

3.1 低溫保存

頑拗性種子短期貯存方法有氣調(diào)法、吸漲保存法、水浸保存法、部分脫水室溫保存法等。這些方法主要是在保持種子活力的前提下，將其保存在所能承受的最低溫度下，避免水分喪失，并防止微生物的侵染，可使頑拗性種子的壽命延長(zhǎng)至數(shù)月，甚至數(shù)年[56]，如頑拗性種子Trichilia dregeana在生長(zhǎng)期未完成前脫落，能在16℃的最佳保存條件下保存數(shù)月，才出現(xiàn)明顯的萌發(fā)狀態(tài)[57]，具有休眠特性的頑拗性種子龍眼和三七等可采用層積砂藏保存，在休眠期內(nèi)為種子提供水分，短期內(nèi)能夠保持種子活力[15]。但是這些短期保存方法因種而異，頑拗性種子由于耐脫水和耐寒程度不同，因此尚無(wú)適用所有頑拗性樹種的短期保存方法。

3.2 超低溫保存

頑拗性種子沒有規(guī)范性的長(zhǎng)期保存方法，目前使用較多的是液氮保存法，在低含水量下，種子能保存在-196℃下不受傷害。由于大部分頑拗性種子個(gè)體大，脫落時(shí)含水量高，而大粒的林木頑拗性種子難以快速脫水，而緩慢脫水和降溫會(huì)對(duì)種子產(chǎn)生致命傷害，小粒的頑拗性種子已有超低溫保存報(bào)道，這類種子容易快速脫水，如印度楝（Azadirachta indica）頑拗性種子的超低溫保存[58]。對(duì)于體型過(guò)大的林木頑拗性種子，需切取離體胚軸作為外植體進(jìn)行超低溫保存，Wen[59]和Wen[60]先后對(duì)蒲葵（Livistona chinensis）胚軸進(jìn)行超低溫保存條件篩選和超低保存試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)超低溫保存2年后，胚的活力幾乎無(wú)改變。韓彪[61]對(duì)板栗離體胚軸組織進(jìn)行進(jìn)行不同超低溫保存方法比較，發(fā)現(xiàn)PVS2 溶液可以提高超低溫保存后胚軸成活率。近年來(lái)林木頑拗性種子超低溫保存技術(shù)研究關(guān)注點(diǎn)集中于如何快速降低種子（胚）含水量、降低脫水過(guò)程中的氧化脅迫傷害，以及部分脫水、快速冷凍、后續(xù)加溫等過(guò)程中如何避免種子傷害的問(wèn)題[62-63]。但是總體而言，頑拗性種子超低溫保存還存在許多瓶頸問(wèn)題，大部分頑拗性種子超低溫保存仍然處于探索試驗(yàn)階段，低溫保存后形成植株也相對(duì)困難[23,64]，需要針對(duì)不同物種，研究適合的脫水條件和超低溫保存與恢復(fù)條件，而后總結(jié)規(guī)律，形成一套頑拗性種子超低溫保存的技術(shù)體系。

4 頑拗性種子研究展望

人類基于生產(chǎn)生活需要，根據(jù)保存類型的差別將種子分為頑拗性種子、中間性種子、正常性種子，頑拗性種子與正常性種子是一種連續(xù)的存在。未來(lái)頑拗性種子的研究方向應(yīng)該主要包括兩個(gè)方面，一是種子頑拗性機(jī)理研究，這將是一項(xiàng)綜合性的研究，涵蓋林學(xué)、植物學(xué)、種子科學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科交叉研究。二是保存技術(shù)研究，目前頑拗性種子的低溫保存和超低溫保存關(guān)鍵技術(shù)還不是很成熟，雖然有個(gè)別物種的成功案例，但是沒有可推廣應(yīng)用的技術(shù)體系。因此，需要不同研究領(lǐng)域的科學(xué)家共同合作，將機(jī)理研究和保存技術(shù)研究協(xié)同攻關(guān)，才能真正解決這一問(wèn)題。