朱 旭，李 楠，楊春明，李 闖，王忠偉，賀紅霞*

（1.吉林省農業(yè)科學院農業(yè)生物技術研究所，吉林 長春 130033；2.吉林省農業(yè)科學院經濟植物研究所，吉林 公主嶺 136105）

馬鈴薯在中國已有400多年的栽培歷史，至今已成為第四大糧食作物。中國人對馬鈴薯具有深厚的感情，在漫長的傳統(tǒng)農耕時代，馬鈴薯作為賴以裹腹的主要糧食作物，使無數(shù)人受益。而馬鈴薯又以其豐富的營養(yǎng)價值，成為中國飲食烹飪文化不可或缺的部分。中國馬鈴薯產量居世界首位，但在馬鈴薯育種研究上起步較晚，幾十年來雖然取得了很大成績，但育種方面因資源、投入、體制等的先天不足，與國際先進水平的差距很大。

馬鈴薯普通栽培種是同源四倍體，遺傳基礎狹窄，利用傳統(tǒng)的種內雜交不僅工作量大、效率低，很難選育出優(yōu)良的馬鈴薯新品種。遠緣雜交可以引入不同種或屬的優(yōu)良基因，尤其是馬鈴薯野生種的基因，存在遠緣雜交不親和現(xiàn)象，技術上存在一些困難?；ㄋ幣囵B(yǎng)可以實現(xiàn)在二倍體水平上育種，將大幅度提升選擇效率，利用花藥培養(yǎng)和2n 配子技術，還可以解決馬鈴薯實生種子后代分離的問題[1]。馬鈴薯野生種具有優(yōu)良的抗病抗逆基因，而且存在低還原糖含量，延長貯藏時間等利于提升馬鈴薯加工品質的基因[2]。但由于倍性的問題，通過常規(guī)的雜交育種很難將二倍體野生種馬鈴薯中的優(yōu)質基因輸入到普通栽培四倍體馬鈴薯中，而花藥培養(yǎng)產生的雙單倍體，可以成為實現(xiàn)二者之間的基因交流的橋梁[3]。花藥培養(yǎng)是在離體條件下，將發(fā)育到一定時期的花藥接種到適宜的培養(yǎng)基中，產生胚狀體或愈傷組織，最終使其發(fā)育分化成為完整植株的過程[4,5]。本文概述了花藥培養(yǎng)在馬鈴薯育種中的意義以及目前中國馬鈴薯花藥培養(yǎng)關鍵技術的研究現(xiàn)狀，并對未來研究工作提出建議，為中國馬鈴薯花藥培養(yǎng)技術的發(fā)展提供參考。

1 花藥培養(yǎng)關鍵技術

1.1 外植體的選擇

1.1.1 基因型

植物基因型決定著花藥培養(yǎng)成功與否以及難易程度[6]。從花藥培養(yǎng)誘導胚狀體或愈傷組織的能力來看，在植物屬間、種間或品種間均存在很大的差異[7]，并且這種能力是可以遺傳的[8]。廣泛選擇基因型非常重要，中國學者20世紀80年代初，開展馬鈴薯花藥培養(yǎng)試驗，不斷地篩選對誘導產生反應的品系，誘導的品種有中晚熟品種也有早熟品種，還有抗晚疫病品種。通過花藥培養(yǎng)獲得過雙單倍體的四倍體栽培種有‘渭薯1號’[9]、‘高原7號’[10]、‘京豐1號’‘鄭州798-24’[11]、‘中心24’[12]、‘波C’‘訥16’‘克新13號’‘扎列娃’[13]、‘克97G8’‘白俄3’[14]、‘內薯7 號’‘春薯4 號’[15]，馬鈴薯中心品種‘S17’‘T3’‘KW47’[3]。此外，賀苗苗[16]以‘青薯2號’‘高原4號’‘青05-12-6’為材料誘導出了綠色植株，但倍性鑒定并未提及。

1.1.2 生理狀態(tài)

供體植株的生長條件（光周期、光強、溫度和礦質營養(yǎng)）以及生理狀態(tài)也能影響花藥培養(yǎng)效果[17]。高湘玲等[18]認為開花初期及盛花期所產生的花藥比開花末期產生的花藥誘導頻率高，而且花蕾要選擇健康植株的幼嫩花蕾。他們認為以下幾種情況不適合做花藥培養(yǎng)材料：花蕾開裂，花藥裸露在外邊的；早期落蕾和不成花器的；開花正常但花粉敗育或花粉發(fā)芽力很低的；開花正?；ㄋ幉婚_裂的?；ㄋ幮℃咦拥纳頎顟B(tài)受環(huán)境因素影響[19,20]，張鳳蘭等[21]、王建紅等[22]的研究表明，日照長短和溫度高低影響外植體胚狀體的發(fā)生率，光照時間長、環(huán)境溫度低的植株比光照時間短，環(huán)境溫度較高條件下的植株胚狀體發(fā)生率高。牟文平[23]認為花藥培養(yǎng)受季節(jié)和采樣時間的影響，春天的花藥比秋天的花藥更容易進行花藥培養(yǎng)，而且花藥取材盡量取開花初期至盛花期之間的，末花期的花藥生理狀態(tài)不好，不適宜花藥培養(yǎng)，該結論可供馬鈴薯栽培氣候條件差異大的地區(qū)參考。

1.1.3 發(fā)育時期

花粉的發(fā)育時期對于花藥培養(yǎng)成功與否至關重要[24]，花粉細胞只有在其發(fā)育周期中的特定時期才對培養(yǎng)程序有反應[18]。大多數(shù)植物花藥培養(yǎng)最適宜的時期是單核中晚期到雙核早期，但不盡相同[7,25]，而馬鈴薯胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期是單核早中期[26]?；ǚ鄣陌l(fā)育時期和其對應的生長發(fā)育特點有一定的關聯(lián)，比如可以根據(jù)花藥、花蕾的長度，以及花藥顏色等來判斷花粉發(fā)育時期，但不同品種之間有一定的差別，甚至同一花藥內特定發(fā)育時期小孢子占比是不同的[3]。由于品種不同，單核中、晚期的花藥長3～8 mm不等；另外在甘藍中，同一品種的不同花期單核時期的長度也有區(qū)別。馬勇斌[27]選用5份甘藍材料做了甘藍植株不同花期小孢子單核靠邊期花蕾長度變化觀察，發(fā)現(xiàn)同一品種，不同花期單核靠邊期花蕾的長度有所不同，在初花期，花蕾長度最短，范圍差值最大；盛花中、后期最長，花蕾長度范圍差值最小。這一現(xiàn)象在馬鈴薯中是否存在，尚未有報道。小孢子發(fā)育時期與生長發(fā)育特點是密切相關的[28]，為了提高花藥培養(yǎng)效率，可以通過直觀的對應性狀取材，減少試驗操作步驟，降低污染率。

1.2 外植體消毒

滅菌操作是植物組織培養(yǎng)的關鍵技術，會影響整個試驗的效率和數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果[3]。植物組織培養(yǎng)過程中如果出現(xiàn)污染，則造成大量人力、物力和財力的浪費。對于馬鈴薯花藥培養(yǎng)這種取材有明顯季節(jié)性的試驗，消毒處理更要注意。中國學者大多采用兩種消毒劑組合在一起使用，酒精+升汞，酒精+飽和漂白粉，酒精+次氯酸鈉，酒精所用濃度一般為70%或75%，浸泡時間30 s[16]；升汞濃度一般為0.1%，浸泡時間10～15 min[16]；次氯酸溶液濃度一般為10%，表面滅菌15 min[8]。以上消毒處理結束后，都用無菌水沖洗3～5次。高湘玲等[18]建議，采蕾應在晴天數(shù)日之后進行，雨后采蕾污染率達100%。

1.3 預處理

1.3.1 預冷處理

預冷處理是指在花藥培養(yǎng)之前，將材料置低溫條件下，培養(yǎng)一段時間再進行接種。預冷處理具有可以提高花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導率、促進成胚率，而且在煙草、小麥、大麥、水稻等許多植物中已經被證明。經過低溫處理的花藥，花藥中花粉的胚胎發(fā)生能力提高，活力延長，落入試驗體系中有效花粉的數(shù)量增加，從而提高了花粉胚胎的誘導率[29,30]。但在馬鈴薯花藥培養(yǎng)研究中，低溫處理是否對愈傷及胚狀體的誘導有利，尚存在爭議。中國學者戴朝曦[10]、賀苗苗[16]和盧翠華等[24]在試驗中將花藥低溫處理1～2 d并在最后的試驗中得到了雙單倍體；王玉娟等[9]和盧翠華等[24]認為對花蕾進行適當?shù)蜏靥幚?，可提高愈傷組織的形成和分化能力；賀苗苗[31]對低溫處理、熱激處理的時間進行了研究，該研究證明高低溫相結合的預處理方式比單獨使用一種，馬鈴薯的愈傷誘導率高；李霞等[32]用原始二倍體栽培種的雜種無性系為試驗材料，研究預處理溫度對二倍體花藥培養(yǎng)中愈傷組織誘導情況，結果表明4℃低溫預處理48 h可以明顯提高花藥愈傷組織誘導率；而朱明凱等[11]將花藥在4℃低溫處理24，48和72 h，與未經低溫處理的花藥進行對比，發(fā)現(xiàn)低溫處理過的誘導效果與對照不處理的無明顯差別，王蒂等[8]也認為低溫處理對馬鈴薯花藥培養(yǎng)無益。出現(xiàn)以上不同的結論，可能是由于材料、培養(yǎng)基的不同，原因有待研究。

1.3.2 熱激處理

熱激處理是指將接種后的花藥或花粉置于高溫條件下培養(yǎng)一段時間，然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。不同物種或基因型最佳熱激處理的溫度和時間是不同的[6]。王蒂等[8]認為高溫預處理能夠顯著地增加胚狀體數(shù)量。莊軍平[33]也認為合適的短時間高溫處理有助于提高愈傷組織的誘導率和胚狀體的產生。馬鈴薯花藥熱激處理常用溫度32～38℃，處理時間1～3 d。

1.4 培養(yǎng)基成分

花藥和花粉對營養(yǎng)成分的要求因基因型而不同，營養(yǎng)成分對培養(yǎng)效果產生直接的影響，是單倍體植株誘導成功與否的關鍵，也決定著發(fā)育途徑[34]。馬鈴薯花藥培養(yǎng)常用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，并在此基礎上添加一些對愈傷及胚狀體誘導有益的成分。

1.4.1 激 素

戴朝曦[10]認為胚狀體分化對培養(yǎng)基要求不嚴格，在愈傷誘導培養(yǎng)基里可以直接分化出苗。王蒂等[8]、戴朝曦[10]和朱明凱等[11]均表示胚狀體不需要轉到分化培養(yǎng)基，愈傷組織的分化需要較高的細胞分裂素，而且6-芐氨基嘌呤（6-benzylamino-purine，6-BA）和激動素（Kinetin，KT）這兩種細胞分裂素混合使用的效果更好。梁彥濤[26]認為不添加激素或添加低濃度的激素有利于胚狀體植株的再生，其在試驗中獲得的胚性愈傷組織在無任何激素的MS培養(yǎng)基中的分化率高于添加了6-BA和KT的培養(yǎng)基。

1.4.2 硝酸銀

在組織培養(yǎng)中，外植體的褐化是普遍存在的，嚴重影響外植體的脫分化和再分化，并且馬鈴薯花藥褐化率非常高，在50%以上[26]。在培養(yǎng)基中加入硝酸銀，有兩方面的影響，一是能夠促進胚狀體的發(fā)生，二是能夠減輕或延緩花藥的褐化。冉毅東和戴朝曦[12]對硝酸銀誘導馬鈴薯雙單倍體及一倍體的效果做了試驗，認為花藥褐化程度和基因型有關。外植體在培養(yǎng)過程中產生的乙烯能夠使馬鈴薯花藥的褐化速度加快，在花藥誘導培養(yǎng)基中加入50～100 μmol/L硝酸銀，可顯著提高胚狀體的發(fā)生率，胚狀體出現(xiàn)的頻率最高可達16%，同時可提高胚狀體的分化率；硝酸銀還可延緩花藥的褐化，延長胚狀體形成期限13～20 d，在試驗中，不同基因型材料對相同濃度硝酸銀的反應是不一樣的，說明不同材料產生乙烯的程度可能是不同的[12]。趙欣[15]和梁彥濤[26]硝酸銀的梯度試驗，均證明隨著硝酸銀濃度的增加，愈傷組織誘導率先增加后降低，硝酸銀的添加量并不是越大越好。硝酸銀濃度過大，對材料有毒害作用。梁彥濤[26]認為30 mg/L的硝酸銀是降低花藥褐化的最佳濃度，趙欣等[35]試驗結果顯示，培養(yǎng)基中加入20 mg/L的硝酸銀愈傷組織誘導率最高。盧翠華等[24]在培養(yǎng)基中加入100 mg/L硝酸銀同樣誘導出了雙單倍體。不同基因型適宜的硝酸銀添加量可能不同，這需要進一步驗證。

1.4.3 活性炭

在培養(yǎng)基中加入活性炭，有利于花粉胚狀體或愈傷組織的發(fā)生，從而提高花粉植株的誘導率。在馬鈴薯的花藥培養(yǎng)基中加入0.5%～1.0%的活性炭可以有效地提高花粉植株的數(shù)量[7]。活性炭在花藥培養(yǎng)中對花藥褐化的影響顯著，梁彥濤等[36]通過試驗得出對馬鈴薯花藥褐化有顯著影響的因素最主要是活性炭、其次是硝酸銀；并且活性炭以0.2 g/L效果最佳。趙欣等[35]在培養(yǎng)基中分別添加0.25，0.50 和0.75 g/L的活性炭，以不加活性炭為對照，結果顯示添加0.50 g/L時，參試的兩個品種愈傷誘導率最高。其他各研究論文中使用的活性炭的添加量差別也較大，1～3 g/L[3,10,16]不等。

1.4.4 馬鈴薯提取液

馬鈴薯提取液具有均衡的氨基酸組分，對許多植物花藥培養(yǎng)都是有益的。馬鈴薯提取液對胚狀體的產生是有利的，濃度為50 g/L[10]效果較好。

1.5 轉分化培養(yǎng)基的時機

胚狀體和愈傷組織沖破花藥壁肉眼可見時，轉入分化培養(yǎng)基[10,11]。花藥培養(yǎng)3～8周后，藥壁破裂，愈傷組織或者花粉植株從開口處長出，直徑達到2～3 mm時放到分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)[7]。高湘玲等[18]也認為愈傷組織長到1～2 mm 時，可轉入分化培養(yǎng)基，過大過老的愈傷組織，不能迅速地誘導出植株來，及時的將愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基是很重要的。

1.6 再生過程

花粉植株的再生途徑有兩種，分別是胚狀體途徑和愈傷組織途徑。戴朝曦[10]共接種花藥20 720枚，獲得了愈傷組織204塊，胚狀體24個和3塊胚性細胞團。這3種組織均獲得了雙單倍體。試驗表明胚狀體的分化頻率是愈傷組織分化頻率的3 倍。試驗中所獲得的胚性細胞團是由白色、松散、小米狀的小顆粒組成，經過分化培養(yǎng)基5次繼代后，開始大量分化苗。能分化苗的愈傷組織是淡黃色且比較緊實，而花絲和花藥壁起源的愈傷組織是白色、半透明而且比較松散。

以愈傷組織誘導成植株，染色體倍性差異很大，而以胚狀體誘導成植株，染色體倍性均為雙單倍體。因此，以胚狀體直接誘導成苗比以愈傷組織途徑有明顯優(yōu)點。首先是數(shù)量多，一個胚性細胞團可誘導出10～50個胚狀體。其次是速度快，胚狀體是從單細胞直接分化成苗，因此比愈傷組織誘導成苗要快的多，而且從胚狀體誘導成苗的頻率比愈傷組織要高。再者，以胚狀體途徑成苗染色體倍性穩(wěn)定，均為雙單倍體，而愈傷組織途徑倍性復雜。因此根據(jù)目的，今后重點是掌握誘導胚狀體的條件，提高花粉植株的誘導頻率[11]。

1.7 倍性鑒定

由于受到花藥壁的影響，花藥培養(yǎng)再生的植株可能來源于花粉也可能來源于花藥壁，倍性鑒定是很有必要的。倍性鑒定有形態(tài)學鑒定、細胞學鑒定和流式細胞儀鑒定以及生化或分子標記鑒定法等。直接對花粉植株根尖進行染色體數(shù)目鑒定的細胞學鑒定是最有效、最可靠的方法[37]，也是馬鈴薯單倍體鑒定的常用方法。

1.8 培養(yǎng)條件

1990年之前，由于試驗條件受限，花藥培養(yǎng)誘導階段多在18～25℃的變溫條件下培養(yǎng)，散射光或連續(xù)光照培養(yǎng)，分化階段每天補充光照8～16 h，光強2 000～2 500 lx。王蒂等[8]則在自然散射光下，加白色燈2 000 lx晝夜照明，4～6周形成胚狀體。

1990年之后，花藥培養(yǎng)大多在25℃恒溫條件下進行，盧翠華等[24]在弱光條件下每天光照培養(yǎng)l6 h。王梓全等[29]、梁彥濤等[36]則在黑暗條件下，誘導愈傷組織或胚狀體。分化階段光強為2 000～2 500 lx，光照16 h/黑暗8 h。

2 花藥培養(yǎng)制約因素

自從曼陀羅花藥培養(yǎng)成功獲得單倍體植株后，許多植物利用花藥培養(yǎng)技術也相繼獲得了成功。中國從20世紀80年代初就開展了馬鈴薯花藥培養(yǎng)的研究工作，雖然取得了很大的進步，從無到有，也從一些基因型中誘導出了雙單倍體，但近20年間，馬鈴薯花藥培養(yǎng)的理論研究還不夠深入、系統(tǒng)，還沒有建立起一套完善的應用體系。這可能有三方面因素限制了花藥培養(yǎng)在馬鈴薯育種中的應用。

（1）基因型的限制：馬鈴薯普通栽培種的花藥誘導成苗頻率很低，如何提高誘導成苗率是今后花藥培養(yǎng)的重要問題。品種、培養(yǎng)基不同誘導效果差異很大，說明具有不同基因型的品種對同一生長條件適應性不同，同一品種對不同培養(yǎng)基又有明顯的選擇性[11]。有研究用80多個品種進行花藥培養(yǎng)，其中只有12個品種獲得愈傷組織，而真正獲得單倍體植株的只有兩個品種[7]。

（2）試驗材料供給受限：馬鈴薯花藥的采集具有明顯的季節(jié)性，而且馬鈴薯花藥極易褐化，一般花藥采集地與實驗室不在同一地點，往返兩地不僅增加了褐化風險，也增加了時間成本，給花藥培養(yǎng)帶來許多困難。

（3）科研投入不足：花藥培養(yǎng)操作繁瑣、工作量大、花藥培養(yǎng)效率較低，優(yōu)化培養(yǎng)體系需要投入較大精力，這方面研究投入遠遠不夠。

3 發(fā)展建議

3.1 廣泛的篩選基因型

基因型對馬鈴薯花藥培養(yǎng)是否成功起決定性作用，因此廣泛的篩選適宜花藥培養(yǎng)的基因型很有必要，一方面可以充分挖掘優(yōu)良的隱性基因，另一方面培育出的雙單倍體可以與二倍體野生種雜交，獲得野生資源中優(yōu)良的遺傳性狀，提高育種效率。

3.2 就近建立花藥培養(yǎng)材料試驗基地

影響馬鈴薯花藥培養(yǎng)的因素很多，而花藥培養(yǎng)工作能否高效開展，和試驗材料的供給有很大的關系。馬鈴薯花藥的采集具有明顯的季節(jié)性，馬鈴薯的花蕾形成、開花及受精結實對氣候條件很敏感，在溫室種植的馬鈴薯很難開花，花蕾形成后很容易落蕾，而且有花藥裸露在外的現(xiàn)象，難以作為花培材料。吉林省屬于北方一季作區(qū)，一年只有一次開花期，花期3～4周，尤以初花期和盛花期的花藥最適合培養(yǎng)，所有的花藥培養(yǎng)試驗均集中在短短2～3周，應在實驗室周邊建立花藥采集苗圃，避免往返取樣耽誤時間，可根據(jù)實驗需求隨用隨取，并降低試驗材料褐化風險，提高花藥培養(yǎng)工作效率。

3.3 加強花藥培養(yǎng)的科研投入，完善育種技術

雜交育種目前是中國最常用的育種方法，但選擇效果仍然很差，在野生種的利用方面也存在一些技術問題。馬鈴薯雙單倍體有著獨特的育種優(yōu)勢，將雜交育種和生物育種相結合，將大幅度提高育種效率。要想實現(xiàn)這一目標，必須提高花藥培養(yǎng)的科研投入，讓更多的科研人員參與到花藥培養(yǎng)技術研究中，不斷完善培養(yǎng)技術、提高培養(yǎng)效率，加大花藥培養(yǎng)技術在馬鈴薯育種中的利用，逐步建立完善的應用體系。