劉桂梅，王韋華

(渭南職業(yè)技術學院，陜西 渭南 714000)

0 引言

大腸桿菌是一種十分常見的動物腸道寄居群，它廣泛存在并且時刻威脅著公共衛(wèi)生安全[1-2]。試驗從陜西關中地區(qū)的豬養(yǎng)殖場采集豬源致病性大腸桿菌，對其分別進行分離和鑒定。

1 材料來源

無菌采集陜西關中地區(qū)豬養(yǎng)殖場的具有感染癥狀的瀕死豬的內臟40份進行分離與鑒定。

2 菌落培養(yǎng)

將所收集的內臟等器官組織每份取出適量加入稀釋液進行研磨后過濾離心，再取其上清液接種在培養(yǎng)基上，維持37℃恒溫，菌落培養(yǎng)完成后置于4℃環(huán)境下保存以備后續(xù)實驗使用。

3 革蘭染色鏡檢

無菌條件下取出之前培養(yǎng)完成的菌落，然后使用革蘭染色進行鏡檢，染色步驟分為涂片、初染、媒染、脫水、復染、鏡檢，涂片過程要維持無菌狀態(tài)，初染要注意將染液完全沖洗干凈，復染要維持染液染色30 s，鏡檢要等到標本片完全干燥后才可以進行，先使用低倍勁和高倍鏡最后使用油鏡。再將菌落分別接種到麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂以及SS培養(yǎng)基上，經過37℃恒溫過夜培養(yǎng)，觀察菌株的生長情況。

4 抗原血清型鑒定

取上述菌落進行接種，培養(yǎng)基為普通瓊脂，接種完成后將其置于37℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)24 h，然后再使用石炭酸生理鹽水沖洗培養(yǎng)基，沖洗下菌苔，將其收集于圓底試管中，制成濃稠的懸液，塞上試管的塞子后，對其進行2 h的121℃高壓處理，破壞菌落的K抗原。冷卻后使用特定血清對其進行玻板凝集反應，再設置一組生理鹽水的混合物作為實驗組的對照，觀察實驗組和對照組是否會出現(xiàn)凝集顆粒，并根據(jù)這一現(xiàn)象判斷菌落所屬的血清型。如果在30 s內出現(xiàn)了明顯的凝集者表示該反應為陽性。

5 毒力基因檢測

首先根據(jù)國際國內公布的基因序列，參照相關文獻對豬源致病性大腸桿菌設計毒力基因，再對用培養(yǎng)基培養(yǎng)后的細菌進行生理鹽水滅菌、洗滌以及稀釋后，將其作為細菌的DNA 模板，開始進行PCR檢測。PCR檢測在溫度為94℃的條件下進行10 min，再進行循環(huán)、退火等一系列操作后結束反應，反應后的產物經瓊脂糖凝膠開始電泳驗證。一般為菌落設計9種毒力基因分別進行PCR檢測，對其檢測結果進行分析討論。

細菌的DNA模板提取具體過程如下。

1)取少量培養(yǎng)的細菌液于試管內，離心后將上清去除干凈。

2)向第一步中所獲得的沉淀物也就是細菌菌體加入緩沖液A后，進行振蕩直到菌體懸浮，可以滿足實驗要求。

3)向試管內加入蛋白酶溶液，再次振蕩，將菌體與蛋白酶溶液充分混合。

4)再向試管內加入緩沖液B，經過振蕩、靜置，溶液變得清亮之后，去除掉試管內壁可能存在的水珠。

5)加入無水乙醇，經過振蕩后，試管內可能會出現(xiàn)部分絮狀沉淀，稍稍離心后，去除掉試管內壁出現(xiàn)的水珠。

6)將步驟5)得到的溶液以及可能會出現(xiàn)的絮狀沉淀加入一個吸附柱，再次離心之后將廢液倒掉，吸附柱妥善保存，放置于收集管中。

7)向上一步驟所得的吸附柱內加入緩沖液C，該緩沖液應事先進行加入無水乙醇的處理，再次離心之后將廢液倒掉，吸附柱妥善保存，放置于收集管中。

8)向吸附柱內加入緩沖液D，同樣事先進行了加入無水乙醇的處理，離心之后將廢液倒掉，吸附柱妥善保存，放置于收集管中。

9)再次重復上一步驟。

10)將吸附柱放置在收集管中并進行離心，將廢液倒掉。再將吸附柱在室溫條件下靜置幾分鐘，以此來晾干之前材料中尚有殘余的漂洗液。

11)最后取出一個干凈的離心管，將吸附柱放置其中，滴加洗脫緩沖液，再次靜置，離心后將溶液收集起來，存放到離心管內。

6 小白鼠的致病性實驗

1)首先制備感染菌液，將分離后的菌株在培養(yǎng)基上進行37℃恒溫培養(yǎng)，經過18 h后挑取到肉湯培養(yǎng)基內，再經過12 h的37℃恒溫振蕩培養(yǎng)。

2)將一定數(shù)量的小白鼠等量分為8組，1組5只。其中前7組作為該實驗的實驗組，最后一組作為該實驗的對照組，實驗組使用不同的分離菌株進行37℃的恒溫培養(yǎng)，再將其注入到小白鼠體內，對照組則只注入營養(yǎng)液，分別注入后觀察小白鼠的臨床表現(xiàn)。

3)每2 h記錄小白鼠的精神狀態(tài)、進食狀況等臨床表現(xiàn)，連續(xù)觀察15 d，記錄各小組內小白鼠的死亡情況。

4)發(fā)生死亡后對小白鼠進行解剖觀察，并將小白鼠的各器官組織在無菌條件下取出后將其制作為病理切片，并再次對其進行細菌分離并鑒定。

7 實驗結果分析

1)根據(jù)培養(yǎng)基的培養(yǎng)特性以及革蘭染色結果來判斷分離菌株是否符合大腸桿菌的特征。鏡檢時看到菌落為短小桿菌，革蘭氏呈陰性。把分離細菌之后的培養(yǎng)物接種在麥康凱培養(yǎng)基上并維持37℃進行培養(yǎng)后，菌落表面光滑，呈現(xiàn)濕潤的粉紅色且菌落的邊緣整齊；將其接種到伊紅美蘭瓊脂上并維持37℃進行培養(yǎng)后，菌落光滑反光，呈現(xiàn)黑色或者棕綠色；接種在SS培養(yǎng)基上，維持37℃進行培養(yǎng)后菌落不生長。這些都是符合大腸桿菌的形態(tài)以及生理特征。此外對于可疑菌落要對其單獨進行氧化酶等實驗并使用鑒定系統(tǒng)對其進行鑒定。

2)血清型的鑒定結果要根據(jù)玻片凝集實驗的結果對豬源致病性大腸桿菌的血清型以及菌株類型進行具體的分析。毒力基因檢測、藥物的敏感性分析都要根據(jù)實驗的具體結果進行討論分析。

3)小白鼠的致病性實驗通過實驗組與對照組的對比，更為直觀地展示了豬源致病性大腸桿菌對動物體內各器官組織的危害。通過該實驗可以發(fā)現(xiàn)豬源致病性大腸桿菌對小白鼠具有很強的致病性，豬源致病性大腸桿菌對人類和動物存在著極大的威脅，應該引起人們的關注。

8 結語

根據(jù)上文所述，豬源致病性大腸桿菌的鑒定與分離方法有了一個較為詳盡的思路，但是也應該看到豬源致病性大腸桿菌的研究任重而道遠，對于該類細菌的研究已經涉及到了眾多學科，包括動物醫(yī)學、食品衛(wèi)生安全學以及人類醫(yī)學等。在當前醫(yī)療技術手段下，對于豬源致病性大腸桿菌的感染還沒有行之有效的治療方案和治療藥物，因此人類和動物的預防感染就顯得尤為重要，而要想加強對食品安全的監(jiān)督與檢測，就必須尋找更加高效的針對豬源致病性大腸桿菌的鑒定方法和檢測手段。