羅淑娟 陳小芬 林逸婷 盧 鑫 張 濤

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530222；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530011；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

本課題組前期臨床研究證實，健脾清熱活血方具有明確緩解輕度潰瘍性結(jié)腸炎（UC）效用，其療效與艾迪莎相仿，對于中度UC患者配合激素使用，亦有輔助作用［1］。動物實驗發(fā)現(xiàn)健脾清熱活血方具有促進(jìn)黏膜屏障修復(fù)，誘導(dǎo)炎癥緩解的效用，但其具體的機(jī)制還有待深入研究［2］。UC發(fā)病機(jī)制與氧自由基產(chǎn)生過多及脂質(zhì)過氧化有密切關(guān)系，血管活性因子即腸源性縮血管物質(zhì)活性增強(qiáng)，導(dǎo)致腸道缺血，同時結(jié)腸黏膜中的炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等經(jīng)血液循環(huán)浸潤到腸道的黏膜層、黏膜下層，引起腸黏膜受損。在還原性輔酶Ⅱ、NADPH氧化酶以及呼吸作用下產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物如O2-、OH-等，這些物質(zhì)進(jìn)一步加重腸黏膜損傷［3-5］。keap-1-Nrf2路徑是機(jī)體最主要的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)通路之一，在促進(jìn)黏膜修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、降低炎癥反應(yīng)等多方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，但健脾清熱活血方是否通過介導(dǎo)keap-1-Nrf2通路調(diào)控clau?din-2表達(dá)而發(fā)揮其防治UC的效應(yīng)尚不清楚。本研究應(yīng)用三硝基苯磺酸（TNBs）制備UC模型，將健脾清熱活血方作用于上述模型，應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)檢測結(jié)腸組織病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、環(huán)氧氯丙烷結(jié)合蛋白1（ke?ap-1）、Nrf2以及claudin-2表達(dá)變化，客觀評價健脾清熱活血方的效用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 90只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量150～180 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（桂）2014-02。所有動物實驗均在廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心完成，許可證號：SYXK（桂）2018-0012。動物飼養(yǎng)在恒溫房間（21～23℃），每隔12 h光暗循環(huán)，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。所有實驗均符合動物3R福利原則。

1.2 試劑及儀器 5%2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）購自美國SIGMA公司（貨號：P2297），10%中性甲醛、戊二醛、無水乙醇購于廣西博仁生物試劑有限公司；Anti-keap-1、Anti-Nrf2以及Anti-claudin-2均購自美國 Abcam 公司（貨號：ab119403，ab31163，ab53032），辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自武漢博士德公司（貨號：GA1014），EDTA緩沖液（博士德，SN109）；伊紅（中杉，S133）、蘇木素（中杉，S130）、DAB顯色試劑盒（中杉，SB1030），免疫組化濕盒（抗體孵育用），BX43F電子顯微鏡（日本OLYMPUS）、透射電鏡（日本日立H7650）等。

1.3 實驗藥物 健脾清熱活血方（馬齒莧15 g，白術(shù)10 g，白芍15 g，水蛭10 g，三七10 g，救必應(yīng)15 g，炙甘草6 g。用蒸餾水煎煮藥液，濃縮至含生藥1 g/1.5 mL，過濾分裝4℃保存?zhèn)溆茫?。美沙拉嗪（商品名艾迪莎）?00 mg/袋，法國愛的發(fā)制藥集團(tuán)生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20040727。藥物均購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥房。

1.4 分組與造模 將90只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、西藥組和中藥低、中、高劑量組，每組15只。參照文獻(xiàn)報道［6］，正常組除外，其余各組均采用TNBS 100 mg/kg+50%乙醇法灌腸法制備UC模型，連續(xù)灌腸3 d，休息4 d。

1.5 給藥方法 造模開始第7日起，模型組予等劑量生理鹽水灌胃，中藥低、中、高劑量組予健脾清熱活血方4.29、8.58、17.16 g/kg灌胃（成人用藥量的3、6、12倍，即實驗動物與人按體表面積比等效劑量換算，將每天劑量折算成大鼠等效劑量作為中劑量組），西藥組予美沙拉嗪灌胃（0.4 g/kg），正常組同步飼養(yǎng)。連續(xù)給藥14 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）大鼠一般情況。觀察各組大鼠毛發(fā)、體質(zhì)量、耗食耗水、大便、死亡情況。2）結(jié)腸組織病理學(xué)變化。末次給藥后予10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死全部大鼠，截取距肛門8 cm處病變部位，沿縱軸切開，分別置于中性甲醛、戊二醛及液氮中備測，肉眼下放大鏡觀察結(jié)腸潰瘍及其糜爛情況。3）HE染色檢測各組UC大鼠結(jié)腸組織病理改變。具體步驟嚴(yán)格按說明操作，在光鏡下觀察標(biāo)本病理學(xué)改變并攝片。4）大鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)變化。采用H-7650透射電鏡檢測各組UC大鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡變化。5）結(jié)腸keap-1、Nrf2以及claudin-2蛋白表達(dá)。采用免疫組化檢測，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說明操作，由兩名病理專業(yè)人員采用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行圖像分析。以細(xì)胞呈棕褐色染色為陽性結(jié)果，對照組采用PBS代替一抗。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布資料采用單因素方差分析檢驗；若為非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗來比較兩組間差異。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 正常組同步生長，造模期間各組均未見大鼠死亡，自造模第2日起可見大鼠肛門污穢、有血便殘留、食欲下降，皮毛稀疏無光澤，體質(zhì)量無明顯下降。肉眼下用放大鏡觀察見距肛門8～12 cm處病變最為明顯，部分糜爛表面附著少許黃白苔，予標(biāo)記后送檢病理。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變 光鏡下見正常組結(jié)腸黏膜排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組見結(jié)腸黏膜表面出現(xiàn)缺損或脫落壞死，潰瘍形成，隱窩結(jié)構(gòu)消失、膿腫形成，固有層大量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜下層充血腫脹；西藥組見結(jié)腸黏膜不同程度缺損，潰瘍形成，隱窩膿腫，黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤；中藥各組見結(jié)腸黏膜尚完整，但存在黏膜缺損，隱窩膿腫，部分可見出血點，較多炎性細(xì)胞浸潤固有層。見圖1。

圖1 各組UC大鼠黏膜組織病理學(xué)改變（HE染色，10倍）

2.3 各組大鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡情況電鏡下見正常組結(jié)腸上皮細(xì)胞單層柱狀排列，微絨毛發(fā)達(dá)密集，整齊排列，未見細(xì)胞壞死和凋亡；模型組結(jié)腸上皮細(xì)胞微絨毛稀疏，線粒體腫脹變大，細(xì)胞間緊密連接消失，可見細(xì)胞處于壞死期；西藥組見上皮細(xì)胞單層柱狀排列，但排列欠整齊、線粒體腫脹、凋亡小體形成，局灶可見壞死；中藥各組見上皮細(xì)胞體積明顯變小、核固縮、凋亡小體形成，局灶可見壞死。見圖2。

圖2 各組UC大鼠電鏡下結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡（8 000倍）

2.4 各組大鼠結(jié)腸keap-1、Nrf2以及claudin-2蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組結(jié)腸Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)下降，claudin-2蛋白表達(dá)上升。與模型組比較，各給藥組Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)上升，claudin-2蛋白表達(dá)下降，但西藥組與模型組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），中藥各劑量組與模型組、西藥組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），中藥低、中、高劑量組之間不存在組間差異（P>0.05）。見圖3～圖5，表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜keap-1、Nrf2、claudin-2蛋白表達(dá)比較（IOD，±s）

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜keap-1、Nrf2、claudin-2蛋白表達(dá)比較（IOD，±s）

注：與模型組比較，*P<0.05；與西藥組比較，△P<0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 6 6 6 6 6 6 keap-1 6 543.92±834.83*3 352.83±833.96 3 907.27±718.01 5 412.21±622.25*△5 793.00±693.49*△5 864.43±793.03*△Nrf2 8 163.03±318.04*4 517.53±909.53 4 568.19±712.11 5 123.03±678.04*△6 578.62±634.39*△6 907.57±718.51*△claudin-2 3 352.83±633.96*8 533.08±659.29 8 413.49±617.34 6 426.86±818.79*△6 336.08±698.27*△6 123.49±578.24*△

圖3 各組UC大鼠結(jié)腸keap-1蛋白表達(dá)（10倍）

圖4 各組UC大鼠結(jié)腸Nrf2蛋白表達(dá)（10倍）

圖5 各組UC大鼠結(jié)腸claudin-2蛋白表達(dá)（10倍）

3 討論

本課題組在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，傳承全國名老中醫(yī)胡珂、謝建群、馬貴同等教授臨證經(jīng)驗，指出潰結(jié)當(dāng)以“脾虛為本，濕熱瘀毒為標(biāo)”為基本特點。脾虛無以運化水液，聚濕成痰，痰隨氣而升無處不致，日久阻塞經(jīng)絡(luò)，化為瘀血，痰瘀互結(jié)，損傷腸絡(luò)；而潰結(jié)之所以反復(fù)發(fā)作，其關(guān)鍵在于“濕”“熱”“瘀”之邪留于體內(nèi)，沒有得到徹底根除，每遇外感或內(nèi)傷的誘因而復(fù)發(fā)，如“邪氣或動或靜，其痢乍發(fā)乍止”，由此提出“健脾清熱活血”的基本大法。

基于“提高UC黏膜愈合質(zhì)量是減少UC復(fù)發(fā)關(guān)鍵所在”的理念［6-7］，本研究從氧化應(yīng)激介導(dǎo)炎癥持續(xù)角度出發(fā)，探討健脾清熱活血方介導(dǎo)keap-1-Nrf2通路調(diào)控claudin-2表達(dá)干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制研究。健脾清熱活血方主要由救必應(yīng)、馬齒莧、白術(shù)、白芍、水蛭、三七、炙甘草等藥物組成，以救必應(yīng)瀉火解毒、清熱利濕、行氣止痛、涼血止血，歸于大腸經(jīng)，直抵病所為君藥，馬齒莧、水蛭、三七活血化瘀、祛腐生新為臣，佐以白術(shù)健脾益胃、燥濕和中，芍藥甘草緩急止痛，全方共奏清熱活血、健脾和胃之功效。筆者通過組織病理學(xué)證實與模型組比較，治療組所見黏膜損傷程度較模型組有不同程度改善，部分可見出血點，較多炎性細(xì)胞浸潤固有層。表明健脾清熱活血方藥具有減少組織損傷、促進(jìn)修復(fù)黏膜、緩解潰結(jié)炎癥，防治潰瘍性結(jié)腸炎的效用。

反復(fù)炎癥刺激形成氧化應(yīng)激產(chǎn)生的線粒體內(nèi)的活性氧（ROS）爆發(fā)直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，是眾多疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)［8］。keap-1-Nrf2-ARE路徑是機(jī)體最主要的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)通路之一，參與機(jī)體炎癌轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及黏膜修復(fù)等多方面［9］。Nrf2屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，廣泛存在于機(jī)體多個組織器官中，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷結(jié)合蛋白1（keap 1）是Nrf2的重要受體，生理狀態(tài)下，Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)中，與keap 1結(jié)合，處于被抑制狀態(tài)，當(dāng)受到氧化應(yīng)激信號刺激后，Nrf2迅速與變構(gòu)的keap 1解耦連，以穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與小Maf蛋白結(jié)合形成異二聚物，并與一順式作用元件即抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，結(jié)合ARE上的GCTGAGTCA位點，參與下游一系列Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控。ARE是一個特異的DNA啟動子結(jié)合序列，位于所調(diào)控的抗氧化酶基因和Ⅱ相解毒酶基因的5′端啟動序列［10-11］。Claudin蛋白家族作為反映腸黏膜屏障最重要的生物標(biāo)記物，在維護(hù)腸黏膜屏障完整中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用［12］。claudin蛋白是構(gòu)成緊密連接復(fù)合體的主要骨架，不同的claudin分子對緊密連接的通透性有不同的影響。一部分claudin分子可以形成特異性離子通道而增加上皮、內(nèi)皮通透性，稱為“l(fā)eaking”claudin，包括claudin-2、claudin-10等［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組 keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)明顯下降，claudin-2蛋白表達(dá)上升，說明UC炎癥持續(xù)會導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化應(yīng)激水平下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)、超載，導(dǎo)致細(xì)胞壞死、損傷，加重炎癥的進(jìn)程，甚至異型增生。同時也反映腸上皮通透性增加，由此可能造成大量的抗原通過受損腸黏膜屏障滲入腸道內(nèi)，與食物抗原交互反應(yīng)而導(dǎo)致炎癥持續(xù)，導(dǎo)致靶器官受損。治療后，治療組keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)上升，claudin-2蛋白表達(dá)下降，說明健脾清熱活血方可能通過促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性的反應(yīng)性氧化應(yīng)激的清除而達(dá)到緩解炎癥的效用。

總的來說，本次研究初步證實健脾清熱活血方通過上調(diào)keap-1、Nrf2表達(dá)，下調(diào)claudin-2表達(dá)，修復(fù)黏膜屏障減少抗原刺激而發(fā)揮防治UC的效用。