齊 欣 路欣彤 - 林長(zhǎng)青 - 崔承弼, -,

(1. 延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133000；2. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；3. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，吉林 延吉 133000)

糖尿病已成為危害人類健康的隱形殺手，其病因主要是由于體內(nèi)胰島細(xì)胞受損不能正常分泌胰島素或體內(nèi)產(chǎn)生了胰島素抵抗，糖尿病的發(fā)生多會(huì)伴隨許多并發(fā)癥的產(chǎn)生，對(duì)身體各個(gè)器官均有不同程度損害。據(jù)報(bào)道[1]，在未來(lái)的10～20年中，全球糖尿病患者數(shù)量將達(dá)到現(xiàn)在的1.5～2.0倍，呈加速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。糖尿病分為4種類型，其中1型糖尿病和2型糖尿病患病人群居多，1型糖尿病是由于體內(nèi)胰島β細(xì)胞受損，不能正常分泌胰島素，導(dǎo)致胰島素和胰高血糖素比例失衡，使機(jī)體維持在較高的血糖水平的一種自身免疫性疾病[2]。

紫蘇[Perillafrutescens(L.) Britt.]為唇形目、唇形科、紫蘇屬一年生草本植物，其莖、葉、種子皆可入藥及食用。紫蘇葉的有效化學(xué)成分包括酚酸類[3]、類黃酮類[4]、揮發(fā)油等[5]，具有抗菌[6]、抗腫瘤[7]、抗炎癥[8]、抗氧化[9]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[10]、降血糖等多種功能[11]，可應(yīng)用于食用、藥用以及其他行業(yè)。

目前對(duì)于降血糖以及紫蘇的有效成分的研究頗多，但紫蘇降血糖方面的研究目前僅在細(xì)胞層面有過(guò)報(bào)道[12]，而紫蘇葉提取物的動(dòng)物降血糖方面研究還屬空白。試驗(yàn)擬以紫蘇葉為試驗(yàn)材料，研究其提取物對(duì)于1型糖尿病小鼠(T1DM)的降血糖作用，及對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響情況，旨在為紫蘇葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物：體重為20～30 g的清潔級(jí)雄性昆明種小鼠，延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。于適宜條件飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度25 ℃，濕度50%～70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。動(dòng)物試驗(yàn)得到了延邊大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試驗(yàn)材料與儀器

1.2.1 試驗(yàn)材料

紫蘇葉：市售；

鹽酸二甲雙胍片：北京萬(wàn)輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；

鏈脲佐菌素(STZ)：美國(guó)Sigma公司；

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、糖化血紅蛋白(GHb)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)試劑盒：江蘇南京建城生物工程研究所。

1.2.2 試驗(yàn)儀器

血糖儀：AG-605型，天津九安醫(yī)療電子股份有限公司；

電子天平：Scout SE-SE202F型，奧豪斯儀器常州有限公司；

酶標(biāo)儀：BK-EL10C型，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；

離心機(jī)：TG16A-WS型，上海盧湘儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS-24型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

臺(tái)式離心機(jī)：TDZ5-WS型，湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 紫蘇葉提取物的制備

將新鮮紫蘇葉烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩，稱取紫蘇葉粉末，按料液比1∶30 (g/mL)加入70%乙醇，60 ℃水浴1 h，3 000 r/min 離心10 min，提取3次，合并3次提取液，將提取液進(jìn)行抽濾，減壓蒸餾濃縮，凍干成粉，即為紫蘇葉提取物，4 ℃保存?zhèn)溆肹13]。

1.4 T1DM小鼠模型的建立

適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選取10只作為空白對(duì)照組，測(cè)定所有小鼠試驗(yàn)初始血糖值，另外40只以50 mg/kg·BW劑量進(jìn)行腹腔注射STZ，建立T1DM小鼠模型，STZ注射72 h后，隔夜禁食，進(jìn)行FBG的測(cè)定，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為FBG高于11.1 mmol/L。將造模成功小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。劑量參照預(yù)試驗(yàn)中摸索的劑量進(jìn)行設(shè)定。造模2周后對(duì)小鼠進(jìn)行為期4周的灌胃，每周記錄所有小鼠的體重和FBG。組別和灌胃物如表1所示。

表1 試驗(yàn)分組及灌胃物

1.5 糖尿病小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 體重和空腹血糖值(FBG) 體重采用稱重法，F(xiàn)BG的測(cè)定，對(duì)小鼠禁食8 d，禁食不禁水，取尾靜脈血進(jìn)行測(cè)定。

1.5.2 糖耐量水平(OGTT) 在最后一次給藥后，隔夜禁食，灌胃濃度為100 mg/mL葡萄糖，每10 g體重灌胃0.1 mL葡萄糖，分別在灌胃后0，30，60，90 min時(shí)測(cè)定小鼠血糖水平并記錄。

1.6 糖尿病小鼠血清基礎(chǔ)指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 TG和TC 取血清，依次按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入蒸餾水、校準(zhǔn)品、樣本、工作液，混勻后，37 ℃孵育10 min，于510 nm處測(cè)定各孔吸光值并記錄。

1.6.2 GHb、SOD、CAT和MDA 按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法進(jìn)行組間比較。P<0.05表示具有顯著性差異，P>0.05表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)T1DM小鼠體重和FBG的影響

由圖1可知，試驗(yàn)組中T1DM小鼠的體重均顯著低于正常組(P<0.05)，經(jīng)紫蘇葉提取物治療后的T1DM小鼠可以有效緩解體重下降，并接近陽(yáng)性組。灌胃4周后，經(jīng)紫蘇葉提取物治療后的T1DM小鼠的FBG較模型組比較顯著降低(P<0.05)。已有研究[12]指出，紫蘇葉提取物在細(xì)胞層面顯示出降血糖活性。試驗(yàn)中，經(jīng)紫蘇葉提取物不同劑量組治療后能夠緩解體重的下降，降低T1DM小鼠的FBG，且與陽(yáng)性藥物二甲雙胍組有相似的治療效果，說(shuō)明紫蘇葉提取物可以有效治療T1DM小鼠。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

2.2 對(duì)T1DM小鼠OGTT水平的影響

由圖2可知，試驗(yàn)組灌胃葡萄糖后0，30，60，90 min時(shí)小鼠的血糖水平均顯著高于正常組(P<0.05)，經(jīng)紫蘇葉提取物處理的小鼠血糖水平在30 min后低于模型組，且高劑量組最為顯著，與陽(yáng)性組顯示出有相似的治療效果。灌胃葡萄糖30 min后，血糖升高到一定值，經(jīng)紫蘇葉提取物治療后的T1DM小鼠對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力有所升高，因此在60，90，120 min時(shí)血糖值下降得較為顯著。由此可知，紫蘇葉提取物能夠調(diào)節(jié)T1DM小鼠的OGTT水平。

2.3 對(duì)T1DM小鼠攝食量、飲水量、食物效價(jià)的影響

由圖3可知，模型組小鼠攝食量和飲水量均顯著高于正常組(P<0.05)，經(jīng)紫蘇葉提取物治療后的T1DM小鼠攝食量和飲水量均顯著低于模型組(P<0.05)，模型組T1DM小鼠食物效價(jià)極顯著低于正常組(P<0.01)，經(jīng)紫蘇葉提取物治療后的T1DM小鼠食物效價(jià)顯著高于模型組(P<0.05)。這可能是由于經(jīng)紫蘇葉提取物治療后，小鼠糖尿病“三多一少”的癥狀得以改善，對(duì)食物的消化吸收程度有所提高。說(shuō)明紫蘇葉提取物能夠有效地改善小鼠食物效價(jià)。在其他研究[14]中顯示經(jīng)紫蘇葉多糖治療后，與正常組比較，模型組小鼠行動(dòng)遲緩，飼料消耗量和飲水量增多，體質(zhì)量顯著增加，與試驗(yàn)結(jié)果一致。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

2.4 對(duì)T1DM小鼠臟器系數(shù)的影響

由表2可知，所有組別之間小鼠脾臟臟器系數(shù)不存在顯著性差異，而模型組心、肝、腎的臟器系數(shù)均顯著高于正常組(P<0.05)，試驗(yàn)組經(jīng)紫蘇葉提取物治療后的心、肝、腎的臟器系數(shù)顯著下降(P<0.05)，且高劑量組效果更好。糖尿病會(huì)引發(fā)肝腎腫大，而經(jīng)治療后會(huì)有效改善肝腎腫大的情況。孫廣平等[15]表明紫蘇葉多糖能夠改善2型糖尿病大鼠肝損傷的情況，對(duì)肝臟有保護(hù)作用。由此可見(jiàn)，紫蘇葉提取物能夠改善T1DM小鼠臟器系數(shù)，減少糖尿病對(duì)臟器的損傷。這與程琳杰等[16]的研究結(jié)果一致，該研究證實(shí)了茉莉紫蘇復(fù)合濃縮液對(duì)高血糖引起的臟器損傷具有一定的保護(hù)作用。

2.5 對(duì)T1DM小鼠血清中TC、TG水平的影響

由圖4可知，正常組小鼠的TC、TG水平在4.80，0.65 mmol/L，模型組小鼠TC、TG水平顯著升高(P<0.05)，紫蘇葉提取物高劑量組TC、TG值降低到5.70，0.92 mmol/L，與陽(yáng)性組有相似的治療效果。T1DM小鼠出現(xiàn)異常脂代謝情況會(huì)使血清中TC、TG濃度增加，其原因可能是T1DM小鼠機(jī)體內(nèi)胰島β細(xì)胞被破壞，不能正常分泌胰島素，導(dǎo)致體內(nèi)對(duì)葡萄糖的吸收轉(zhuǎn)化失調(diào)，使脂肪分解成大量的游離脂肪酸(FFA)，組織吸收脂肪酸的能力降低，無(wú)法通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸運(yùn)送到組織當(dāng)中，F(xiàn)FA大量釋放到血液和肝臟中，導(dǎo)致血清中TC、TG含量增多。試驗(yàn)中，經(jīng)紫蘇葉提取物治療后T1DM小鼠體內(nèi)TC、TG的水平得到了明顯改善，說(shuō)明紫蘇葉提取物具有改善T1DM小鼠體內(nèi)TC、TG的作用。

2.6 對(duì)T1DM小鼠血清中GHb、SOD、CAT和MDA水平的影響

糖化血紅蛋白是人體血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物，血糖測(cè)試結(jié)果反映的是即刻的血糖水平，而糖化血紅蛋白測(cè)試通?？梢苑从郴颊呓?～12周的血糖控制情況。SOD是氧自由基的自然天敵，是機(jī)體內(nèi)氧自由基的頭號(hào)殺手，CAT的主要作用就是催化H2O2分解為H2O與O2，使得H2O2不致于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成—OH，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為丙二醛，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。因此，機(jī)體內(nèi)SOD、CAT以及MDA的水平能夠反映出機(jī)體內(nèi)氧化損傷程度。由圖5可知，正常對(duì)照組的小鼠每10 g血紅蛋白吸光度為20.2，模型組中糖化血紅蛋白含量顯著增加，經(jīng)紫蘇葉提取物治療后能夠顯著降低其水平(P<0.05)，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中的SOD、CAT水平顯著降低(P<0.05)，經(jīng)紫蘇葉提取物治療后能夠提高SOD和CAT水平，而模型組小鼠的MDA水平達(dá)到15.8 nmol/mL，顯著高于正常組(P<0.05)，經(jīng)紫蘇葉提取物治療后可降低其水平。紫蘇葉提取物作用于體內(nèi)后，能夠提高體內(nèi)清除代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)的能力，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生。說(shuō)明紫蘇葉提取物能夠改善T1DM小鼠體內(nèi)GHb、SOD、CAT和MDA的水平。在閆爽等[17]的研究中也證實(shí)了經(jīng)治療后的糖尿病大鼠體內(nèi)各種氧化酶的水平會(huì)有所改善，與試驗(yàn)結(jié)果一致。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

表2 紫蘇葉提取物對(duì)T1DM小鼠臟器系數(shù)的影響?

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

3 結(jié)論

紫蘇葉提取物能夠改善T1DM小鼠體內(nèi)糖尿病相關(guān)指標(biāo)的水平，在動(dòng)物水平具有顯著的降血糖作用。但該試驗(yàn)僅對(duì)紫蘇葉粗提物以及T1DM小鼠的基礎(chǔ)指標(biāo)進(jìn)行了研究，后續(xù)將分離紫蘇葉單體，明確起降血糖作用的主要活性成分，并對(duì)其在酶活性以及細(xì)胞水平對(duì)其降血糖作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入探討。