胡夢圓，付麗云，3

1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（寧波315211）；2.中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院肝病科（寧波315020）；3.浙江省消化系統(tǒng)腫瘤診治及研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（寧波 315020）

1990年至2015年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大病因，位居惡性腫瘤發(fā)生率第六位[1]。2019 年公布的我國最新惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析結(jié)果顯示：原發(fā)性肝癌是我國第四位高發(fā)惡性腫瘤，2015 年原發(fā)性肝癌發(fā)病率和死亡率分別為26.92/10萬和23.72/10萬，位居腫瘤致死病因第二位[2]。肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要病理類型，占比約85%～90%[3]。在本篇文章中，肝癌主要指的是HCC這一病理類型。據(jù)統(tǒng)計(jì)，男性HCC 發(fā)病率高于女性，約為3∶1[3]。對于HCC 高危人群的定期篩查，有助于HCC的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，是提高HCC 治療療效、提升生存率的關(guān)鍵。一項(xiàng)納入47項(xiàng)研究、包含15 158 例患者的Meta 分析顯示：在肝硬化人群中，定期篩查可使早期HCC 的診斷率、HCC 的治愈率和生存率分別提升2 倍以上[4]。因此，HCC 的早篩顯得尤為重要。

目前，組學(xué)研究已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中常用的技術(shù)手段，組學(xué)包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和微生物組學(xué)等，是研究基因的表達(dá)和功能、遺傳產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物等的學(xué)科。通過組學(xué)技術(shù)可以將生物體內(nèi)所有的某分子類型（基因/蛋白質(zhì)/轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物/代謝產(chǎn)物等）作為對象進(jìn)行研究，并建立相應(yīng)數(shù)據(jù)庫。也可以篩查疾病表達(dá)差異分子，進(jìn)一步研究其與臨床病理特征的聯(lián)系，如篩選出HCC癌組織與癌旁組織的差異表達(dá)分子[5]。本綜述結(jié)合最新研究，主要闡述基因組（genomics）、轉(zhuǎn)錄組（transcriptomics）、蛋白質(zhì)組（proteomics）、代謝組（metabolomics）和微生物組（microbiomes）在HCC 中的研究進(jìn)展和在早期診斷中的運(yùn)用價(jià)值。

1 基因組學(xué)

基因組學(xué)是一門研究生物體所有遺傳物質(zhì)的科學(xué)，針對單個個體或一類生物體所有基因進(jìn)行分析和量化，同時研究相互關(guān)系及其對生物體的影響[6]。在癌癥研究中，基因組學(xué)旨在通過發(fā)現(xiàn)和靶向與癌癥相關(guān)的基因改變從而推進(jìn)腫瘤個體化治療[7]。

基因組學(xué)應(yīng)用的技術(shù)有：二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS），又稱高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing），包括全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）[8]、全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）[9]、RNA 測序（RNA-SEQ）[10-11]、靶向深度測序（targeted deep sequencing）[8]等，并且仍在不斷擴(kuò)展新的技術(shù)，這些技術(shù)通過提供更高的效率和更低的成本推動了科學(xué)研究的進(jìn)展。

WGS 提供了最全面的基因組信息和相關(guān)生物學(xué)意義，正在成為NGS 中使用最廣泛的應(yīng)用之一[12]。WES 和靶向測序，通過限制所用基因組材料的大小，可以在一次測序運(yùn)行中對更多個體樣本進(jìn)行測序，從而增加基因組研究的廣度和深度[12]。NGS還提供了洞察基因組調(diào)控機(jī)制的技術(shù)基礎(chǔ)，比如蛋白質(zhì)-DNA 相互作用可以通過免疫共沉淀富集與蛋白質(zhì)相互作用的DNA 片段來探測[12]。

在HCC 的研究中，基于二代測序技術(shù)，以及不斷擴(kuò)充的各項(xiàng)數(shù)據(jù)庫，包括癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）計(jì)劃和GEO（gene ex?pression omnibus）數(shù)據(jù)庫等[13]，發(fā)現(xiàn)了多個突變基因，其中，TP53 和CTNNB1 是高頻突變的基因[8，14-15]。另外，也發(fā)現(xiàn)10 多個基因發(fā)生突變，包括AX?IN1、RB1、KEAP1、ARID2、ARID1A、RPS6KA3、APOB、CDKN2A、LRP1B、PTEN、ALB、BRD7、RPL22等[8，16-18]。

基于測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，針對不同變量的更有針對性的基因測序也在不斷開展。近來，針對病因以及流行病學(xué)特征開展了一系列基因組學(xué)研究。流行病學(xué)調(diào)查顯示，肝癌最常見的危險(xiǎn)因素是慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染和飲食中暴露于黃曲霉毒素B1[14]，同時還發(fā)現(xiàn)，男性比女性更易患HCC[14]，蒙古族人是世界上HCC發(fā)病率最高的人群之一[15]。針對這些因素，研究的結(jié)果如下：HBV相關(guān)的HCC：多項(xiàng)組學(xué)研究的開展發(fā)現(xiàn)了包括端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）在內(nèi)的癌癥相關(guān)基因CCNE1 和MML4 是HCC 中HBV整合的重要靶基因[5，19-21]。TERT 啟動子突變在腫瘤的發(fā)生中起到重要作用（見于60%的肝癌）[21]。此外，由于很大比例的HBV相關(guān)HCC不包含任何已知癌癥相關(guān)基因的整合，因此提出了另外兩種機(jī)制：誘導(dǎo)基因組、染色體不穩(wěn)定性和突變HBV 蛋白的產(chǎn)生、持續(xù)表達(dá)[22]。另外Péneau 等研究發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤肝組織相比，在腫瘤肝組織中發(fā)現(xiàn)了更多的克隆性HBV 整合，這與2012年的發(fā)現(xiàn)一致[10，23]。最新研究顯示，HBV 病毒增強(qiáng)子可誘導(dǎo)癌基因的過表達(dá)，值得關(guān)注的是，HBV 整合位點(diǎn)基因重排也可能導(dǎo)致癌癥驅(qū)動基因的拷貝數(shù)改變，HBV 整合的數(shù)量是HBV 相關(guān)HCC 的獨(dú)立預(yù)后因素[10]。黃曲霉毒素相關(guān)的HCC：黃曲霉毒素相關(guān)的HCC 中除了先前報(bào)道的常見突變（TP53）外[8]，還發(fā)現(xiàn)黏附G蛋白偶聯(lián)受體B1基因（adhesion G protein-coupled receptor B1，ADGRB1）高頻突變，與腫瘤組織毛細(xì)血管密度增加和程序性死亡因子配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的表達(dá)相關(guān)。值得注意的是，在來自中國的肝癌病例中，9.8%含有黃曲霉毒素相關(guān)的遺傳特征，與其他含有這些遺傳特征的地區(qū)相比肝癌比例要偏大。這些發(fā)現(xiàn)可能被用來識別因接觸黃曲霉毒素而患肝癌的患者[24]。地區(qū)相關(guān)的HCC：蒙古族人的基因圖譜展示了除常見突變（TP53、CTNNB1）外獨(dú)特的驅(qū)動突變，包括GTF2IRD2B、PNRC2 和SPTA1，其中GTF2IRD2B最為顯著[15]。

依據(jù)越來越多的基于流行病學(xué)背景的基因圖譜描繪以及隨著新技術(shù)的更新以及檢測成本的下降，未來也許可以做到對有高危因素的人群進(jìn)行基因組的篩查，從而有助于HCC的早期診斷。

雖然全基因組和全外顯子組測序逐漸描繪出HCC 的基因組，但基因改變是如何驅(qū)動癌癥表型，目前在很大程度上還不清楚。而接下來介紹的其他組學(xué)，也將和基因組學(xué)共同研究，為揭示HCC 的分子分型和協(xié)助診斷提供幫助。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，即研究各種RNA，是基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的橋梁[11-12]。RNA-seq，是隨著高通量測序技術(shù)而發(fā)展起來的一種轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，可對差異基因表達(dá)和mRNA 差異剪接進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，可用于研究RNA（包括mRNA，非編碼RNA（non-cod?ing RNA，ncRNA）等）生物學(xué)的各個層面，包括單細(xì)胞基因表達(dá)、翻譯和RNA 結(jié)構(gòu)[11]。在RNA-Seq基礎(chǔ)上，微陣列技術(shù)（microarray）、批量RNA 測序（bulk RNA-sequencing）、單細(xì)胞RNA 測序（sin?gle-cell RNA sequencing，scRNA-seq）、小RNA測序（small RNA sequencing，sRNA-seq）、基因表達(dá)芯片（gene expression arrays）等[24-26]為RNA 研究提供了技術(shù)支持，孕育出了多個類別的候選標(biāo)志物。一般研究思路是，首先通過表達(dá)圖譜和生物信息學(xué)分析，篩選出候選生物標(biāo)志物，再通過進(jìn)一步分子、細(xì)胞、動物等多層面的實(shí)驗(yàn)，研究這些候選分子的表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系，以及摸索它們在某一通路中的角色，增加作為潛在的HCC診斷標(biāo)記物的可行性及尋找治療靶標(biāo)等。

2.1 微小RNA（microRNA，miRNA）

miRNA 是非編碼RNA 中的一種，許多研究評估了miRNA 能否作為診斷HCC 的潛在生物標(biāo)志物。比如miR-21 和miR-199[26-27]已被多次驗(yàn)證是肝癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。一項(xiàng)Meta分析表明，4 個miRNAs（miR-20a-5p、miR-320a、miR-324-3p 和miR-375）可以作為HCC 早期診斷生物標(biāo)志物[28]。另外，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-375，miR-10a，miR-122和miR-423在HCC組中顯著高于對照組（P ＜0.0 001），并且4-miRNA 組合下的受試者工作特征曲線下面積（AUC）可達(dá)到0.995[29]。

2.2 長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）

lncRNA參與HCC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡等，在肝癌診斷中具有較好的作用。如，來源于組織、血漿和唾液中的lnc-PCDH9-13：1和來源于血清的lncRNA-UCA1 和 ln?cRNA-WRAP53可以作為診斷HCC潛在的生物標(biāo)志物。后兩者與AFP 結(jié)合可以達(dá)到100%的靈敏度[30-31]。由于許多候選早篩標(biāo)志物lncRNA 在非HCC情況下也會有異常表達(dá)，有研究表明lncRNA 與AFP等其他分子聯(lián)合診斷效果更佳[32]。

2.3 環(huán)狀RNA（circular RNA，cirRNA）

cirRNA是ncRNA的新成員，同樣參與HCC的產(chǎn)生和發(fā)展，由于它的不易被核酸外切酶降解的穩(wěn)定性提示了它有潛力成為早期篩查的標(biāo)志物[33]。如circRNA-100338、circRNA SMARCA5、hsa_circ_00156、hsa_circ_000224、hsa_circ_000520、hsa_circ_0028502 和hsa_circ_ 0076251 等有潛在的預(yù)后和診斷價(jià)值[34-37]。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)主要運(yùn)用雙向凝膠電泳、色譜與質(zhì)譜技術(shù)，研究組織、體液等來源的蛋白質(zhì)水平、翻譯后修飾等，能夠?qū)⒒蛐团c癌癥表型聯(lián)系起來。其中，磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)是兩種有效的功能蛋白質(zhì)組學(xué)方法，可用于挖掘生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)、癌癥發(fā)展機(jī)制、耐藥機(jī)制等[7，38-39]。

蛋白質(zhì)位于轉(zhuǎn)錄下游，可以直接反應(yīng)細(xì)胞的活動，并且研究發(fā)現(xiàn)，在所有組織中，肝臟分泌的蛋白質(zhì)數(shù)量最多[40]，這使得蛋白組學(xué)在HCC中具有較大的價(jià)值。

國內(nèi)樊嘉院士團(tuán)隊(duì)首次利用159 例HBV 相關(guān)HCC 患者的成對腫瘤和鄰近肝組織進(jìn)行蛋白質(zhì)基因組學(xué)表征。發(fā)現(xiàn)兩個預(yù)后生物標(biāo)志物PYCR2 和ADH1A；同時發(fā)現(xiàn)了CTNNB1和TP53突變相關(guān)的信號傳導(dǎo)和代謝特征，其中突變的CTNNB1相關(guān)的醛酸磷酸化被證實(shí)可促進(jìn)糖酵解和細(xì)胞增殖。該研究提供了一個有價(jià)值的資源，極大地?cái)U(kuò)展了HBV相關(guān)HCC的知識，同時也擴(kuò)展了挖掘早期診斷標(biāo)志物的思路[18]。

一項(xiàng)前瞻性多中心橫斷面研究，采用毛細(xì)管電泳質(zhì)譜（capillary electrophoresis-mass spectrum，CE-MS）技術(shù)檢測HCC 患者的尿蛋白組學(xué)特征。鑒定了31個肝癌特異性多肽標(biāo)志物，并進(jìn)一步整合到多變量分類模型中。該多肽模型對HCC診斷的敏感度和特異度分別為79.5%和85.1%[38]。這項(xiàng)研究說明了該尿多肽有望成為HCC早期診斷標(biāo)志物。

4 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)是研究生物個體在置身于某特定環(huán)境下所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物集合的科學(xué)。代謝物質(zhì)的起源來自于上游的基因組，能夠與蛋白質(zhì)組一起直觀且動態(tài)地反應(yīng)細(xì)胞的生理病理狀態(tài)，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)之后的又一新方向，是以上組學(xué)的補(bǔ)充[41-42]。

對來自KEGG新陳代謝數(shù)據(jù)庫中注冊的1 434個基因的蛋白質(zhì)在32個組織中進(jìn)行了量化，發(fā)現(xiàn)肝臟富含的代謝蛋白最多，并且大多數(shù)代謝途徑都在肝臟中富集[40]。另外，肝功能下降被認(rèn)為是肝癌發(fā)展的早期事件，因此很可能在血液中觀察到各種代謝紊亂[43]。當(dāng)HCC 中的癌細(xì)胞發(fā)生不可控制的增殖時，肝臟代謝可發(fā)生復(fù)雜的適應(yīng)性改變，這為找到潛在診斷生物標(biāo)志物提供了新思路。

Luo等[44]通過多中心大樣本研究發(fā)現(xiàn)血清代謝生物標(biāo)志物組合，包括苯丙氨酰-色氨酸和甘膽酸，對HCC高危人群的早期診斷具有良好的診斷性能。運(yùn)用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，Lu 等[45]發(fā)現(xiàn)了Pep（36∶4）和Pep（40∶6）可以作為HCC 診斷的潛在血清生物標(biāo)志物。國內(nèi)一研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)了甘膽酸、2-脫氧栗甾酮、脫氧膽酸甘氨酸偶聯(lián)物和?；悄懰崾菨撛谠缙谂R床診斷標(biāo)志物[46]。基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，一個前瞻性隊(duì)列研究觀察了HCC診斷前的代謝紊亂[43]，確定了與HCC 風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的92 種代謝物的循環(huán)水平變化，其中14 種具有高可信度，其中一些觀察了長達(dá)10 年。14 種代謝物包括：N1-乙酰亞精胺、靛紅、對羥基苯乳酸、酪氨酸、鞘氨醇、L-環(huán)（亮氨酰脯氨酰）、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸和7-甲基鳥嘌呤，與HCC風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)；視黃醇、硫酸脫氫表雄酮、甘油磷酸膽堿、γ-羧乙基羥色胺和肌酸，與HCC風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。Liu等[47]對來自門靜脈血的代謝物的變化進(jìn)行了代謝組譜分析，發(fā)現(xiàn)肝癌患者中的DL-3-苯乳酸、L-色氨酸、甘膽酸和1-甲基煙酰胺的代謝物水平的表達(dá)升高，提示了肝功能損害和生存不良。

5 微生物組學(xué)

人腸道中有多達(dá)100 萬億個微生物，尤其結(jié)腸具有最高密度的微生物[48]。肝臟有一個獨(dú)特的門靜脈血管系統(tǒng)，該系統(tǒng)接收來自腸道的代謝物并直接輸送到肝臟，另外，還存在膽汁酸的腸-肝循環(huán)[49]。因此，來源于腸道的微生物結(jié)構(gòu)的變化可能通過改變代謝物結(jié)構(gòu)成分和代謝物共同來影響HCC 的發(fā)生發(fā)展[47]。肝臟疾病中的微生物組學(xué)研究主要以腸道為背景。腸道微生物組學(xué)為尋找HCC非侵入性生物標(biāo)志物提供了新的思路。

微生物組學(xué)使用了元基因組學(xué)中的研究方法和技術(shù)，來測定樣品中所包含的全部微生物的遺傳物質(zhì)及群落功能，并研究其與代謝物之間的關(guān)系。一般思路是，用二代測序技術(shù)和生物信息學(xué)工具檢測樣品中提取的DNA 并與微生物基因組的參考數(shù)據(jù)庫比對，確定細(xì)菌分類組成，再通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的補(bǔ)充，深入研究微生物組的功能[50-51]。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物在免疫、炎癥反應(yīng)以及肝癌發(fā)展中具有關(guān)鍵作用[52-53]。Behary等[53]發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪性肝病相關(guān)HCC 的腸道微生物具有獨(dú)特的微生物群和代謝組特征，可以調(diào)節(jié)外周免疫反應(yīng)。Ponziani 等[54]觀察到與炎癥指標(biāo)相關(guān)的鈣保護(hù)素可能受到阿克曼桿菌和雙歧桿菌豐度的影響，這兩種細(xì)菌可能通過降低腸道和肝臟的炎癥反應(yīng)，影響HCC 的發(fā)生和進(jìn)展。也發(fā)現(xiàn)了與非HCC 的肝硬化患者相比，HCC 組的類桿菌屬和疣微菌科增加。

成人的微生物群結(jié)構(gòu)具有特異性，但最近的研究表明不同地區(qū)的HCC患者雖然微生物結(jié)構(gòu)不同，但HCC中的微生物失調(diào)可能存在普遍性，提示了微生物標(biāo)志物作為早期篩查標(biāo)志物的可能性[52，55]。任志剛等應(yīng)用16S rRNA 測序等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一種HCC 微生物操作分類單元（operational taxonomy units，OTUs）標(biāo)志物診斷模型，來自微生物篩選基因的30個OTUS標(biāo)志物被選為最優(yōu)標(biāo)志物集，在識別早期HCC中的AUC為80.64%，并成功地實(shí)現(xiàn)了國內(nèi)西北和華中地區(qū)HCC的跨區(qū)域驗(yàn)證，這項(xiàng)研究說明了腸道微生物標(biāo)志物可以作為HCC 早期診斷的非侵入性潛在工具[52]。然而腸道微生物受到的影響因素很多，不僅來自宿主，還會受環(huán)境、飲食等的影響[56-57]，因此仍需大量研究來完善微生物與人體腸道構(gòu)成的微生態(tài)組網(wǎng)絡(luò)。

6 展望

基因型與表型的關(guān)系一直是生命科學(xué)中至關(guān)重要的，是破譯生命科學(xué)奧秘的鑰匙。對于單基因性狀，可以很容易地理解基因型與表型的關(guān)系。然而大多數(shù)表型特征涉及多基因產(chǎn)物[41]，若是放到整個人體中，基因與表型則會形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。組學(xué)提供了一種研究技術(shù)和方法，篩選出差異基因，再去驗(yàn)證它與表型是否存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)，再通過后續(xù)的功能學(xué)研究進(jìn)行“基因到表型”的探索，為靶向治療和預(yù)后提供強(qiáng)大支撐。再通過多組學(xué)的整合，有希望繪制出HCC 發(fā)生發(fā)展中，從基因到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從翻譯產(chǎn)物到直接反應(yīng)機(jī)體狀態(tài)的代謝產(chǎn)物，再到與微生物交互作用反應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制全景，最終應(yīng)用到包括早期診斷在內(nèi)的多個肝癌研究領(lǐng)域。

多組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的候選早篩生物標(biāo)志物距離高特異性、高敏感性、可重復(fù)性、低成本性的理想腫瘤標(biāo)志物相差很遠(yuǎn)[58]。未來的挑戰(zhàn)包括大規(guī)模臨床樣本的驗(yàn)證研究，技術(shù)方法的標(biāo)準(zhǔn)化和新技術(shù)的開發(fā)，分析算法的標(biāo)準(zhǔn)化和進(jìn)一步發(fā)展，以及大規(guī)模的合作等。