羅佳煜 宋小雙 鄧勛 宋倩 王俊凱 王子卓 宋瑞清

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040) (黑龍江省森林保護研究所) (東北林業(yè)大學)

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)是歐洲赤松的一種地理品種，自然分布在中國大興安嶺山區(qū)、中國呼倫貝爾沙質(zhì)平原紅花爾基、俄羅斯和蒙古部分地區(qū)，具有耐寒、耐旱、適應性強、生長快等特點。它是目前我國“三北防護林計劃”和“治沙工程”中使用的主要針葉樹種，在生態(tài)建設和環(huán)境恢復中發(fā)揮著重要作用。

林業(yè)苗圃生產(chǎn)中，化學肥料和農(nóng)藥的大量使用掩蓋甚至阻礙了土壤微生物對植物營養(yǎng)的影響和貢獻，造成植物根際土壤微生物多樣性降低，功能單一化，減少使用化學農(nóng)藥和肥料，強調(diào)根際微生物對植物的促生抗逆作用，多使用微生物菌肥的，對于保障農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展意義重大[1]。植物根際是植物與土壤環(huán)境互作的界面，大量的微生物生活在植物根際區(qū)域，它們的生長會受到植物根系分泌物的影響[2]。植物根際微生物組群體高度復雜，被認為是植物的“第二基因組”，其中細菌的數(shù)量和種類最為豐富[3-4]。植物根際微生物能夠很大程度的影響植物生長，并且在抵抗病原物對植物的侵染方面具有重要作用。當植物受到病原物侵襲時，植物可以從土壤中募集具有拮抗作用的微生物[5]。1978年，美國奧本大學Kloepper首次提出Plant Growth-Promoting Rhizobacteria(PGPR)的概念：定殖于植物根際，能夠促進植物生長的一類細菌[6]。目前，研究較為廣泛的包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)等[7]。PGPR可通過固氮、溶磷、產(chǎn)生鐵載體及分泌植物激素等作用機制促進植物生長，如在減少肥料施用量的條件下，解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefacuens)和短小芽孢桿菌(B.pumilus)能夠促進番茄的生長及對N素的吸收[8]。韋建玉[9]等得出施加微生物菌肥可提高植物土壤基本養(yǎng)分含量，改善物理性狀，增加微生物量，對種子的育苗或種植都有促進作用[10]。本研究通過接種不同PGPR菌株，測定樟子松1年生苗生物量、營養(yǎng)指標，土壤理化性質(zhì)和酶活性的質(zhì)量濃度，分析研究PGPR菌株對樟子松1年生生長及土壤理化指標的影響，為植物PGPR菌肥改善土壤環(huán)境、促進苗木生長、降低病害發(fā)生，以“菌化苗”形式在后續(xù)造林中提高苗木成活率提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樟子松根際土壤樣品采集及細菌分離

樟子松根際土壤樣品采自東北林業(yè)大學哈爾濱實驗林場樟子松1年生苗，挖出根系后，采用抖土法獲得根際土樣品，過60目篩后冰箱4 ℃保存。細菌分離采用梯度稀釋法，將樟子松根際土壤梯度稀釋液分別涂布于TYG、TSB、YEM、M408、M715以及TWYE6種不同培養(yǎng)基平板，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，挑取不同形態(tài)的菌落，進行劃線純化，將獲得的根際細菌保存到R2A液體培養(yǎng)基中，放置于冰箱中4 ℃保存。

1.2 樟子松根際促生細菌篩選

樟子松根際IAA產(chǎn)生菌采用Salkowski比色劑定性篩選，采用IAA標準曲線法進行定量篩選，產(chǎn)鐵載體菌株采用CAS平板法定性篩選，解磷細菌采用NBRIP培養(yǎng)基定性篩選，鉬銻抗比色法定量篩選[11]。

1.3 根際促生細菌16SrRNA基因測序

將分離純化的細菌接種于1 mL LB培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h后12 000 r·min-1離心5 min后，去掉上清液，加入PCR體系：10×擴增緩沖溶液5.0 μL，d NTP引物1 μL，上下游引物(10～20 pmol)各2 μL，Taq DNA聚合酶(10 U/μL)1 μL，加超純水至50 μL。采用細菌16S rRNA基因通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行16S rRNA基因的PCR擴增。PCR反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到PCR擴增產(chǎn)物，樣品送上海美吉生物進行測序分析。

1.4 根際促生細菌對樟子松1年生苗的接種效應

1.4.1 PGPR接種菌劑制備

將-20 ℃保存的前期試驗篩選得到PGPR菌株劃線接種到牛肉膏蛋白胨(NB)固體培養(yǎng)基上，30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)72 h后，挑取單菌落接種到牛肉膏蛋白胨(NB)液體培養(yǎng)基中(28 ℃，180 r·min-1)振蕩培養(yǎng)48 h后，4 ℃條件下8 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液后無菌水沖洗3次，接種前調(diào)整終濃度OD600吸光度為0.6。

1.4.2 樟子松育苗

V(草炭土)∶V(蛭石)∶V(河沙)=2∶1∶1混合配制成育苗基質(zhì)土壤，121 ℃下高溫高壓滅菌2 h，裝入營養(yǎng)缽(15 cm×13 cm)中室溫放置7 d后進行播種[12]。樟子松種子催芽后播入營養(yǎng)缽中，每缽播30粒種子，置于東北林業(yè)大學實驗林場溫室中培養(yǎng)，幼苗出土后，每缽定苗至15株。進行常規(guī)的日常管護[13]。

1.4.3 接種試驗設計

樟子松出苗14 d后進行接種，共2個接種方式：1)CK為PD培養(yǎng)基作為對照；2)單接種PGPR菌株；采取打孔灌根方式接種，每盆PGPR菌株菌劑、PD培養(yǎng)基50 mL(即每盆打直徑10 mm、深5 cm的5個小孔，注入菌劑)。共7個處理，每個處理20次重復(即每個處理20盆300株樟子松1年生苗)，共140盆，接種完成后在溫室中正常管護。

1.4.4 樟子松1年生苗取樣

植物取樣：接種處理90 d，苗木渡過生長期后取樣植物，用于測定指標。每個處理隨機取1年生苗100株，用無菌水清洗根際，濾紙吸干后用于指標測定。

根際土取樣：每處理采集樟子松苗的同時，輕輕抖動根際土收集于無菌樣品袋中，過2 mm篩后放入裝有冰袋的保溫箱中帶回實驗室，用于測定土壤養(yǎng)分指標的風干后常溫保存；測定土壤酶指標的土壤在冰箱4 ℃保存。

1.4.5 植物生長指標測定

1)生物量指標：分別測定1年生苗的苗高、地徑、地上部分及地下部分鮮質(zhì)量，干燥箱85 ℃烘干后測定地上部分及地下部分干質(zhì)量。

2)苗木養(yǎng)分指標：樟子松1年生苗烘干后分為根、莖、葉3部分，研磨成粉狀用于測定植物營養(yǎng)成分，包括全氮、全磷、全鉀、有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)。全氮(TN)測定采用凱氏定氮儀(K9840)；全磷(TP)的測定采用Mo-Sb比色法；全鉀(TK)采用火焰光度計法測定；有機質(zhì)(OM)測定采用重鉻酸鉀外加熱法測定[21]。

1.4.6 土壤指標測定

1)土壤酶活性測定：采用南京建成生物土壤酶測定試劑盒，按照說明書測定土壤酸性磷酸酶活性、過氧化氫酶活性、蔗糖酶活性及脲酶活性含量。

2)土壤養(yǎng)分指標：全氮(TN)的測定采用凱氏定氮法；速效氮(AN)用堿性水解法測定；全磷(TP)的測定采用Mo-Sb比色法；速效磷(AP)的測定采用雙酸浸出的鉬銻抗比色法；總鉀(TK)的測定采用火焰光度計；速效鉀(AK)的測定采用乙酸銨(CH3COONH4)浸提劑火焰光度計；用重鉻酸鉀氧化加熱法測定有機質(zhì)(OM)。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

序列測定結(jié)果利用BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，選取同源性較高的相關(guān)序列用MEGA4.1軟件(http://www.megasoftware.net/mega4.1.html)分析，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)(bootstrap)為1000。植物和土壤指標測定數(shù)據(jù)采用Excel 2019進行初步處理，數(shù)據(jù)由平均值±標準誤表示；每個指標設置3個重復，使用SPSS19.0進行單因素方差分析，使用Origin2019處理數(shù)據(jù)并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟子松根際PGPR菌株篩選

從樟子松1年生苗根際土壤分離純化得到215株細菌，通過產(chǎn)IAA能力、解磷作用、產(chǎn)鐵載體的定性和定量篩選，得到6株高效的PGPR菌株(表1)，其中菌株2-6、3-13產(chǎn)IAA能力較強，IAA質(zhì)量濃度分別為68.41、67.79 mg/L；菌株1-11、1-12解磷能力較強，磷質(zhì)量濃度分別為96.5、86.17 mg/L；菌株1-42、6-13產(chǎn)鐵載體能力較強。

表1 樟子松根際PGPR菌株定性和定量篩選

2.2 樟子松根際PGPR細菌的16SrRNA基因測序分析

將篩選所得根際細菌的16S rRNA基因序列與Genbank對比分析，其中1-11、1-42與Pseudomonasfluorescens(MK100909.1、MH518308.1)同源性為100%，1-12與Ralstoniapickettii(GQ895735.1)同源性為100%，2-6與Herbaspirillumchlorophenolicum(NR114143.1)同源性為100%，3-13與Staphylococcuscapitis(JX094948.1)同源性為100%，6-13與P.lini(MH304256.1)同源性為100%。菌株測序序列上傳Genbank并編號：P.fluorescens(MK880640)1-11、R.pickettii(MK880641)1-12、P.fluorescens(MK880644)1-42、H.chlorophenolicum(MK880645)2-6、S.capitis(MK880646)3-13、P.lini(MK880647)6-13，菌株保存于東北林業(yè)大學森林微生物實驗室。

2.3 PGPR接種對樟子松苗生物量指標的影響

不同接種處理對樟子松苗生物量的影響差異顯著(p<0.05)，同對照相比，1-42處理組顯著增加了樟子松的根長、地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地下部干質(zhì)量，分別增加了66.33%、86.73%、76.57%、64.46%，3-13處理組顯著增加樟子松的根長，增加了52.51%；1-11處理組顯著增加了樟子松的根長、地下部鮮質(zhì)量，分別增加了70.81%、81.95%；2-6處理組顯著增加了樟子松的根長、地上部鮮質(zhì)量，分別增加了26.62%、11.50%；6-13處理組顯著增加了樟子松的根長，增加了42.66%(表2)。綜合分析，PGPR處理組對樟子松1年生苗根長的影響最為顯著，平均增加了46.67%，且PGPR菌株1-42對樟子松苗生物量指標影響最為顯著，說明接種PGPR可通過促進苗木根系生長，從而影響苗木生長。

圖1 樟子松根際PGPR菌株16SrRNA基因系統(tǒng)進化樹

表2 接種PGPR的樟子松1年生苗生物量

2.4 PGPR接種對樟子松苗養(yǎng)分指標的影響

不同接種處理對樟子松苗養(yǎng)分指標的影響差異顯著(P<0.05)，同對照(CK)相比，不同接種處理的樟子松苗在全氮、全磷、有機質(zhì)、全鉀水平均有顯著增加，其中1-11處理組顯著增加了樟子松苗根、葉全氮質(zhì)量分數(shù)，分別增加了33.63%、60.38%，2-6處理組顯著增加了樟子松苗莖的全氮質(zhì)量分數(shù)，增加了44.53%，不同接種處理樟子松苗的根、莖、葉全氮質(zhì)量分數(shù)平均增加1.62%、16.58%、30.19%；不同接種處理對樟子松苗的全磷影響最為顯著，根、莖、葉全磷質(zhì)量分數(shù)平均增加89.26%、206.23%、178.67%；6-13處理組顯著增加了樟子松苗根、莖、葉的有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，分別增加了30.64%、35.77%、48.11%；不同接種處理對樟子松苗根和莖的全鉀質(zhì)量分數(shù)平均增加了41.03%、16.44%，但樟子松苗葉的全鉀質(zhì)量分數(shù)不增反降。

表3 接種PGPR的樟子松1年生苗養(yǎng)分

2.5 PGPR接種對樟子松苗根際土壤養(yǎng)分和酶活性的影響

不同處理組對樟子松苗根際土壤速效氮、全磷、速效磷、有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)以及磷酸酶活性、過氧化氫酶活性、蔗糖酶活性、脲酶活性的影響差異顯著(P<0.05)，但在全磷和速效磷水平上沒有顯著差異性(P>0.05)，PGPR處理組土壤全氮、速效鉀質(zhì)量分數(shù)與對照(CK)相比均出現(xiàn)降低的情況；其中3-13處理組對土壤中全磷、速效磷、有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)及蔗糖酶活性、脲酶活性的量有顯著影響，分別增加了38.30%、29.14%、36.19%、10.36%、43.96%；1-11處理組對土壤速效磷、全鉀質(zhì)量分數(shù)及蔗糖酶活性、脲酶活性有顯著影響，分別增加了6.04%、3.47%、11.96%、32.09%；1-12處理組對速效氮、速效磷質(zhì)量分數(shù)以及過氧化氫酶活性有顯著影響，分別增加了30.77%、49.63%、4.05%；2-6、6-13處理組對蔗糖酶活性、脲酶活性有顯著影響，2-6處理組分別增加了24.17%、31.16%，6-13處理組分別增加22.44%、46.92%；綜合分析，PGPR處理組對脲酶活性影響最顯著，增長率均達到20.03%以上。

表4 不同樣品接種PGPR的樟子松根際土壤養(yǎng)分及酶活性

樣品速效鉀質(zhì)量分數(shù)/mg·kg-1磷酸酶/U·g-1過氧化氫酶/U·g-1蔗糖酶/U·g-1脲酶/U·g-11-11(87.43±0.21)c (962.96±44.1)d (414.12±36.4)cd(184.73±9.4)abc(1069.75±111.0)ab1-12(91.02±0.15)b(1213.80±44.0)c(526.70±37.5)a(200.20±12.9)ab(972.11±147.0)ab1-42(87.50±0.37)c(1538.72±73.6)a(453.24±18.4)bc(183.31±1.0)bc(1015.67±140.3)ab2-6(86.72±0.42)cd(1314.81±76.5)bc(434.63±7.3)cd(204.88±7.8)a(1062.24±46.1)ab3-13(86.51±0.42)de(1320.71±41.2)bc(384.07±11.8)d(182.09±9.0)bc(1165.88±95.9)a6-13(85.88±0.54)e(1186.87±145.3)c(458.96±41.0)bc(202.03±11.3)ab(1189.91±286.5)aCK(98.07±0.10)a(1519.36±144.4)ab(506.19±26.3)ab(165.00±5.6)c(809.89±76.8)b

2.6 土壤理化性質(zhì)與樟子松苗生物量的相關(guān)性

由表2—4可知，土壤中的全氮質(zhì)量分數(shù)對幼苗地徑和地下干質(zhì)量有顯著影響；速效氮、速效鉀質(zhì)量分數(shù)對幼苗地下鮮質(zhì)量有顯著影響；有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)對地下干質(zhì)量有顯著影響；土壤中磷酸酶活性對幼苗地上鮮質(zhì)量和干質(zhì)量有顯著影響；過氧化氫酶和蔗糖酶活性對幼苗地下鮮質(zhì)量有顯著影響；土壤全磷、速效磷質(zhì)量分數(shù)和脲酶活性與幼苗生物量相關(guān)性不太。

表5 土壤理化性質(zhì)與生物量的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

通過篩選樟子松根際分泌IAA細菌、解磷細菌、產(chǎn)鐵載體細菌菌株得到6株復合PGPR菌株，經(jīng)16SrRNA基因測序分析鑒定，分別為1-11菌株(PseudomonasfluorescensMK880640)、1-12菌株(RalstoniapickettiiMK880641)、1-42菌株(P.fluorescensMK880644)、2-6菌株(HerbaspirillumchlorophenolicumMK880645)、3-13菌株(StaphylococcuscapitisMK880646)、6-13菌株(P.liniMK880647)。這與徐秀倩等人研究發(fā)現(xiàn)林木根際細菌JYZ-SD5具有固氮、解有機磷和解鉀的能力，具有較高的產(chǎn)IAA能力，不加色氨酸前體下產(chǎn)IAA量為6.818 6 μg/mL的結(jié)論一致[14]。同時Yasmi等發(fā)現(xiàn)具有固氮、解磷和產(chǎn)IAA能力的兩種細菌Exiguobacteriumsp.和Stenotrophomonassp.對卡琪花蒂瑪(Labisiapumila)有促生作用[15]。

接種PGPR對樟子松1年生具有促生作用，可提高根際土壤養(yǎng)分和土壤酶活性。本實驗PGPR菌株1-42和3-13對樟子松生物量指標的影響最為顯著；接種PGPR后樟子松苗根長同對照相比，平均增加了46.67%。有實驗證明NaCl脅迫下，接種PGPR的燕麥的株高、根長、莖干質(zhì)量、根干質(zhì)量、相對含水量等生物參數(shù)明顯高于未接種的植株[16]；牛旭光[17]等人發(fā)現(xiàn)耐旱熒光假單胞菌(P.fluorescens)可刺激干旱脅迫下的種子萌發(fā)和幼苗生長。同時耿士均等研究發(fā)現(xiàn)，土壤中施加1.0%～2.5%的微生物菌肥可以使辣椒株高、干質(zhì)量分別增加3.0%～44.9%、16.7%～67.8%；番茄株高、干質(zhì)量分別增加6.2%～69.9%、3.8%～275.0%[18]。童輝[19]等研究表明，微生物菌肥施用量為2.0%時辣椒株高、生物量分別較對照增加15.8%、80.5%。

接種PGPR可顯著提高樟子松1年生苗全氮、全磷、有機質(zhì)、全鉀質(zhì)量分數(shù)，其中PGPR接種對樟子松1年生苗全磷質(zhì)量分數(shù)影響最為顯著。PGPR菌株1-11對根、葉的全氮質(zhì)量分數(shù)有顯著影響；菌株2-6對莖的全氮質(zhì)量分數(shù)、根的全鉀質(zhì)量分數(shù)有顯著影響；菌株1-12對根、葉的全磷質(zhì)量分數(shù)有顯著影響；菌株1-42對莖的全磷質(zhì)量分數(shù)，莖、葉的全鉀質(zhì)量分數(shù)有顯著影響；菌株6-13在根、莖、葉對有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)有顯著影響。菌根菌主要作用為提升植物攝取土壤內(nèi)磷元素能力，攝取機制為借助菌絲將養(yǎng)分空間擴大，并將土壤內(nèi)部有機質(zhì)活化[20]。植物與土壤微生物間產(chǎn)生密切的關(guān)聯(lián)，其植物有機質(zhì)為微生物提供賴以生存的環(huán)境，而微生物通過分解有機質(zhì)、釋放礦化元素促進植物更好地生長[21]。

微生物在土壤內(nèi)存在，可將其中難溶礦物質(zhì)加以分解，成為易溶解化合物，其中以磷、鉀等細菌為主，其可釋放無效的磷、鉀等物質(zhì)，加速植物發(fā)育、成長等[22]。本實驗證明接種PGPR可顯著提高樟子松1年生苗土壤速效氮、全磷、速效磷、有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)以及磷酸酶活性、過氧化氫酶活性、蔗糖酶活性、脲酶活性，但在全磷和速效磷水平上沒有顯著差異性，且接種PGPR的樟子松1年生苗土壤全氮、速效鉀質(zhì)量分數(shù)與對照(CK)相比均出現(xiàn)降低的情況；這與呂俊[23]等人在植物根際促生菌對大蒜的促生、抗病作用的研究中發(fā)現(xiàn)，8 g處理組的發(fā)芽率、株高、葉綠素質(zhì)量分數(shù)以及銨態(tài)氮、有效鉀和速效磷等土壤養(yǎng)分含量的測量都出現(xiàn)了降低的情況相同，可能是在較高濃度功能菌的情況下會出現(xiàn)促進作用下降的情況，也可能與植物根際促生菌本身或者其代謝產(chǎn)物過多有關(guān)。李靜[24]等的研究通過對各處理土壤的分析，得出固氮菌+解磷菌+解鉀菌組合的綜合應用有利于多功能菌增加土壤養(yǎng)分含量。

本實驗證明土壤中的全氮質(zhì)量分數(shù)、速效氮質(zhì)量分數(shù)、速效鉀質(zhì)量分數(shù)、有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、磷酸酶活性、過氧化氫酶活性和蔗糖酶活性與幼苗生物量顯著相關(guān)。土壤全磷質(zhì)量分數(shù)、速效磷質(zhì)量分數(shù)和脲酶活性與幼苗生物量相關(guān)性不太。這與陳有軍等人[25]在研究植物養(yǎng)分含量和根際土壤微生物量的動態(tài)變化一致，植物氮的單位含量和根際土壤的微生物量氮有相關(guān)性，但是只是植物地下部分單位氮含量和根際土壤微生物量碳、氮、磷呈正相關(guān)，且極顯著。