賈明鯤 閆景龍

0 引言

創(chuàng)傷、感染、腫瘤等多種因素可造成骨缺損，嚴重的骨缺損會引發(fā)骨的延遲愈合和不愈合，如果并發(fā)感染演變成骨髓炎，則需行截肢手術，導致嚴重的殘疾，給患者帶來經濟和心理上的負擔[1]。骨缺損的治療一直是骨科醫(yī)生面臨的嚴峻挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)治療骨缺損的方法是自體骨和異體骨移植，但自體骨移植來源有限、伴有取材部位的二次損傷；異體骨移植面臨著倫理問題、排斥反應、病毒傳播等風險[2]。組織工程是解決組織和器官缺損的一種重要手段，它通過建立由細胞和生物材料構成的三維空間復合體并以此來填充缺損，從而達到修復的效果[3]。種子細胞、支架材料、生物活性因子是組織工程中的三要素[4]，支架材料為細胞增殖和黏附提供空間環(huán)境，引導細胞生長，是組織工程中的研究熱點。合成聚合物和天然聚合物是常用的兩大支架材料，絲素蛋白(silk fibroin,SF)作為一種天然聚合物，具有良好的生物相容性，易降解、機械性能優(yōu)異，SF還具有優(yōu)異的可塑性，可通過不同生產工藝制備成各種形式，如薄膜、水凝膠、納米纖維以及多孔海綿[5]。本文簡要介紹了SF的組成結構、生物學特性以及SF在骨科中的應用與進展。

1 絲素蛋白的結構和特性

1.1 SF的組成結構

SF是許多節(jié)肢動物“紡紗”過程分泌的產物，節(jié)肢動物利用絲蛋白來筑巢、結繭、筑網等。絲纖維主要源于柞蠶、蓖麻蠶、家桑蠶和蜘蛛[6]。從組成成分上看，蠶絲主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，絲素蛋白大約占70%～80%，絲膠蛋白和少量蠟質組成了剩下的20%～30%[7]；SF包括18種氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸含量最多，大約占87%。從基本結構上看，SF結構主要由結晶區(qū)和非結晶區(qū)組成，結晶區(qū)的絲素蛋白之間形成穩(wěn)固的β-折疊，是高韌性和抗拉伸能力的來源；非結晶區(qū)肽鏈之間作用力弱，排列無序且含有較多極性基團，是高延展性和高彈性的來源[8]。從分子構象上看，SF主要包括silk I和silk II兩類，silk I由無規(guī)卷曲和α-螺旋交替堆疊而成，silk II是反向平行的β-折疊，該結構更加穩(wěn)定，是SF的基礎構象，silk I和sikl II兩者可通過濕熱、極性溶劑、pH等條件處理進行轉變。SF分子鏈上具有羥基、羧基、胺基等活潑基團，通過化學反應可以引入一些功能基團、單體、大分子鏈等，開發(fā)出具有不同性能的蠶絲，或通過這些基團與多種生物材料結合成復合材料，從而拓寬SF的應用領域[9]。

1.2 SF的生物學和理化特性

作為一種天然聚合物，SF具有以下優(yōu)點。(1)優(yōu)異的機械強度。研究[10]發(fā)現(xiàn)SF的力學性能與其二級結構相關，其中形成silk II β-折疊結構的肽鏈排列規(guī)整，相鄰鏈段間的氫鍵數(shù)量多、分子間引力穩(wěn)定，構成了SF材料高生物力學強度的基礎。趙亮[11]通過雙層蛛絲蛋白制備出了爆破強度達到43～150 kPa的血管支架，滿足了人工血管強度應高于18.7 kPa的力學要求，避免了因人體收縮壓導致的血管爆破。(2)良好的生物相容性。Chang等[12]將SF支架植入大鼠腹壁，HE染色結果顯示，SF植入支架周圍和內部均有細胞生長，且支架周圍結締組織生長致密，支架內細胞沿纖維生長良好、排列整齊，SF支架未對大鼠機體產生毒性反應。Zhuang等[13]將制備出的聚氨酯/SF復合膜和人臍靜脈內皮細胞進行共培養(yǎng)，通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，內皮細胞在SF復合膜上分布均勻、黏附良好、細胞結構完整、細胞核和細胞質清晰。(3)生物可降解性。研究[14]表明作為一種蛋白質，絲素蛋白可在生理環(huán)境下被糜蛋白酶、羧化酶等所分解，且分解后的產物主要為甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等氨基酸，能夠為生物體內所吸收利用。Wang等[15]通過凍干法制備出了SF/海藻酸鈉多孔支架，將多孔支架植入大鼠體內21天，通過Masson染色結果發(fā)現(xiàn)，SF/海藻酸鈉多孔支架被周圍組織浸潤包裹，多孔支架質量減少并失去結構完整性，表明該SF/海藻酸鈉復合支架在動物體內能夠發(fā)生降解。

2 SF支架在骨組織修復中的應用

2.1 SF水凝膠支架與軟骨修復

生理環(huán)境下關節(jié)軟骨缺乏血運，僅靠關節(jié)滑液進行營養(yǎng)支持，一旦損傷很難自行修復，臨床上治療關節(jié)軟骨疾病的方法有軟骨移植、關節(jié)置換、軟骨下穿透術等，雖然這些方法在短期內可緩解癥狀，但不能確保軟骨長期的功能恢復，通過構建SF水凝膠支架修復關節(jié)軟骨為軟骨損傷修復提供了新思路，研究[16]表明SF水凝膠能夠為軟骨細胞增殖和軟骨基質的產生提供微環(huán)境，促進軟骨細胞的修復再生。Singh等[17]的研究表明，SF水凝膠能夠上調軟骨形成轉錄因子sox-9、II型膠原(collagen II,Col II)和聚蛋白多糖(aggrecan)的表達，從而引起軟骨細胞外基質的增加，進而促進軟骨細胞的增殖。此外其組織學和免疫組化分析的結果也證實，加入SF的水凝膠和軟骨細胞共培養(yǎng)后，表達出具有更高的細胞外基質沉積和II型膠原蛋白。Liu 等[18]將硫代殼聚糖(thiolated chitosan，CS-NAC)和SF共混制備出具有雙網絡結構的水凝膠支架，并將其與軟骨細胞共培養(yǎng)。免疫組化染色顯示與不含SF的水凝膠支架相比，CS-NAC/SF水凝膠中Col II含量高達60%以上，表明加入SF的水凝膠能夠通過維持II型膠原的含量來保留軟骨細胞的正常功能和表型。Li等[19]制備出了結合殼聚糖納米顆粒的SF水凝膠支架，并將其植入兔膝關節(jié)軟骨缺損模型，II型膠原免疫染色結果顯示，植入SF水凝膠支架的膝關節(jié)缺損處被透明軟骨修復填充，新生細胞團中出現(xiàn)軟骨陷窩，表明該SF水凝膠支架能夠有效修復軟骨缺損。

2.2 SF復合支架與骨缺損修復

大節(jié)段骨缺損的治療一直是骨組織修復的難題，支架植入體內后常因與周圍骨組織無法融合導致植入失敗，將負載生長因子、骨種子細胞的SF復合支架植入骨缺損部位，促進缺損部位骨組織的分化和增殖以此修復骨缺損，已成為組織工程修復骨缺損的一種重要策略。作為參與組織基質礦化的重要酶，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)常由成骨細胞分泌起到成骨誘導效應[20]，Burger 等[21]將SF-纖維素支架與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與不含SF的支架相比其ALP含量更早達到頂峰，表明SF-纖維素支架能夠加速MC3T3-E1成骨分化進程，通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)低分子量SF的加入能夠抑制Notch通路，從而上調成骨相關因子ALP的表達。Kundu等[22]將SF支架和人骨髓間充質干細胞(human adipose tissue-derived stem cells，hASCs)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)hASCs中骨蛋白和骨橋蛋白表達上調，并出現(xiàn)棒狀礦化結晶，通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)SF能夠通過替代纖維I型膠原為羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAp)提供礦化的成核位點，從而發(fā)揮成骨效應。Yang 等[23]研究了聚乙二醇(PEG)/HAp/SF復合支架對大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)成骨分化的影響，研究發(fā)現(xiàn)與純PEG、純HAp、純SF支架相比，復合支架組的成骨相關標志物骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)、骨保護素(osteprotegerin,OPG)、Runt相關轉錄因子2(RUNX2)的表達上調了3～4倍。Gandhimathi等[24]通過靜電紡絲法制備出了聚己內酯/SF/SiO2納米纖維支架，研究表明SF的添加不僅能夠上調BMSC細胞OCN的表達水平，還能增加支架的孔徑使其孔隙率達到92%，有利于新生骨細胞與支架的融合從而促進骨組織修復。

2.3 3D打印支架與骨組織修復

三維生物打印技術是一種基于預編程數(shù)字藍圖的3D打印細胞裝載結構的技術，它可以構建帶有細胞的3D結構，模擬具有復雜結構和功能的組織和器官[25]。SF可用作生物墨水的添加劑，通過3D打印技術，可以構建出更適合骨缺損的內固定支架開展個體化治療[26]。Hong等[27]以SF和甲基丙烯酸縮水甘油酯(glycidyl methacylate,GMA)為原料合成了生物油墨，并通過數(shù)字光處理3D打印制備出了SF-GMA水凝膠。研究人員將其與軟骨細胞進行共培養(yǎng)，RT-PCR結果顯示Col II、X型膠原表達上調，并在第4周發(fā)現(xiàn)作為軟骨細胞外基質重要組成成分的糖胺聚糖顯著增加，表明該SF-3D水凝膠能夠促進軟骨的再生。Li等[28]通過3D打印構建出由聚己內酯和SF構成的仿生半月板支架，力學實驗表明該3D支架能夠承受80%的壓縮應變，且抗壓強度和抗拉強度均優(yōu)于純聚己內酯。進一步的體內實驗表明，該3D打印支架能夠誘導半月板再生，并在第12周完全被新生組織所替代，而空白對照組未見半月板組織再生。Ni等[29]通過3D打印構建出SF/羥丙基甲基纖維素雙層網絡水凝膠，研究人員將該水凝膠支架植入動物軟骨缺損部位，影像學檢查發(fā)現(xiàn)，軟骨缺損部位有新生軟骨形成，通過進一步細胞實驗測定軟骨細胞表達因子發(fā)現(xiàn)，軟骨相關基因表達上調，該支架促進了間充質干細胞的增殖和軟骨分化。

3 載藥SF支架在骨科治療的應用

3.1 載藥SF支架治療骨腫瘤

對于癌癥治療，藥物輸送系統(tǒng)正在迅速發(fā)展，以克服傳統(tǒng)化療的局限性。傳統(tǒng)的治療方法存在著體內藥物濃度分布不均和靶向性不強、水溶性差、治療指標低等缺點，亟待解決。新型載藥支架通過將藥物包埋于納微米級的球狀顆粒中，從而控制藥物的釋放速度，確保藥物在局部持續(xù)發(fā)揮作用，降低藥物的全身毒副作用，提高藥物療效[30]，和其他天然高分子相比，SF作為藥物緩釋材料可塑性優(yōu)異、生物相容性好、來源廣泛、可被生物體降解且降解產物無免疫原性。SF可通過噴霧干燥、鹽析、化學交聯(lián)等工藝制備成納微米球，并在納微米球中負載抗腫瘤藥物用于骨腫瘤的治療。Subia等[31]在葉酸偶聯(lián)SF納米顆粒上負載了抗癌藥物阿霉素，制備出一種直徑小于200 nm的SF納米級葉酸靶向載藥微粒支架。實驗人員通過人成骨細胞樣細胞和乳腺癌細胞共培養(yǎng)，從而模擬出了骨-乳腺癌轉移的三維微環(huán)境，結果表明和純阿霉素、非靶向阿霉素組相比，靶向載藥支架組的血管內皮生長因子、乳酸顯著低于另外兩組，說明靶向組抑制了腫瘤細胞的增殖能力。Pierantoni等[32]將辣根過氧化鈣負載于SF水凝膠中，通過和人成骨肉瘤細胞共培養(yǎng)，與純SF水凝膠相比，該載辣根過氧化鈣SF水凝膠支架能夠有效抑制成骨肉瘤細胞的增殖，小鼠體內植入實驗結果表明，該含鈣SF水凝膠持續(xù)6周釋放鈣離子。

3.2 載藥SF支架預防骨感染

缺損部位的骨組織因骨膜、周圍軟組織等受到破壞而缺乏血運，對細菌、病毒等微生物的抵抗能力較天然骨組織差[33]，傳統(tǒng)骨科內固定材料植入體內后不僅易受到病原體侵襲發(fā)生感染，而且在遠期植入后易形成無菌性炎癥[34]，因此，研制出一種具有預防感染功能的骨科內固定材料尤為重要。Fathi等[35]將負載萬古霉素的SF納米纖維涂層應用于TiO2-NTs，該支架的載藥濃度達到31.5 μg/mL，萬古霉素的釋放時間長達34 d，體外抗菌實驗結果顯示，和無SF納米纖維涂層的TiO2-NTs相比，該載藥涂層支架抑菌圈直徑大，具有對金黃色葡萄球菌增殖的抑制能力，研究人員將具載藥SF納米纖維涂層的TiO2-NTs與MG63細胞共培養(yǎng)，結果表明，載藥支架表面有細胞黏附，且細胞形態(tài)正常，有絲狀偽足，而在未涂層支架上沒有細胞黏附和生長。Zhou等[36]將載銀納米粒子和慶大霉素的SF涂層在鈦植入支架表面，體外抗菌實驗結果表明，和未涂層鈦支架相比，該涂層支架能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌的增殖，大鼠缺損模型植入實驗結果表明，涂層SF的鈦支架植入部位未出現(xiàn)局部感染的癥狀，Micro-CT結果顯示，和未涂層SF鈦支架相比，涂層SF的鈦支架植入局部有新骨形成，新骨比例達到41.8%±4.0%，該新型支架能夠有效發(fā)揮抗菌和促進骨缺損愈合的作用。

4 總結與展望

SF作為一種天然的生物材料，它可與其他生物材料結合形成復合支架，模擬自然骨環(huán)境，誘導成骨，同時SF作為一種可降解、可調控的蛋白，作為載體在治療骨腫瘤、預防骨感染中具有巨大的潛能。但將其應用到臨床，還有許多問題有待解決，如需要改進制備工藝以適應大規(guī)模生產SF，以SF為材料制備的微粒載體，都會有初期爆釋藥物、后期釋放不足、整個緩釋時間較短等一系列問題，對于這些問題的研究和解決會是今后的一個重點方向。隨著新型的加工技術的發(fā)展，基于SF的新支架將在未來有望得到開發(fā)，并為其在骨科的應用開辟更多可能。