沈浙南 邱結(jié)華 解軍輝 時煥斌 寇艷君*

（1 中國水稻研究所/水稻生物學(xué)國家重點實驗室，杭州311400；2 三峽大學(xué)生命科學(xué)院，武漢430000；#共同第一作者；*通訊作者：kouyanjun@caas.cn）

稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae/Piricularia oryzae）引起的真菌性病害，世界各稻區(qū)均有發(fā)生，一般導(dǎo)致水稻減產(chǎn)10%~30%，嚴重的甚至顆粒無收[1]。田間稻瘟病菌菌群毒力的多變性導(dǎo)致生產(chǎn)上推廣使用的抗病品種常因發(fā)病嚴重而淘汰[2]。目前生產(chǎn)上對稻瘟病的防治主要有化學(xué)防治和抗病育種，培育抗病新品種是最綠色經(jīng)濟的方法[3]。

近年來，通過圖位克隆等手段在水稻中鑒定了100 多個抗稻瘟病基因，其中36 個已被克隆[4]。這些水稻抗稻瘟病基因分布在除第3 染色體外的所有染色體上，在第6、11 和12 染色體上存在較多的抗稻瘟病基因簇。目前，大部分克隆的抗稻瘟病基因均有特異的分子檢測標記[5]。這些分子檢測標記的開發(fā)為水稻抗病分子育種奠定了良好基礎(chǔ)。育種家結(jié)合分子檢測標記可以快速鑒定水稻品種抗稻瘟病基因型，有效輔助抗病新品種的選育。黃乾龍等[6]利用 Pi2、Pi5、Pi9、Pikh、Pita、Pikm 和Pib 等7 個抗稻瘟病基因的分子標記對重慶73 個水稻骨干品種的抗病基因進行鑒定，解析這7 個抗病基因在水稻抗稻瘟病育種中的作用。陸展華等[7]利用 Pi1、Pi2、Pi9、Pib 和 Pita 等 5 個主效抗病基因的分子標記，結(jié)合葉瘟和穗瘟的抗性鑒定，對廣東省70 個主栽品種抗稻瘟病基因的組成進行了解析。張文龍等[8]通過分子標記分析了云南省地方水稻品種稻瘟病抗性與抗稻瘟基因型的相關(guān)性，為云南省抗稻瘟病品種的選育提供了重要參考。這些研究表明，分子檢測標記正逐步被育種家使用，為稻瘟病抗性育種提供了重要的輔助工具。

本研究在人工接種稻瘟病抗性鑒定的基礎(chǔ)上，利用 Pi1、Pi5、Pi2、Pi9、Pia、Pizt、Pigm、Pib、Pik 和 Pikh 等 7個主效抗稻瘟病基因分子檢測標記，對63 個浙江省主栽水稻品種的稻瘟病抗性進行綜合分析，旨在明確浙江主栽品種的抗病基因型，并初步探討了稻瘟病抗病基因的基因型與稻瘟病抗性之間的相關(guān)性，為浙江省水稻抗稻瘟病品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取浙江省63 個水稻主栽品種為材料，其中，秈稻類型品種24 個、粳稻類型30 個、秈粳交類型9 個（表1），由中國水稻研究所黃世文研究員提供。感病對照品種為麗江新團黑谷和CO39，麗江新團黑谷由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授提供，CO39 為本實驗室保存的品種。

1.2 稻瘟病菌的培養(yǎng)

在無菌條件下，將浙江省稻區(qū)分離的9 個保存菌株（由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供）[9]接種至PA 培養(yǎng)基（酵母提取物1 g/L，乳糖2.5 g/L，蔗糖2.5 g/L，酸梅汁40 mL/L，瓊脂粉20 g/L，調(diào)pH 至6.5），置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)活化3 d 左右?；罨瓿珊蠼臃N到燕麥培養(yǎng)基（燕麥40 g/L，番茄汁150 mL/L，瓊脂粉 20 g/L）。在 28℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d。用滅菌水去除表面的菌絲，放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)產(chǎn)孢2 d 后，用含0.2% Tween 20 的蒸餾水洗孢子，配制成5×105個孢子/mL 的孢子懸浮液用于噴霧接種和注射接種。

1.3 品種稻瘟病抗性鑒定

1.3.1 葉瘟的鑒定

參試水稻品種種子用抗菌素402 浸種2 d 后，放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行催芽，完成催芽后播種于育秧盤內(nèi)，每個品種播種5~10 粒。待秧苗長至4 葉期時進行噴霧接種，接種后用PVC 膜密封保持濕度，黑暗培養(yǎng)24 h 后恢復(fù)光照，置于22℃條件下培養(yǎng)7 d 后調(diào)查發(fā)病情況。按國際水稻研究所（IRRI）0~9 級的分級標準（0 級，無?。? 級，抗；3 級，中抗；5 級，中感；7級，感；9 級，高感）記載葉瘟。

1.3.2 穗頸瘟的鑒定

參考李湘民等穗瘟接種方法[10]，用醫(yī)用注射器將0.5 mL 孢子懸浮液注入稻苞內(nèi)，每穗接1 次。接種20 d后開始調(diào)查穗瘟發(fā)病情況，按國際水稻研究所0~9 級的分級標準（標準同葉瘟）記載穗瘟。

1.4 分子標記檢測

CTAB 法提取水稻品種DNA：首先在2.0 mL 的離心管中，加入剪碎的水稻葉片，加入800 μL 的CTAB提取液，加入鋼珠，放入植物組織破碎儀中60 Hz 研磨60 s，65℃水浴 30 min，每隔 10 min 上下顛倒混合，65℃水浴后取出室溫冷卻，加入等體積的氯仿，12 000 rpm離心10 min，吸取700 μL 的上清液于新的1.5 mL 的離心管中，加入2 倍體積的無水乙醇，－20℃放置30 min，12 000 rpm 離心10 min，去上清，倒置于吸水紙上，室溫干燥過夜，加150 μL 去離子水，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴增：抗稻瘟病基因分子選擇標記引物見表1，引物由杭州有康生物公司合成，PCR 反應(yīng)體系采用20 μL，其中 2×Mix 10 μL、F/R 引物各 1 μL、DNA 模板1 μL，加水 7.5 μL 補齊。PCR 程序為 95℃/3 min 預(yù)變性，94℃/30 s、55℃/45 s、72℃/30 s，35 個循環(huán)，后 72℃條件下5 min。

電泳檢測：PCR 擴增產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖凝膠電泳，180 V 電泳45 min，伯樂凝膠成像儀拍照記錄，基因型條帶信息記錄在Excel 中。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SAS 9.2 和Excel 2016 進行統(tǒng)計分析，相關(guān)性分析采用SAS 程序corr，遺傳聚類采用SAS 程序cluster，采用類平均法得到聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻品種對稻瘟病的抗性分析

本研究通過室內(nèi)苗期和田間穗期人工接種，對浙江省63 個主栽品種進行稻瘟病抗性分析。結(jié)果（表2）顯示，抗葉瘟品種42 個（占比66.7%）、感葉瘟品種21個，其中，高抗品種12 個、抗病品種28 個及中抗品種2 個；抗穗瘟病品種32 個（占比50.8%）、感病品種31個，其中高抗品種4 個、抗病品種13 個及中抗品種15個。這些結(jié)果顯示，浙江省主栽品種整體對葉瘟抗性良好，但穗瘟抗性有待進一步加強。

2.2 水稻品種的抗稻瘟基因型鑒定

利用表1 中的特異引物對63 個水稻品種進行分子檢測，結(jié)果表明，參試的63 個水稻品種中，檢測到6個抗病基因的品種2 個，檢測到5 個抗病基因的品種12 個，檢測到4 個抗病基因的品種20 個，檢測到3 個抗病基因的品種18 個，只含有1 個抗病基因的品種1個，此外，有2 個品種未檢測到本研究中的抗病基因（表2）。在63 個水稻品種中，分布頻率最高的基因是Pizt 和Pib，有45 個水稻品種鑒定到Pizt 和Pib 基因，有43 個水稻品種鑒定到Pi2 和Pi5 基因，鑒定到Pikh、Pia、Pi1 及 Pik 的水稻品種分別有 41、37、32 和 30 個，分布頻率最低的基因是Pigm 和Pi9，均只有2 個品種鑒定到。這些鑒定結(jié)果說明，浙江省主栽品種中Pizt、Pib、Pikh、Pia、Pi1 和 Pik 抗病基因利用頻率高，而 Pigm和Pi9 利用頻率低。

表1 本研究所用到的引物信息

表2 63 個水稻品種抗稻瘟病基因檢測結(jié)果

續(xù)表2

2.3 抗稻瘟病基因間的相關(guān)性分析

對浙江省63 個主栽品種抗性表型和10 個抗稻瘟病基因之間的相關(guān)性分析顯示，品種的葉瘟抗性和穗瘟抗性之間相關(guān)系數(shù)為0.255，達到顯著水平（P=0.046）（表3）。葉瘟抗性與Pi1 和Pib 基因之間的相關(guān)性系數(shù)分別為0.302 和0.610，達到顯著水平。穗瘟抗性與Pi9、Pi1 及Pia 基因之間相關(guān)性達到顯著水平，穗瘟抗性與Pib 基因相關(guān)系數(shù)為0.493，達到極顯著水平（P<0.001）。結(jié)果說明浙江省主栽品種中Pi1 和Pib 基因在葉瘟和穗瘟抗性過程中起著重要作用。

表3 抗性反應(yīng)與抗病基因以及抗病基因之間的相關(guān)性

在 10 個抗稻瘟基因之間，Pigm 與 Pib、Pizt 與 Pi2、Pizt 與 Pi1、Pi1 與 Pib、Pikh 與 Pib 之間的相關(guān)性極顯著，Pi1 與Pik 相關(guān)性顯著。Pi1 和Pib 多與其他抗病基因的相關(guān)性達到顯著及以上水平（表3），說明Pi1 和Pib 抗病基因與其他基因一起聚合對水稻抗病育種具有重要作用。

2.4 抗病基因間的遺傳聚類分析

對浙江省63 個主栽品種的葉瘟指數(shù)、穗瘟指數(shù)和10 個抗稻瘟基因的聚類分析顯示，在分類距離為1 時可以將63 個水稻品種分出3 大類：JD036 和JD048 為一類，JD052 和JD062 為一類，其余為一類，在分類距離0.9~1 之間又可以將第三大類細分為三類（圖1）。通過聚類分析所分出的類群中，同一類群中的品種抗性類似。這為以后品種改良選擇提供了方向，同類中的基因重組有利于水平抗性的提高，類群外的基因重組可以提高廣譜抗稻瘟病性。

2.5 抗病基因的頻率分布

不同抗病基因在秈稻和粳稻兩類材料中分布存在差異（圖 2）?？共』?Pia、Pik、Pi1、Pi2、Pizt、Pikh、Pi5及Pib 在浙江省主栽品種中分布頻率整體分布較高，而Pigm 和Pi9 分布頻率分布較低。在38 個粳稻材料中，Pib 的頻率分布最大為 0.76，其次是 Pia、Pik、Pi1、Pi2、Pizt、Pikh、Pi5、Pi9 和 Pigm，分布頻率分別為 0.66、0.55、0.47、0.29、0.26、0.13、0.05 和 0.03。在 25 個秈稻材料中，分布頻率最大的也是Pib 為0.64，其次是Pi5、Pia、Pikh、Pi1、Pik、Pizt、Pi2 和 Pigm，分布頻率分別為0.60、0.48、0.44、0.36、0.32、0.32 和 0.04。Pi9 在秈稻分布頻率為0?？共』騊i5 和Pikh 在秈稻和粳稻中分布頻率差異較大。

3 討論

稻瘟病在水稻的不同生育時期、不同部位均可以侵染，其中，穗瘟對水稻產(chǎn)量威脅最大。葉瘟可以作為指標之一來預(yù)測穗瘟的發(fā)生，對防治穗瘟發(fā)生具有指導(dǎo)意義。本研究對63 個水稻品種的葉瘟和穗瘟進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)葉瘟和穗瘟間存在顯著的相關(guān)性。葉瘟和穗瘟抗性反應(yīng)一致的材料占比達70%（表2）。張品輝等[17]利用貴州麻江縣10 年葉瘟和穗瘟的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，葉瘟和穗瘟存在極顯著水平的回歸關(guān)系。陳福如等[18]用人工接種研究葉瘟與穗瘟的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，葉瘟和穗瘟的抗性存在一定的正相關(guān)性。這些結(jié)果表明，一定程度上可以用室溫人工鑒定的葉瘟結(jié)果來預(yù)測田間穗瘟發(fā)生情況，這為稻瘟病抗性鑒定效率的提高提供了參考。

抗病育種是控制稻瘟病最綠色、經(jīng)濟和安全的方法，抗病基因的有效利用是抗病育種的關(guān)鍵。了解當(dāng)前浙江省主栽品種中抗病基因的構(gòu)成及與抗性水平的相關(guān)性，可為抗病品種的合理布局及提高抗病育種的可預(yù)見性提供依據(jù)。本研究以63 個浙江省主栽品種為材料 ， 利 用 Pi1、Pi5、Pi2、Pi9、Pia、Pizt、Pigm、Pib、Pik 和Pikh 等10 個抗病基因的分子標記，分析這些抗病基因在主栽品種中的分布規(guī)律以及其對葉瘟和穗瘟抗性的貢獻。Pigm 和Pi9 在63 個材料占比比較少，檢出率只有3.2%，其他抗病基因檢出率都在50.0%左右。Pigm、Pi1 及Pib 與葉瘟抗性存在顯著及以上的正相關(guān)性，Pi9、Pi1、Pib 和Pia 對穗瘟抗性存在顯著及以上的正相關(guān)性，暗示著使用這些抗病基因進行水稻新品種培育將有效降低稻瘟病的發(fā)生。

抗病基因間復(fù)雜的互作關(guān)系使得育種家進行多個抗病基因聚合時需要注意所聚合基因的主效性和正向性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，Pigm 與 Pib、Pi2 與 Pi1、Pi2 與 Pib、Pi1 與 Pik、Pi1 與 Pib 以及 Pikh 與 Pib 之間是正向顯著相關(guān)，而Pizt 與Pi2、Pizt 與Pi1 是負向極顯著相關(guān)，這些結(jié)果為未來多個抗病基因聚合提供了重要參考。Pi9對穗瘟抗性具有重要貢獻，Pigm 對葉瘟具有重要的貢獻，而Pi9 和Pigm 在本研究63 個主栽品種中檢出率比較低，說明Pigm 和Pi9 基因在浙江省抗性育種中還有利用空間。關(guān)注這2 個基因的分子選擇育種可能有助于進一步提高新品種的抗病性。