宋云云，陳韜

（湖南農業(yè)大學，湖南長沙410128）

哺乳動物胃腸道不僅是體內最大的食物消化吸收代謝器官，也是體內最大的消化免疫代謝器官[1]。腸道內的組織中經?？赡軙驗槭艿蕉喾N病原微生物感染引起多種疾病，如急性腹瀉、腸道黏膜炎癥等多種疾病，使腸道黏膜屏障功能持續(xù)受到嚴重的破壞。為了有效應對這些嚴重挑戰(zhàn)，腸道黏膜下的上皮細胞表面還會產生大量的活性抗菌蛋白（Antimicrobial proteins，AMPs）。能殺死腸道中的大部分致病菌，是構成機體天然自身免疫系統(tǒng)的重要成分，在機體抗腸道感染和治療炎癥中發(fā)揮重要作用[2]。與其他傳統(tǒng)外用抗生素相比，大多數(shù)AMPs 具有抗菌譜廣、抗菌活性高、熱力學穩(wěn)定性強、不易產生耐藥性等諸多優(yōu)點。此外一些AMPs 還具有促進細胞增殖、損傷修復、免疫功能調節(jié)等多種重要功能，是一種目前具有巨大開發(fā)應用潛力的新一代抗生素的替代品。所以，本文對哺乳動物中的AMPs種類、功能和表達以及調控反應機制等多個方面相關研究成果進行系統(tǒng)整理分析歸納，為有關AMPs部分替代抗生素在畜牧動物養(yǎng)殖生產方面的廣泛應用研究提供重要參考。

1 哺乳動物腸道AMPs 的種類

AMPs 是宿主腸道通過免疫防御反應系統(tǒng)產生的能對抗外源性病原體的一種防御性生物肽類活性化學物質，又叫作抗微生物肽或抗生素肽。哺乳動物腸道中起主要作用的AMPs 主要種類有以下幾種：

1.1 防御素

防御素（defensin）是一類富含多個半胱氨酸的陽離子活性肽，分子量約為 3～4 kDa，由 29～38 個氨基酸組成。目前已經發(fā)現(xiàn)防御素存在于人體內和各種哺乳動物中最多，其中一些防御素還具有廣譜性的抗菌活性[3,4]。根據(jù)各種氨基酸分子序列和分子形態(tài)結構的相互差異性，可將防御素分為α- 防御素、β- 防御素和θ- 防御素。α- 防御素是最早被發(fā)現(xiàn)的AMPs 家族之一，在哺乳動物中主要存在于小腸Paneth 細胞分泌顆粒中和腸腺的隱窩腔內[5]。在人類Paneth 細胞中只表達HD5 和HD6 兩種α-防御素[6]；在小鼠Paneth 細胞中表達了比較多的為一個隱窩受體蛋白（cryptdins）和一個CRS 相關因子序列; 而在豬的腸道內目前還沒有發(fā)現(xiàn)任何α-防御素。β- 防御素主要在哺乳動物小腸的上皮細胞表達，同時它在小腸Paneth 細胞和中性粒細胞均具有明顯表達，當受到某種外源致病微生物直接入侵時可啟動表達防御機制。α- 防御素和β- 防御素均具有抗革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、病毒以及原蟲的活性[7,8]。θ- 防御素的發(fā)現(xiàn)較晚，僅存在于恒河猴的中性粒細胞和單核性粒細胞的顆粒中,只在骨髓中表達，人和其他哺乳亞類動物體內目前尚未完全發(fā)現(xiàn)θ- 防御素的具體表達[9]。

1.2 C 型凝集素

人體內Paneth 細胞主要負責分泌RegIIIα，小鼠分泌為RegIIIγ。RegIIIγ 是AMPs 中最重要的一種新型AMPs，是一種分泌型小分子，但同時缺乏其他C 型凝集素中的補體招募區(qū)域，能直接結合肽聚糖殺滅革蘭氏陽性菌，主要在哺乳動物的腸道和皮膚當中表達，具有抗菌、抗炎、損傷修復和促進上皮細胞良性增殖等多種作用功能[10,11]。在豬的腸道中，RegIIIγ 主要由位于腸道的吸收性上皮細胞和腸道Paneth 細胞結合產生。其可通過調節(jié)腸道微生物和腸道宿主之間的空間免疫分布，以及腸道宿主黏膜的共生免疫作用應答，有效維持腸道微生物與腸道宿主之間的一種共生免疫關系[12,13]。但是，RegIIIγ 在研究豬腸道或其他組織系統(tǒng)中的各種相關免疫功能及其表達調控作用方面仍然一直存在著很多空白。RegIIIγ 的表達需要活化TLR-MyD88 途徑，而激活了MyD88 下游哪些信號分子目前尚不明確。

1.3 溶菌酶

溶菌酶是一種具有高酶活性帶正電荷的AMPs，可以在不損害機體的情況下，有效殺傷各種病原體。目前，人類最了解的溶菌酶是C 型溶菌酶，它包含一條肽鏈，129 個氨基酸，分子量約為14.3 kDa，內部分別存在4 個二硫鍵，具有大量的α 雙螺旋分子結構，因此熱力學穩(wěn)定性和耐高壓性比較強。溶菌酶C 不僅在Paneth 細胞中可以表達，還可以存在巨噬細胞和某些中性粒細胞顆粒中。盡管它的活性較低，但在某些免疫部位會出現(xiàn)高濃度溶菌酶表達，表明這種溶菌酶在哺乳動物先天性免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)，在人類和小鼠中均存在多種溶菌酶，其中人類僅存在一種溶菌酶 C，而小鼠中存在兩種：P 型（由 Lyz1 編碼）、M型（由Lyz2 編碼）。有研究對小鼠敲除Lyz2 的數(shù)據(jù)分析結果顯示，溶菌酶C 阻止肽聚糖在組織中的積累，以避免由于細菌細胞壁抗原體的持續(xù)存在而導致的延長促炎性反應，經過腸組織中清除肽聚糖對P 型溶菌酶是否起作用還未被研究[14]。

1.4 Cathelicidins

Cathelicidins 是一類含有保守Cathelin 區(qū)域的AMPs，在多種哺乳動物的腸道均有表達，在結構上存在很大差異，該基因可編碼一個前體蛋白（cathelicidin antimicrobial protein，CAMP），通過不同的剪切方式產生幾個均具有抗菌活性的蛋白[15]。如Cathelicidin 基因存在于人類中是HCAP-18，已經被證明產生至少三種不同的成熟抗菌肽，其中LL-37 研究最多[16]。按照二級結構可大體分為以下四大類：α- 螺旋cathelicidins、延伸- 螺旋cathelicidins、環(huán)狀 cathelicidins 和 β- 片層 cathelicidins。

1.5 磷脂酶 A2（PLA2）

PLA2 是一類體內分布廣泛并能夠參與體內磷脂蛋白代謝的水解酶，主要廣泛存在于哺乳動物的上皮組織細胞和分泌物中。在正常人體中，幾乎所有細胞均含有PLA2，但它主要廣泛分布于胃腸道、皮膚、心血管等重要部位[17]。研究人員發(fā)現(xiàn)，腸內分泌型磷脂酶A2(簡稱為PLA2G2A)基因是小鼠系中自發(fā)形成腸腺瘤和腫瘤的一種修飾重要基因，但導致小鼠腫瘤程度增加的機制是否間接涉及到影響小鼠腸道內磷脂酶的抗菌活性還沒有證據(jù)確定[18]。

1.6 核糖核酸酶

血管生成素4(ANG4)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型AMPs，是一種強分泌性單鏈血管蛋白，屬于核糖核酸酶超家族中的成員，其分子具有較低的核糖核酸酶活性，主要在哺乳動物的腸道中進行表達。而且它還具有抗菌活性和促進血管生成等多種生物學功能。研究人員在觀察仔豬腸道ANG4 的表達特點時，發(fā)現(xiàn)其腸道表達量會隨著每頭仔豬周齡的快速生長而不斷升高，其表達部位主要在位于腸道的上皮絨毛細胞和潘氏細胞，其中又以小腸上皮絨毛頂端表達量最為突出，而小腸隱窩處也可能有少量表達[19]。

2 AMPs 的生物學功能

2.1 抵抗病原微生物

天然自體免疫系統(tǒng)通過分泌表達一種稱為AMPs 的陽離子肽類抗生素，有效地防止致病微生物直接感染受到嚴重破壞的體表面。Ouellette 等人[20]研究發(fā)現(xiàn)在對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和其他防御素敏感的鼠傷寒沙門氏菌phoP-/- 突變體的抗微生物活性測定中可以發(fā)現(xiàn)，無論是從皮膚組織還是毛細管腔中將其分離，Cryptdins 均具有相同的體外抗菌活性。相反，N 末端截短 Cryptdin-6 和Cryptdin-4 的活性均有明顯降低，這些都表明N 末端Gly 殘基或Cryptdin-4 N 末端的長度是殺傷微生物的主要決定性因素，在隱腔內的一種先天免疫可通過肽分泌后對α- 防御素的氨肽酶進行修飾作用來進行調節(jié)。Cash 等人 [21]研究結果發(fā)現(xiàn)，RegIIIγ 作為一種可以直接殺菌的活性C 型凝集素，在抗菌聯(lián)合作用中具有一定的抗菌選擇性。它容易與革蘭氏陽性菌的細胞膜直接結合，可特異性殺傷革蘭氏陽性菌。Ebbensgaard 等人[22]證明了在Cathelidicin 家族成員中有兩個家族成員Cap18 和Cap11 具有強大的抗菌活性，特別是針對革蘭氏陰性菌病原微生物，包括魚類和家禽生產中發(fā)現(xiàn)的病原微生物。

2.2 抗炎作用

AMPs 可以直接充當中性粒細胞、單核細胞、肥大細胞和T 細胞的趨化因子或刺激宿主中性粒細胞和單核肥大細胞趨化因子的快速釋放，使它們能夠快速聚集在炎癥趨化反應多的部位，發(fā)揮各自部位相應的趨化功能并有效降低其他炎癥趨化反應，如起源于哺乳動物的α-defensins、β-defensins 和LL-37 等。Wehkamp J 等人[23]研究發(fā)現(xiàn)，Paneth 細胞α- 防御素分泌的減少，被證明是導致克羅恩回腸炎先天性免疫功能紊亂的關鍵因素。

2.3 調節(jié)腸道菌群

Paneth 細胞分泌中的AMPs 通過調節(jié)腸道中的微生物和生態(tài)系統(tǒng)的組成，有效地調節(jié)固有角質層中T 細胞反應，從而有效改變促黏膜炎癥反應和調節(jié)反應之間的平衡。Salzman 等人[24]在使用防御素缺乏癥（MMP7-/-）和盈余（HD5+/+）的互補小鼠模型發(fā)現(xiàn)，小腸優(yōu)勢菌種中防御素依賴的相互轉換而總細菌數(shù)沒有變化。此外，HD5 表達的小鼠顯示出明顯的節(jié)段絲狀細菌（SFB）丟失，從而導致固有層中Th17 細胞數(shù)量減少。該研究報道進一步證明了Paneth 細胞Defensins 通過調節(jié)小腸微生物群在腸道內穩(wěn)態(tài)中的新作用。

2.4 免疫調節(jié)

AMPs 除了通過自體免疫機制殺滅各種病原體防止各種病原體和微生物進入免疫宿主體內，還可通過分泌多種位于自體免疫細胞內的免疫細胞因子有效抑制致病機體的炎癥代謝反應，并通過自體免疫調節(jié)系統(tǒng)發(fā)揮作用，調節(jié)細胞內促炎信號的激活來發(fā)揮抗炎作用，如抗菌肽LTP-20 可通過作用NF-κB 通路和MAPK 信號通路降低LPS 刺激產生的促炎因子水平[25]。同時，Steenwinckel 等人[26]發(fā)現(xiàn)IL-9 出現(xiàn)過表達后，小鼠腸黏膜肥大細胞數(shù)量增加，表明了該細胞因子可能在腸道炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用。當IL-9 上調杯狀細胞相關基因（如Muc2、CLCA3）的表達時，還通過上調Paneth 細胞分泌物的表達 (如 ANG4、Criptdins 和 PLA2g2a)這一活性的表達需要IL-13 介導。

2.5 損傷修復和促進細胞增殖

AMPs 中比較典型的有：RegIIIγ 蛋白是能夠通過作用促進胰島細胞的復制和正常再生，使胰島細胞體積不斷增大和能夠抑制細胞正常凋亡，從而能夠促使胰島細胞正常生長和對抗損傷進行修復。易宏波等人[27]用Caco-2 細胞黏膜刮損損傷修復模型研究發(fā)現(xiàn)，AMPs CWA 可以顯著提高刮傷上皮細胞的黏膜愈合修復速度，改善對受損的腸道上皮刮傷細胞的愈合修復損傷功能。Christa 等人[28]發(fā)現(xiàn)HIP/PAP 蛋白在肝癌細胞中有特異的活性化學表達，并與鼠體內肝腫瘤細胞和肝癌細胞外膜的基質相互作用。這些研究結果表明，抑制HIP/PAP 蛋白極有可能對大鼠肝癌細胞的基質分化/細胞增殖過程具有潛在的化學重要性。

2.6 其他作用

如ANG 家族有促進血管生成作用、新型AMPsDP7 能抑制細胞凋亡。

3 AMPs 的作用機制

研究發(fā)現(xiàn)，AMPs 的抗菌機制按其主要靶點部位可以劃分為細胞壁破壞機制、破膜機制和胞內破壞機制。細菌細胞壁的主要成分之一是肽聚糖，對維持細菌的細胞正常形態(tài)至關重要，一旦細胞壁被溶解，其壁膜通透性大大增加，就會造成部分細菌滲透壓嚴重失衡，細胞壁膜破裂，內容物基質流失排出，細胞迅速死亡。喬媛媛等人[29]通過鏡下觀察到在AMPs 經過處理后的正常生長大腸桿菌的細胞形態(tài)發(fā)生變化，并在其作用12h 后質壁完全分離，細胞壁內部出現(xiàn)微小空泡且細胞界限模糊，細胞具有走向正常死亡期的趨勢，說明AMPs 可能會破壞細胞壁引起細胞死亡。Mukherjee S 等人[30]隨后報道了腸道細菌組織中仍然存在大多數(shù)AMPs 以細菌的細胞壁結構為靶點，通過攻擊細菌的細胞壁結構來介導殺傷細菌。上皮組織細胞中經常存在許多AMPs 也都是通過非酶細胞壁直接刺激機制而殺傷細菌，如RegIII 家族的C 型凝集素、防御素和組織蛋白酶。此外，還有某些腸上皮AMPs 通過利用干擾抑制細菌細胞壁合成來調節(jié)抗菌作用，例如：人β- 防御素3 和肽聚糖前體脂質II 的結合，從而通過干擾細胞壁生物合成導致局部細胞壁黏膜損傷，造成細菌在低鹽條件下滲透性破裂死亡[31]。

目前已經發(fā)現(xiàn)的細胞膜孔道形成機制主要類型有“地毯樣”、“環(huán)形”、“桶形”以及“聚集通道”模型。其中細胞膜是AMPs 的主要靶點。大多數(shù)AMPs具有陽離子特性，正電荷殘基與細胞膜上的負電荷發(fā)生靜電相互吸收作用，然后將其插入細菌的細胞膜外壁，其疏水殘基構成二級結構，親水部分與胞膜脂質相結合，形成管壁通道和跨膜離子通道，從而破壞了細菌的膜完整性，導致了細胞中的大量物質外流，導致細胞死亡。Ito T 等人[32]在研究防御素家族成員中人BD3 抗菌的機制時，發(fā)現(xiàn)AMPs 主要結合于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細胞膜表面的糖鏈，MRSA 聚集在細胞膜的表面，然后經過一系列反應，結合表面正負電荷，導致MRSA 細胞膜破裂的內容物從細菌中流出死亡。Yang D 等人[33]發(fā)現(xiàn)cathelicidin 家族成員中的LL-37，不僅能夠直接殺死MRSA，而且能夠抑制球菌細胞膜的形成和破壞已經形成的球菌膜。有研究顯示，AMPs 中PR-39 和Lfcin 等基因可以與胞內靶點相結合，抑制細菌DNA表達，最終致死細菌[34]。單安山等人[35]的研究發(fā)現(xiàn)，豬小腸中性粒細胞的一種AMPs(PR-39)含有豐富的脯氨酸和精氨酸，能夠在細菌內發(fā)揮作用，抑制NADPH 氧化酶復合物的組裝，導致不能產生活性氧，細菌內的代謝不能進行，從而阻礙細菌的生長繁殖。AMPs 還可以直接地影響菌群內功能蛋白的構象或結合細胞膜，使胞內功能蛋白喪失活性[36]。AMPs 的作用機制首先作用于細胞膜，使通透性增加進入細胞膜中，再作用于胞內蛋白質、核酸等物質，從而抑制細胞壁合成和胞內蛋白質的表達，在細菌體內形成一種相互協(xié)同的作用機制，最終達到抑菌的作用。

4 AMPs 表達的調控

有些AMPs 具有雙向作用，當其表達不當是，極易引起不必要的炎癥反應，因此其表達和分泌受到諸多方面嚴格的表達調控，其中包括轉錄調節(jié)、發(fā)育調節(jié)、分泌調節(jié)以及翻譯后修飾。

4.1 轉錄調節(jié)

在腸道組織中，大多數(shù)AMPs 的表達是誘導型的。無菌飼養(yǎng)的小鼠在腸道組織中檢測不到RegIIIγ 和ANG4 蛋白的表達，但在常規(guī)飼養(yǎng)條件下表達明顯升高，說明了RegIIIγ 和ANG4 蛋白的表達受到某種微生物信號的調節(jié)[37]。此外，RegIIIγ 的表達受到天然淋巴樣細胞（ILCs）產生的白細胞介素22（IL-22）的誘導;ANG4 的表達則受到 IL-25 的誘導，并IL-13 呈現(xiàn)劑量依賴性[38,39]。同時，也有少部分AMPs 的表達是組成型的。其中許多AMPs 的表達不依賴于微生物菌群，如腸道中大部分α- 防御素的表達，則需要WNT 信號通路途徑的轉錄因子TCF4，但不受到微生物菌群的影響[40,41]。同樣，溶菌酶、磷脂酶A2 和部分β 防御素的表達也不需要細菌信號[42,43]。

4.2 發(fā)育調節(jié)

動物發(fā)育過程的轉變也是影響某些AMPs 表達的因素。ANG4 和RegIIIγ 在小鼠新生早期表達明顯升高，與斷奶前后相比，ANG4 的表達水平可升高20 倍左右，而RegIIIγ 的水平則可達到約3000 倍，這種變化的原因很可能是作為對斷奶后引起的免疫撤除的應答，產生相應的AMPs 來進行補償[37]；相反，Cathelicidin 的表達則在斷奶前開始下降，成年以后幾乎消失[44]。

4.3 分泌調節(jié)

在哺乳動物腸道中，Paneth 細胞產生大量的AMPs，包括α 防御素、溶菌酶、磷脂酶A 2 和ANG4 等。這些AMPs 的分泌是在Paneth 細胞暴露在細菌或細菌表面分子后的反應，如脂多糖，這也意味著AMPs 的分泌是作為遇到細菌潛在威脅的應答而精確控制的[45]。

4.4 翻譯后修飾

由于部分AMPs 是通過破壞細菌細胞膜來殺滅細菌的。因此，該AMPs 對宿主細胞具有潛在的毒性，其殺菌活性在合成后細胞內儲存過程是受到嚴格控制。而小鼠α- 防御素是以沒有活性的前體進行儲存在分泌顆粒中，通過MMP7 的作用產生成熟的具有活性的形式α- 防御素[46]；而人α- 防御素的激活則需要依賴于胰蛋白酶[47]。同樣，RegIIIγ和Cathelicidin 也是以沒有活性的前體形式儲存在分泌顆粒中，分別在胰蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的作用下轉變成成熟的AMPs[48,49]。

5 AMPs 的表達調控機制

AMPs 的表達由多種信號通路精確的調控，如Toll 受體 （TLR） 信號通路、MyD88 信號通路中NF-κB、MAPK 信號通路以及組蛋白去乙?；揎椡緩降?。而TLR 受體是模式識別受體（PRR）家族，是第一個被發(fā)現(xiàn)的PRR，病原體相關分子模式（PAMP）最為常見，代表性最強的是革蘭陽性菌的PG 和革蘭陰性菌的LPS，它們可結合Toll 受體向宿主發(fā)出感染信號，并觸發(fā)炎癥[50]。越來越多的研究表明，腸上皮細胞水平的TLR 信號轉導途徑是保護腸道免受致病菌侵襲的關鍵。研究發(fā)現(xiàn)，夜蛾的免疫途徑中存在兩種信號轉導因子，其中MyD88和Pelle 兩種信號途徑的RNA 干擾能夠顯著抑制磷脂酶A2 的活性，而當受細菌入侵時能夠通過Toll 受體信號通路誘導磷脂酶A2 的表達[51]。Dou X J 等人[52]發(fā)現(xiàn) TLR2/4 可通過 p65 磷酸化和 NF-κB抑制蛋白激酶的延遲合成激活NF-κB 途徑，從而促進AMPs 的表達。組蛋白修飾是一種精確調節(jié)抗菌蛋白的重要途徑，組蛋白去乙酰化酶（HDAC）是組蛋白修飾中的一種重要的方法。Fischer N 等人[53]的研究表明，HDAC 抑制劑通過調節(jié)組蛋白修飾，顯著提高腸道上皮AMPs 表達，但不影響促炎因子表達。Schulthess J 等人[54]研究表明，丁酸通過抑制HDAC3 提高啟動子區(qū)域組蛋白乙?；M蛋白H3第9 賴氨酸（acH3K27） 水平，能夠促進 AMPs(S100A8/A9/A12)表達，提升小鼠巨噬細胞清除細菌的能力。肖熠[55]在探究宿主- 腸道微生物中的作用和機制時，發(fā)現(xiàn)IL-33 可獨立誘導RegⅢγ 在腸上皮的表達，然后通過mTOR、MEK-ERK、STAT3 三條信號通路調節(jié)腸上皮細胞分泌達的RegⅢγ 蛋白。在腸道組織中AMPs 的表達受到多種信號分子的共同調控，受到不同刺激源對AMPs 的表達調控機制存在差異，對機體產生了不同影響。

6 總結與展望

隨著抗生素耐藥性的威脅越來越大，一種新的綠色健康的“抗生素”顯得尤為重要。在眾多抗生素的替代品中，腸道AMPs 部分替代抗生素成為了重要研究對象，作為小分子療法替代品有著廣闊的前景。在畜牧養(yǎng)殖中，AMPs 作為一種飼料添加劑，能改善動物腸道微生物菌群的結構，抑制病原微生物的繁殖，提高動物的生產性能；在食品行業(yè)中，AMPs 可以用作食品防腐劑和增效劑，為功能性食品開發(fā)提供新的途徑。因此，本文就腸道AMPs 的種類、特性、生物學作用以及表達調控機制進行了歸納。但是要將AMPs 真正地應用到臨床治療與生產實踐中，還存在許多需要解決的問題:（1）AMPs表達含量少，增加了提取難度，無法滿足市場應用的需求量，人工合成AMPs 成本比較高。（2）AMPs結構簡單，大多數(shù)呈短肽鏈，其穩(wěn)定性較差。（3）AMPs 具有雙向作用，存在一定的安全性，在安全性方面有待考察。目前，AMPs 還處在研究階段，其分子機理、藥物代謝規(guī)律尚未完全明確，但抗菌譜廣，具有不易產生耐藥性的優(yōu)勢，且不同的AMPs 具有各自的生物學特性。所以綜上所述，只要經過不斷深入的研究和了解，AMPs 將成為未來部分替代抗生素的物質，從而減少抗生素的濫用以及提高用藥安全性。 □