王佳怡，莊少偉

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200137)

1983年，Pan等[1]在體外培養(yǎng)綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)一種從未發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外囊泡，1987年被命名為外泌體[2]。作為一種傳遞信號(hào)的介質(zhì)，外泌體在細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與組織間起到了多種調(diào)控作用，并在心血管疾病中扮演著重要的角色。

在心血管疾病如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化型心臟病(coronary atherosclerotic heart disease, CAD)過(guò)程中，外泌體的介導(dǎo)作用是一把雙刃劍，既可導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[3-7]，也可產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，這與外泌體來(lái)源細(xì)胞的種類和誘導(dǎo)因素相關(guān)。如血管平滑肌細(xì)胞外泌體會(huì)介導(dǎo)miR-155破壞血管內(nèi)皮，而單核巨噬細(xì)胞受尼古丁誘導(dǎo)后產(chǎn)生的外泌體會(huì)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞遷移及增殖，延緩冠脈狹窄的進(jìn)展[8-9]。

根據(jù)《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2019》，CAD是我國(guó)城鄉(xiāng)居民疾病死亡的首要原因，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)的死亡率呈快速上升趨勢(shì)[10]。由于冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊破裂形成的血栓堵塞或冠脈痙攣等原因，冠狀動(dòng)脈發(fā)生急性、持續(xù)性閉塞，從而導(dǎo)致心肌血供不足，心肌細(xì)胞缺血缺氧，因而AMI有著起病急、進(jìn)展快、預(yù)后差的特點(diǎn)。目前AMI的治療手段以溶栓和介入治療為主，即使及時(shí)接受了治療，患者仍可能遭受心臟破裂、心律失常、心力衰竭或心源性休克等并發(fā)癥的折磨，心源性猝死風(fēng)險(xiǎn)大大提升[11-13]。因而研究外泌體介導(dǎo)AMI的作用機(jī)制，有助于了解AMI病理生理過(guò)程，以利開(kāi)發(fā)新的診療方式。

已有眾多報(bào)道表明外泌體在AMI后心臟具有修復(fù)作用[14-16]，外泌體在臨床應(yīng)用中具有巨大潛力，有望為防治心臟疾病開(kāi)辟一條蹊徑。

1 外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間通訊影響心肌梗死

1.1 外泌體的生物學(xué)功能

外泌體形態(tài)呈杯狀，直徑為50～150 nm，具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)[17]。外泌體通過(guò)旁分泌途徑傳遞信息，其起源于多囊體(multivesicular bodys, MVBs)產(chǎn)生的腔內(nèi)囊泡，在與質(zhì)膜融合后向胞外分泌[18]，釋放受哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mechanistic target of rapamycin complex 1, mTORC1)開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)[19]。

靶細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞途徑攝取外泌體。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的外泌體內(nèi)吞途徑包括網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用、小窩蛋白依賴性內(nèi)吞作用、大胞飲作用、吞噬作用以及脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等[20-23]。在對(duì)大鼠乳鼠來(lái)源的心肌成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞和小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞的通訊觀察中發(fā)現(xiàn)，靶細(xì)胞對(duì)外泌體的吞噬具有選擇性，外泌體的內(nèi)吞作用通過(guò)受體介導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)制實(shí)現(xiàn)[7,24]。研究外泌體釋放和攝取的機(jī)制有助于解析其在細(xì)胞間的作用機(jī)制，為外泌體介導(dǎo)和干預(yù)AMI發(fā)病機(jī)制指明新方向。

外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)含物傳遞細(xì)胞間信號(hào)，從而參與體內(nèi)多種生理及病理過(guò)程，如介導(dǎo)細(xì)胞死亡、調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程、促進(jìn)病毒傳播等[25-29]。目前已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含物種類包含核酸、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等，其中含RNA超過(guò)10 000種，RNA是外泌體中最主要的信號(hào)傳遞分子[30]。

不同來(lái)源的外泌體在不同的機(jī)體環(huán)境下所產(chǎn)生的作用也不盡相同[7]。對(duì)外泌體內(nèi)含物參與的信號(hào)通路的解密，有助于揭露外泌體介導(dǎo)AMI過(guò)程的相關(guān)機(jī)制。

1.2 外泌體中的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)

外泌體可以將囊泡內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中，其RNA種類十分豐富，包括miRNA、lncRNA、cRNA、siRNA等，但目前研究主要集中于miRNA和lncRNA。外泌體同樣運(yùn)載DNA，但鮮有報(bào)道其生物學(xué)意義。

1.2.1 外泌體miRNA在AMI中的作用 AMI發(fā)生后心肌細(xì)胞因缺血缺氧受到損傷，雖然適時(shí)溶栓或介入治療降低了AMI死亡率，但無(wú)法逆轉(zhuǎn)梗死區(qū)心肌細(xì)胞的受損及纖維化的發(fā)展，而外泌體miRNA介導(dǎo)AMI后修復(fù)方式是近5年研究熱點(diǎn)之一。AMI后再灌注過(guò)程中，心臟成纖維細(xì)胞通過(guò)miR-423-3p抑制RAP2C，增強(qiáng)心肌細(xì)胞對(duì)復(fù)氧的耐受，同時(shí)心肌球細(xì)胞外泌體中的miR-181b可通過(guò)miRNA與蛋白質(zhì)的協(xié)同作用抑制促凋亡蛋白PKCδ，阻止心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[31-32]。AMI后血清中的循環(huán)外泌體可以通過(guò)富集miR-1956激活脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的釋放，同時(shí)下調(diào)miR-939-5p表達(dá)從而增強(qiáng)iNOS-NO活性，促進(jìn)血管新生[33-34]。此外，胚胎干細(xì)胞分泌的外泌體中miR-294靶向修復(fù)受損心肌細(xì)胞，增強(qiáng)梗死后心臟的功能[35]。但是AMI后巨噬細(xì)胞外泌體通過(guò)傳遞促炎信號(hào)加重心肌損傷，這些外泌體miRNA(如miR-155或miR-182)表達(dá)下降能夠靶向抑制巨噬細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)AMI后心臟重構(gòu)[4,36-37]。由此可見(jiàn)不同細(xì)胞外泌體miRNA對(duì)AMI后修復(fù)作用不盡相同。

1.2.2 外泌體lncRNA在AMI中的作用 目前已知的外泌體lncRNA對(duì)心臟的保護(hù)作用大多建立在干細(xì)胞相關(guān)研究中，需與miRNA協(xié)同發(fā)生。如人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中的lncRNA KLF3-AS1通過(guò)miR-138-5P/SIRT1軸抑制AMI過(guò)程中心肌細(xì)胞的焦亡[26]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的lncRNA-UCA1通過(guò)靶向miR-873，解除對(duì)抗凋亡因子X(jué)IAP的抑制作用后同時(shí)增加抗凋亡蛋白BCL2的表達(dá)，從而維持細(xì)胞生存[38]。阿托伐他汀作為降膽固醇藥物，在AMI治療中起到關(guān)鍵作用，阿托伐他汀預(yù)處理后的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)以lncRNA H19為媒介促使miR-675表達(dá)，激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和細(xì)胞黏附分子-1(cell adhesion molecule-1, CAM-1)，從而促進(jìn)血管新生，同時(shí)抑制心肌細(xì)胞凋亡[39]。

1.3 外泌體中蛋白質(zhì)對(duì)心肌有保護(hù)作用

研究表明，外泌體內(nèi)裝載的蛋白有心臟保護(hù)作用。從成年雄性大鼠和健康的人類男性志愿者的血液中純化出外泌體，外泌體攜帶的熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)通過(guò)刺激Toll樣受體4(Toll-like receptors 4, TLR4)信號(hào)通路激活HSP27，從而保護(hù)受損心肌[40]。

向AMI小鼠心肌內(nèi)注射富含白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞外泌體，顯著改善了左心室心功能，抑制了細(xì)胞凋亡，減小了MI瘢痕大小，促進(jìn)了MI后新血管生成，而注射敲除了IL-10的小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞外泌體顯示出了完全相反的治療效果[41]。

2 外泌體具有成為AMI診斷標(biāo)志物的潛力

臨床上用于確診AMI的血清學(xué)指標(biāo)主要是肌鈣蛋白(troponin, Tn)I或T。其中TNI在AMI起病3～4 h后方才升高明顯，因此以TNI為診斷指標(biāo)可能會(huì)錯(cuò)過(guò)AMI治療的最佳時(shí)機(jī)[11-12]。此外，其他非AMI因素心肌損傷也可導(dǎo)致TNI升高，對(duì)臨床診斷工作會(huì)造成一定干擾。因此迫切需要更多AMI早期診斷標(biāo)志物用于臨床診斷。眾多研究證據(jù)表明，外泌體中的miRNA和lncRNA可為AMI早期診斷提供新的依據(jù)。

對(duì)AMI患者血清和血漿進(jìn)行檢測(cè)，會(huì)發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞來(lái)源的miR-1、miR-133、miR-208和miR-499表達(dá)量升高[42-44]。而在AMI小鼠模型中驗(yàn)證確定外泌體miR-1a、miR-208a和miR-499-5p在血液循環(huán)中升高，而血漿中的非外泌體部分可檢出升高的miR-133a[42]。此外，AMI患者循環(huán)外泌體中還存在miR-126、miR-183和PTEN基因的高表達(dá)，lncRNA-UCA1、lncRNA-NEAT1和lncRNA MMP-9等lncRNA含量也較常人更豐富，而miR-21、miR-204的表達(dá)量有所下調(diào)[38,45-47]，其中，miR-126、miR-183的高表達(dá)與患者的心肌缺血程度呈正相關(guān)[45-46]。因此，外泌體中的miRNA和lncRNA具有預(yù)測(cè)心肌缺血損傷程度和診斷AMI的潛力。AMI后1年內(nèi)發(fā)作心力衰竭的患者血清中檢測(cè)出了高表達(dá)的miR-192，患者血清外泌體中的miR-194及miR-34a的表達(dá)與之協(xié)同上調(diào)，這3種miRNA具有預(yù)測(cè)AMI后1年內(nèi)發(fā)生心力衰竭的潛力[48]。

3 利用外泌體有望成為AMI治療新方式

AMI往往導(dǎo)致心肌長(zhǎng)時(shí)間缺血缺氧，致使心肌細(xì)胞形成不可逆的損傷和壞死[49]，因此對(duì)外泌體的利用主要聚焦于對(duì)再灌注后受損心肌的修復(fù)，治療思路為阻斷損傷性外泌體的攝取、增強(qiáng)治療性外泌體的傳遞[50-51]。

在相關(guān)的研究中，往往將外泌體與基因工程相結(jié)合，借助外泌體對(duì)基因的運(yùn)載和釋放功能，從基因?qū)用鎸?shí)現(xiàn)對(duì)AMI的靶向治療[52-53]。例如過(guò)表達(dá)低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)可上調(diào)心臟內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體中的miR-126和miR-210表達(dá)量，其中miR-126上調(diào)Vegfa和Fgf2基因的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，而miR-210降低線粒體代謝，從而提升被移植的心臟祖細(xì)胞的存活率[54]。

在此基礎(chǔ)上，以外泌體為載體，將外泌體與利于心肌修復(fù)的信號(hào)分子整合為治療用藥，可以減少信號(hào)分子在體內(nèi)的代謝消耗，定向、定量、靶向AMI區(qū)域局部給藥[50-52]。Song等[53]通過(guò)向梗死區(qū)心肌注射外泌體，將裝載的外源性miR-21導(dǎo)入AMI小鼠心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，從而大大抑制了細(xì)胞凋亡，使心功能得到明顯改善。北卡羅來(lái)納州立大學(xué)陳柯團(tuán)隊(duì)[55]直接向AMI大鼠梗死心肌區(qū)域內(nèi)注射人正常心臟組織來(lái)源的外泌體，發(fā)現(xiàn)其能夠阻止小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)下降，減輕AMI后心臟重塑。

在大型動(dòng)物模型中，局部外泌體注射治療的療效也得到了驗(yàn)證。美國(guó)西奈山醫(yī)學(xué)院Eduardo Marban研究組將外泌體對(duì)心臟的保護(hù)作用在豬AMI模型上進(jìn)行了驗(yàn)證。Eduardo Marban研究組[32]構(gòu)建了大鼠和豬的AMI模型后，向兩種模型的心肌梗死區(qū)均注射了人心肌球衍生細(xì)胞源外泌體，結(jié)果顯示梗死區(qū)域瘢痕減小，減輕不利的重塑，且改善梗死后左心室射血分?jǐn)?shù)。美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校張建一教授和國(guó)內(nèi)同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院高崚團(tuán)隊(duì)合作[50]，同樣構(gòu)建了豬AMI模型，報(bào)道了由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)衍生的心臟細(xì)胞外泌體于心臟梗死區(qū)域注射治療后，可改善梗死豬心臟的細(xì)胞能量代謝，改善了豬AMI模型的心臟功能并限制了不良重塑，并且不會(huì)增加心律失常并發(fā)癥的發(fā)生率，為心肌損傷提供了無(wú)細(xì)胞治療的新選擇。

兩方團(tuán)隊(duì)都嘗試冠脈內(nèi)注射予藥，然而療效則無(wú)，這提示外泌體治療的予藥需集中在梗死局部，減少體內(nèi)循環(huán)代謝對(duì)外泌體的消耗。對(duì)此，亦有研究提出通過(guò)利用磁性吸附的原理，局部募集外泌體，使之在梗死區(qū)域釋放的可能性，并在不同動(dòng)物AMI模型中予以了嘗試[56]。

4 外泌體可提高干細(xì)胞移植存活率

干細(xì)胞移植是AMI后心肌修復(fù)治療的前沿研究方向[57]，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證明干細(xì)胞能夠幫助AMI后梗死區(qū)心肌組織再生和修復(fù)，但是移植后細(xì)胞存活率不高，嚴(yán)重制約了干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用[50-54]。

心肌內(nèi)注射人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的心臟祖細(xì)胞外泌體或小鼠胚胎干細(xì)胞外泌體同樣可以改善小鼠AMI后心功能[13,35]，既能收獲與干細(xì)胞移植同等的效益，又可以規(guī)避干細(xì)胞移植存活率低的局面。

外泌體還可以用于抑制干細(xì)胞移植治療后發(fā)生的免疫反應(yīng)，減輕移植后排斥反應(yīng)。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)miR-24/Bim途徑降低了移植后排斥反應(yīng)，從而提高移植細(xì)胞生存率[58]。

5 展 望

目前外泌體在AMI等心血管疾病中的研究尚處在起步階段，集中于外泌體在細(xì)胞和組織水平上通訊載體功能，主要圍繞著AMI過(guò)程中的炎癥反應(yīng)、梗死面積的加重等損傷過(guò)程，抑或是減少心肌細(xì)胞死亡、刺激血管新生等的保護(hù)機(jī)制,具有診斷和治療AMI的潛力。

由于外泌體粒徑單位只有納米級(jí)別，在電荷、粒徑大小上都很難與其他細(xì)胞囊泡或者成分分離，因而如何分離和純化外泌體一直是研究中的一大難題。依托于科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，外泌體的檢測(cè)方法也得到發(fā)展[56,59-60]，如特異性配體受體結(jié)合或者磁珠捕捉法、納米流式分析系統(tǒng)、原子力顯微紅外光譜儀等，從而簡(jiǎn)化外泌體的定性定量流程[60-63]。微流控外泌體捕捉芯片，因其對(duì)外泌體樣品需求量小、檢測(cè)靈敏度高，具有成為健康檢測(cè)和疾病診斷工具的潛能[64-65]。有研究團(tuán)隊(duì)以仿生外泌體粒子為靈感，通過(guò)技術(shù)手段人為建造外泌體模擬納米囊泡，提升了其可控性和可修飾性，在外泌體的生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)革命性突破[66-68]。

隨著外泌體檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，其檢驗(yàn)手段已經(jīng)初步具備臨床檢驗(yàn)的能力，因此外泌體具有良好的臨床應(yīng)用前景，值得受到更多研究者的關(guān)注。