由萬(wàn)寧，賴永潔

現(xiàn)今心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）已成為全世界最主要的死亡原因［1］，其中瓣膜性心臟病（valve heart diseases，VHD）是CVD 的重要類(lèi)型之一。隨著社會(huì)老齡化加劇，VHD 患病率逐年升高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)75歲以上老年人中VHD的患病率為11.7%～13.3%［2］。我國(guó)成年人口中VHD的患病率為5.3%～7.7%［3］。VHD的兩大病理表現(xiàn)為瓣膜的纖維化與鈣化，而瓣膜內(nèi)部細(xì)胞行為的改變是瓣膜發(fā)生病理改變的重要基礎(chǔ)［4-5］。瓣膜內(nèi)部主要由瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞、瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（valve interstitial cells，VICs）和VICs 分泌的膠原蛋白、彈性纖維、蛋白多糖、纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）等多種細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）共同構(gòu)成［6-7］。VICs 的數(shù)量約占瓣膜中細(xì)胞總數(shù)的80%，VICs與ECM對(duì)維持心臟瓣膜的正常結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要，VICs 具有向多種表型分化的潛能，其中肌成纖維細(xì)胞表型分化是瓣膜產(chǎn)生纖維化病理改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是進(jìn)一步促使瓣膜鈣化的因素之一，而成骨細(xì)胞表型分化則與瓣膜鈣化密切相關(guān)［8］。近年來(lái)對(duì)VICs分化的研究為揭示VHD的發(fā)生機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，現(xiàn)就有關(guān)VICs分化的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 VICs的肌成纖維樣表型分化

正 常 VICs 表 現(xiàn) 為“ 靜 止 ”（quiescent VICs，qVICs）狀態(tài)，即成纖維細(xì)胞樣表型，但在損傷、某些細(xì)胞因子、異常血流或機(jī)械應(yīng)力等刺激下會(huì)被激活轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨╝ctivated VICs，aVICs）表型，即肌成纖維細(xì)胞樣表型［9］。aVICs 表現(xiàn)為細(xì)胞收縮性能增強(qiáng)以及細(xì)胞骨架成分，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、結(jié)蛋白、波形蛋白等蛋白標(biāo)志物以及基質(zhì)分解代謝酶和彈性蛋白酶的表達(dá)增加。正常狀態(tài)下，aVICs在完成組織修復(fù)后將轉(zhuǎn)入靜止期恢復(fù)成為qVICs，或者發(fā)生凋亡以維持組織平衡穩(wěn)態(tài)［10］。相比qVICs，aVICs在ECM中產(chǎn)生膠原蛋白，特別是Ⅰ、Ⅲ型膠原的能力更強(qiáng)［11］。若VICs 的活化因素持續(xù)存在則可進(jìn)一步導(dǎo)致瓣膜纖維化或鈣化的發(fā)生。

1.1 細(xì)胞因子的作用 目前研究普遍認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是主導(dǎo)qVICs活化的重要細(xì)胞因子之一，在炎癥或損傷等因素刺激下，遷移至瓣膜中的多種免疫細(xì)胞以及VICs 均可分泌TGF-β1，與細(xì)胞表面受體結(jié)合后通過(guò)經(jīng)典SMAD通路或絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）-p38 非經(jīng)典通路等促進(jìn)qVICs 向 aVICs 表型轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為 α-SMA 表達(dá)增加，同時(shí)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子等水平上調(diào)，促使瓣膜ECM 發(fā)生重構(gòu)，從而引發(fā)瓣膜進(jìn)一步的纖維化［12］或鈣化［13］。

Adesanya 等［14］研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜修復(fù)蛋白MG53（mitsugumin53）在VICs中有表達(dá)，MG53基因敲除小鼠更易于發(fā)生類(lèi)似主動(dòng)脈狹窄的病理改變，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在VICs培養(yǎng)體系中加入MG53后，可顯著下調(diào)TGF-β1 所誘導(dǎo)的SMAD 同源物2（SMAD2）磷酸化水平，同時(shí)降低下游，如FN等靶基因的表達(dá)水平，對(duì)VICs 的活化過(guò)程產(chǎn)生有效抑制，推測(cè)MG53 可能通過(guò)參與VICs細(xì)胞膜修復(fù)，降低損傷對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的刺激，從而減少TGF-β1 信號(hào)通路的激活并抑制VICs 的活化。此研究雖未闡明具體的調(diào)控機(jī)制，但MG53 在VHD 進(jìn)程中的保護(hù)作用為VHD 的治療提供了新的藥物靶點(diǎn)。

白細(xì)胞介素（IL）-18 為IL-1 超家族成員，是重要的炎性細(xì)胞因子。有研究發(fā)現(xiàn)IL-18在主動(dòng)脈鈣化患者血清以及鈣化瓣膜內(nèi)部水平均顯著升高，體外實(shí)驗(yàn)表明IL-18 通過(guò)激活核因子（nuclear factor，NF）-κB 通路上調(diào)高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein，HMGB1）水 平 進(jìn) 而 促 進(jìn) VICs 活化［15-16］。但是，HMGB1如何參與調(diào)控VICs活化并不清楚，同時(shí) VICs 是否分泌 IL-18，IL-18 促 VICs 活化與瓣膜鈣化之間的關(guān)聯(lián)也值得進(jìn)一步探討。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）-2被認(rèn)為是健康瓣膜組織中維持VICs處于靜止?fàn)顟B(tài)的關(guān)鍵細(xì)胞因子［17］。在瓣膜組織損傷修復(fù)過(guò)程中，F(xiàn)GF-2可抑制由TGF-β1所誘導(dǎo)的VICs活化，避免過(guò)量ECM 沉積，幫助及時(shí)終止修復(fù)，避免瘢痕產(chǎn)生，其與TGF-β1 之間的平衡對(duì)VICs 活化狀態(tài)以及瓣膜組織重構(gòu)具有重要意義。此外，F(xiàn)GF-2 還可促使已活化的aVICs 發(fā)生去分化，恢復(fù)為靜止的qVICs，從瓣膜中分離得到的VICs 在體外培養(yǎng)時(shí)往往發(fā)生不同程度的自發(fā)活化，這對(duì)研究VICs的分化機(jī)制產(chǎn)生不利影響。若在VICs 原代培養(yǎng)體系中加入外源性的FGF-2，可將VICs 維持在低活化水平，則有助于相關(guān)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行［18］。同時(shí)FGF-2對(duì)VICs 活化的抑制作用也為VHD 的干預(yù)與治療提供了新思路。

1.2 金屬蛋白酶的作用 去整合素樣金屬蛋白酶（a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS）家族是一類(lèi)以多種ECM為降解底物的蛋白酶，通過(guò)ECM重構(gòu)參與組織器官正常發(fā)育過(guò)程，同時(shí)其表達(dá)異常也與眾多疾病發(fā)生密切相關(guān)。近年來(lái)有關(guān)心血管疾病的研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS成員在瓣膜發(fā)育與疾病中的新作用［19］。ADAMTS-5 是重要的蛋白聚糖降解酶之一，在骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)炎癥等疾病中?？梢?jiàn)其水平上升。而在ADAMTS-5基因敲除的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-5基因缺失可導(dǎo)致二葉主動(dòng)脈瓣或二葉肺動(dòng)脈瓣的先天發(fā)育異常［20］，提示了ADAMTS-5在維持瓣膜正常結(jié)構(gòu)與功能中的作用。Li 等［21］研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-5 缺失促進(jìn)了瓣膜鈣化的發(fā)生，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)則證實(shí)ADAMTS-5 缺失導(dǎo)致VICs 中matrilin2水平上調(diào)，matrillin2 是協(xié)助構(gòu)建ECM 網(wǎng)絡(luò)重要的輔助蛋白，其水平升高促使與VICs 活化相關(guān)的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，重組ADAMTS-5 蛋白處理VICs后matrilin2 蛋白水平下調(diào)并伴隨VICs 活化相關(guān)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，因此ADAMTS-5/matrilin2 軸參與了VICs 活化調(diào)控。針對(duì)兩者的靶向調(diào)節(jié)可能成為VHD 早期干預(yù)的策略之一。該項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，matrilin2 誘導(dǎo) VICs 活化的同時(shí)，VICs 開(kāi)始表達(dá)如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）等成骨細(xì)胞分子標(biāo)志物，提示VICs 活化與成骨細(xì)胞分化并非2 個(gè)孤立的分化路徑，但兩者的內(nèi)在聯(lián)系還需進(jìn)一步深入探討。

ADAMTS-19 是新近發(fā)現(xiàn)的ADAMTS 家族成員，其酶解底物不明，近期研究表明部分常染色體隱性遺傳心臟瓣膜病患者存在ADAMTS-19 基因功 能 的 缺 失 性 突 變［22-23］。 Wünnemann 等［22］對(duì)ADAMTS-19 基因敲除小鼠的研究證實(shí)，ADAMTS-19 功能缺失可導(dǎo)致瓣膜發(fā)育異常并出現(xiàn)進(jìn)行性的主動(dòng)脈瓣狹窄或反流；進(jìn)一步分析表明，ADAMTS-19 是新型 VICs 標(biāo)記分子，ADAMTS-19 基因敲除小鼠VICs 的活化相關(guān)蛋白α-SMA 水平下降，說(shuō)明ADMTS-19 缺失抑制了VICs 活化。通過(guò)單細(xì)胞RNA 測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組分析篩選出淋巴增強(qiáng)因子-1（lymphoid enhancer-binding factor 1，Lef1）參 與ADAMTS-19 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，Lef1 是 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的重要下游分子之一，隨后的VICs 體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí) ADAMTS-19 是 Wnt/β-catenin 通路的應(yīng)答基因；但并不清楚此通路對(duì)ADAMTS-19 的調(diào)控是否參與了 VICs 活化。Chen 等［24］研究表明TGF-β1 可通過(guò)激活 β-catenin 誘導(dǎo) VICs 活化，Wnt/β-catenin 通路與 TGF-β1 之間的協(xié)同效應(yīng)可加強(qiáng)VICs 活化，據(jù)此推測(cè)Wnt 信號(hào)通路被抑制可能是ADAMTS-19 缺失導(dǎo)致VICs 活化減弱的機(jī)制之一，而進(jìn)一步揭示該機(jī)制則需要對(duì)VICs 活化過(guò)程中Wnt/β-catenin 通路的激活水平進(jìn)行深入研究。

1.3 力學(xué)因素作用 瓣膜對(duì)血流動(dòng)力學(xué)以及機(jī)械應(yīng)力的改變具有高敏感性，由VICs 活化所引發(fā)的ECM纖維化或鈣化可提高ECM硬度，進(jìn)而上調(diào)VICs所承受的剪切應(yīng)力，此過(guò)程可顯著誘導(dǎo)局部TGF-β1水平上調(diào)，進(jìn)一步增強(qiáng)了VICs 的活化，參與VICs 應(yīng)力感受的蛋白對(duì)其活化發(fā)揮重要作用［25］。Calponin2蛋白是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，能夠調(diào)節(jié)平滑肌收縮，參與細(xì)胞壓力信號(hào)傳導(dǎo)［26］。Plazyo等［27］發(fā)現(xiàn)Calponin2上調(diào)可增強(qiáng)VICs的活化指標(biāo)α-SMA 的表達(dá)水平，Calponin2 可能通過(guò)與 α-SMA 的結(jié)合增強(qiáng)VICs 的收縮功能，促進(jìn)VICs 的活化，提示Calponin2 上調(diào)與VICs 活化之間形成的正反饋通路可能是瓣膜進(jìn)一步產(chǎn)生纖維化與鈣化的機(jī)制之一。

鈣黏蛋白（cadherin，CDH）家族是一類(lèi)依賴鈣離子介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的跨膜糖蛋白，其中CDH11是唯一可介導(dǎo)黏著斑形成的鈣黏蛋白，通過(guò)機(jī)械信號(hào)的傳遞參與細(xì)胞遷移、創(chuàng)傷愈合等生理過(guò)程，在瓣膜纖維化、鈣化等病變中均可見(jiàn)其水平顯著上調(diào)［28］。Wang 等［29］研究發(fā)現(xiàn) TGF-β1 處理可顯著上調(diào)VICs的 CDH11 表達(dá)水平，提示 CDH11 是 TGF-β1 的下游基因，將VICs 中的CDH11 基因敲低處理后α-SMA表達(dá)增加，VICs 活化水平提高；而增強(qiáng)CDH11 活性則顯著抑制VICs 活化，表明CDH11 在VICs 活化過(guò)程中可能發(fā)揮抑制作用，TGF-β1 在誘導(dǎo)VICs 活化時(shí)，不僅上調(diào)正向調(diào)控活化的靶基因，還促進(jìn)負(fù)向調(diào)控活化靶基因的表達(dá)，這可能是細(xì)胞維持平衡穩(wěn)態(tài)的機(jī)制之一。Bowler 等［30］對(duì) CDH11 基因敲除小鼠的分析證實(shí)，CDH11 缺失可上調(diào)α-SMA 水平，CDH11 對(duì) VICs 活化存在負(fù)向調(diào)控，但 CDH11 亦可通過(guò)促進(jìn)黏著斑形成以及上調(diào)IL-6通路增強(qiáng)VICs-ECM間的機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)，一定程度上對(duì)VICs活化起到促進(jìn)作用，以上提示CDH11在VICs活化中的雙重功能，同時(shí)其在瓣膜疾病中的作用還需從多角度進(jìn)行深入探討。

Ma等［31］利用人工合成水凝膠進(jìn)行VICs的3D培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基基質(zhì)硬度增加可顯著誘導(dǎo)VICs活化 ，此 時(shí) VICs 中 Yes 相 關(guān) 蛋 白（Yes-associated protein，YAP）發(fā)生核轉(zhuǎn)位，YAP 作為轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子可激活下游基因如α-SMA 表達(dá)。此研究中VICs 對(duì)周?chē)鷫毫ι仙母兄苯訉?dǎo)致YAP 向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，而壓力下降則可見(jiàn)YAP 核內(nèi)轉(zhuǎn)移被抑制。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞黏著斑面積與YAP核轉(zhuǎn)移及VICs活化水平均呈正相關(guān)，證實(shí)黏著斑作為細(xì)胞與ECM間的連接點(diǎn)，是介導(dǎo)壓力信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。VICs 對(duì)壓力感應(yīng)的調(diào)控成為VICs 活化機(jī)制又一值得關(guān)注的研究方向。

2 VICs的成骨表型分化

VICs 向成骨細(xì)胞表型分化可促進(jìn)多種促鈣化因子上調(diào)，導(dǎo)致異位鈣化，在鈣化的早期階段，炎癥或者機(jī)械應(yīng)力刺激VICs 可激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2 以及 Runx2 等與成骨細(xì)胞密切相關(guān)的重要信號(hào)分子，細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)ALP、骨鈣素等成骨細(xì)胞分子標(biāo)志，VICs向成骨細(xì)胞表型分化，進(jìn)一步導(dǎo)致瓣膜增厚變硬，最終發(fā)生鈣化［32］。

2.1 成骨分化相關(guān)信號(hào)通路

2.1.1 Wnt 通路 Wnt 信號(hào)通路廣泛參與人體生長(zhǎng)發(fā)育和病理過(guò)程，是VICs成骨表型分化的重要調(diào)控因子［33］。Li 等［34］利用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng) VICs 時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞成骨標(biāo)志物Runx2 表達(dá)增加，同時(shí)糖原合酶激酶（glycogen synthase kinase，GSK）-3β 與 βcatenin 表達(dá)水平明顯上調(diào)，而在培養(yǎng)體系中加入Ⅰ類(lèi)組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑 MS-275 后，Runx2、GSK-3β 與 β-catenin 水平均顯著下降，且細(xì)胞內(nèi)鈣質(zhì)沉積明顯減少，表明Wnt/GSK-3β 和 Wnt/β-catenin 兩條通路被抑制可下調(diào)Runx2 的表達(dá)，進(jìn)而抑制VICs 的成骨分化。Polley等［35］發(fā)現(xiàn)使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)VICs后，細(xì)胞中內(nèi)源性無(wú)孢蛋白（asporin）表達(dá)水平降低，而將asporin重組蛋白加入培養(yǎng)體系后顯示成骨細(xì)胞分子標(biāo)志骨橋蛋白和Runx2表達(dá)均減少，同時(shí)β-catenin、Wnt3a 水平下調(diào)，而Wnt3a 重組蛋白處理VICs 后細(xì)胞的成骨分子標(biāo)志表達(dá)增加，在此基礎(chǔ)上再加入asporin 重組蛋白，細(xì)胞的成骨分化則被顯著抑制。因此，asporin作為瓣膜中的ECM成分可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活阻止VICs向成骨分化，證實(shí)Wnt通路激活對(duì)成骨分化的促進(jìn)作用。以上研究未就相關(guān)蛋白如何抑制Wnt通路激活進(jìn)行深入探討，但仍充分說(shuō)明Wnt通路在驅(qū)動(dòng)VICs 成骨分化中的關(guān)鍵作用，對(duì)此通路的研究對(duì)充分闡明VICs成骨分化機(jī)制十分重要。

2.1.2 MAPK/ERK 通路 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）為MAPK激活后的下游信號(hào)分子之一，在細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)控中具有重要作用。 蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）為絲氨酸蘇氨酸磷酸化酶，參與調(diào)控真核細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，在主動(dòng)脈瓣膜鈣化模型小鼠以及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的VICs中PP2A水平及活性顯著下降，VICs 中過(guò)表達(dá)PP2A 可見(jiàn)MAPK/ERK 通路被抑制，細(xì)胞成骨分化水平降低，而敲低PP2A后MAPK/ERK通路激活，細(xì)胞成骨分化水平升高，再次證實(shí)MAPK/ERK通路可能參與促進(jìn)VICs成骨表型分化［36］。最近一項(xiàng)有關(guān)主動(dòng)脈瓣膜鈣化疾?。╝ortic valve calcification disease，CAVD）的研究［37］發(fā)現(xiàn)，CAVD 患者血清中鋅離子水平較正常人明顯降低，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明在磷酸鹽誘導(dǎo)的VICs成骨分化模型中添加硫酸鋅可降低成骨相關(guān)基因的表達(dá)，并且還可通過(guò)抑制VICs 凋亡阻礙VICs 成骨分化。胞外鋅離子可通過(guò)結(jié)合胞膜上鋅敏感受體G蛋白偶聯(lián)受體39（G protein-coupled receptors，GPR39）激活MAPK/ERK 通路，抑制VICs 凋亡和成骨分化，研究者認(rèn)為通過(guò)補(bǔ)充鋅離子可對(duì)CAVD 起到保護(hù)作用，但此研究還發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK 對(duì)VICs 成骨分化發(fā)揮抑制作用。關(guān)于MAPK/ERK 信號(hào)通路在VICs 成骨分化中的作用，上述兩項(xiàng)研究的結(jié)果并不一致，這可能是不同研究中使用的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的成分不一導(dǎo)致細(xì)胞外環(huán)境存在差異，或是細(xì)胞種屬來(lái)源不同等因素導(dǎo)致。

2.1.3 Notch通路 Notch1是Notch細(xì)胞表面受體家族成員之一，通過(guò)與相應(yīng)配體結(jié)合激活下游通路，在胚胎早期發(fā)育、細(xì)胞分化等方面具有重要生物學(xué)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)其參與了VICs成骨分化進(jìn)程，但其具體作用仍存在爭(zhēng)議。Majumdar 等［38］發(fā)現(xiàn)一氧化氮可通過(guò)上調(diào)泛素特異性蛋白酶9X（X-linked ubiquitin-specific protease 9，USP9X）的巰基-亞硝基化水平促進(jìn)后者對(duì)下游Notch1 通路的激活作用，以此抑制主動(dòng)脈瓣VICs的成骨分化過(guò)程，此研究認(rèn)為激活Notch 通路對(duì)VICs 成骨分化有抑制作用，對(duì)此通路的調(diào)控機(jī)制研究可為CAVD的治療提供新的理論參考。Zeng等［39］研究結(jié)果顯示CAVD患者瓣膜鈣化區(qū)域中Notch1表達(dá)陽(yáng)性的VICs數(shù)量較多，脂多糖處理VICs 后成骨分化指標(biāo)明顯上升，Notch 通路被激活，Notch1表達(dá)量增加，而將Notch通路抑制后，脂多糖誘導(dǎo)VICs 成骨分化的水平則明顯減弱。此研究認(rèn)為，Notch1 還參與激活 ERK1/2 與 NF-κB 兩條信號(hào)途徑以此促進(jìn)VICs 成骨分化，表明除Notch 通路本身被激活之外，與其他信號(hào)通路之間的交互作用也是促進(jìn)VICs 成骨分化的機(jī)制之一。此外，Perpelina 等［40］研究也認(rèn)為 Notch1 通路激活可驅(qū)動(dòng)VICs的成骨分化。與MAPK/ERK 通路類(lèi)似，不同的研究對(duì)Notch通路在VICs成骨分化中的作用也存在不同看法，鑒于VICs 分化與周?chē)h(huán)境的密切關(guān)系，如能建立最大程度還原人體內(nèi)微環(huán)境的VICs 體外培養(yǎng)體系可能是解決上述爭(zhēng)議的方法之一。

2.2 微小RNAs（miRNAs）與表觀遺傳調(diào)控 miRNA是一類(lèi)可在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控的新型調(diào)控因子，目前利用miRNA譜技術(shù)對(duì)鈣化與非鈣化瓣膜的miRNA差異譜進(jìn)行分析，已篩選出多種可能參與VICs 成骨分化調(diào)控的miRNA。miR-29b 在鈣化瓣膜中表達(dá)增加，降低其水平可減弱VICs的成骨分化。TGF-β3是miR-29b的直接靶標(biāo)，miR-29b抑制TGF-β3 的同時(shí) Wnt3/β-catenin 與 Runx2/Smad3 通路被激活繼而導(dǎo)致VICs 成骨分化，但TGF-β3 下調(diào)與促成骨分化信號(hào)通路激活之間的內(nèi)在聯(lián)系仍需進(jìn)一步研究［41］。miR-138 水平在鈣化瓣膜中顯著降低，將其模擬物作用于VICs中后，Runx2和ALP顯著下調(diào)，而將miR-138 抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞則增加Runx2與ALP 表達(dá)水平。miR-138 對(duì)VICs 成骨分化可能發(fā)揮抑制作用，通過(guò)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)以及RNA和蛋白水平實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白C1（forkhead box protein C1，F(xiàn)OXC1）是miR-138 的靶點(diǎn)，F(xiàn)OXC1 過(guò)表達(dá)促進(jìn)VICs 成骨分化，敲低FOXC1 則抑制成骨分化，說(shuō)明miR-138通過(guò)下調(diào)FOXC1抑制VICs成骨分化，但此過(guò)程中FOXC1通過(guò)哪些下游蛋白來(lái)發(fā)揮其促成骨作用尚不清楚［42］。Toshima 等［43］認(rèn)為 miR-34a水平在鈣化瓣膜中上調(diào)，miR-34a通過(guò)下調(diào)靶基因Notch1 并抑制后者下游通路激活來(lái)促進(jìn)VICs 成骨分化。另一組研究發(fā)現(xiàn)，miR-204 在鈣化瓣膜中表達(dá)極低，采用類(lèi)似物上調(diào)VICs 中miR-204水平可降低 ALP 與 Runx2 的表達(dá)，而抑制 miR-204 則促進(jìn)成骨標(biāo)志物的表達(dá)，表明miR-204 的存在可負(fù)向調(diào)控VICs 成骨分化［44］，但此研究并未確定其靶基因，對(duì)其調(diào)控機(jī)制的解釋仍需補(bǔ)充。miRNAs在VICs成骨分化中的功能因其靶點(diǎn)差異而有所不同，揭示靶基因與成骨分化通路之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制有助于全面準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)miRNAs的作用，為進(jìn)一步防治CAVD提供新的線索。

此外，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）也參與VICs分化調(diào)控，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1（metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1，MALAT1）是一種在心血管系統(tǒng)中高表達(dá)的lncRNA，參與多種心血管疾病發(fā)生［45］。MALAT1在鈣化瓣膜以及VICs成骨分化模型中表達(dá)水平升高，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明MALAT1通過(guò)與miR-204的吸附作用抑制后者活性；Smad4 為 miR-204 的靶基因，Smad4 被抑制則阻礙VICs的成骨分化，MALAT1通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-204 來(lái)促進(jìn)Smad4 所介導(dǎo)的成骨分化，MALAT1、miR-204及其靶基因Smad4之間構(gòu)成的縱向調(diào)節(jié)軸可能是調(diào)控VICs 成骨分化的機(jī)制之一［46］。肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA 1（actin filamentassociated protein 1-antisense RNA 1，AFAP1-AS1）是另一種在鈣化瓣膜中存在高表達(dá)的lncRNA，它通過(guò)調(diào)節(jié)miR-155/Smad5 軸，增加Smad5 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)VICs向成骨表型分化［47］。此外，OPA相互作用蛋白5-反義RNA 1（OPA interacting protein 5-antisense RNA 1，OIP5-AS1）作為 lncRNA，與 miR-137 的結(jié)合可導(dǎo)致下游蛋白Twist1 水平升高，從而阻礙VICs成骨分化［48］。由此可見(jiàn)，lncRNAs通過(guò)類(lèi)似“分子海綿”的作用吸附miRNAs 后解除后者對(duì)其下游靶基因的抑制作用，增強(qiáng)靶基因的表達(dá)水平，而靶基因的具體功能將決定lncRNA 作為上游調(diào)控分子對(duì)VICs成骨分化產(chǎn)生何種影響。lncRNA、miRNA及其下游靶基因三者之間的調(diào)控機(jī)制為VICs 成骨分化、CAVD的防治開(kāi)辟了一個(gè)新的研究方向。

DNA 甲基化能夠通過(guò)抑制相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控，是一種重要的表觀遺傳調(diào)控方式［49］。Zhou 等［50］在鈣化瓣膜與 VICs 成骨誘導(dǎo)分化模型中發(fā)現(xiàn)Notch1蛋白水平降低，同時(shí)Notch1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平較高，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理VICs后 Notch1 細(xì) 胞 間 結(jié) 構(gòu) 域（Notch1 intercellular domain，NICD）水平上調(diào)，β-catenin 通路被抑制，細(xì)胞成骨分化趨勢(shì)減弱，Notch1 啟動(dòng)子甲基化則導(dǎo)致Wnt/β-catenin 途徑活化和成骨分化加劇，以上表明Notch 通路可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控Wnt/β-catenin 激活發(fā)揮抑制VICs成骨分化的作用。此外，lncRNA H19在鈣化瓣膜中呈高表達(dá)，其啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化水平，將H19 作用于VICs 成骨分化模型中，顯示過(guò)表達(dá)H19 促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，而敲低H19 則抑制成骨分化；進(jìn)一步分析表明，H19過(guò)表達(dá)可直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子p53蛋白水平降低，而p53作為Notch1表達(dá)的正向調(diào)控因子，其水平降低導(dǎo)致Notch1 表達(dá)減少，Notch通路被抑制，從而促進(jìn)VICs成骨表型分化［51］。Vander Roest等［52］發(fā)現(xiàn)老齡（78周齡）C57BL6小鼠的主動(dòng)脈瓣膜出現(xiàn)早期鈣化表現(xiàn)，但隨后的甲基化水平檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)其主動(dòng)脈H19的甲基化水平與幼齡（26周齡）小鼠之間存在顯著差異，表明H19甲基化水平改變可能并非促成瓣膜鈣化的始動(dòng)因素，其變化可能受其他因素調(diào)控。以上研究說(shuō)明VICs 成骨分化通路中的成員，尤其是位于通路上游的關(guān)鍵信號(hào)分子對(duì)調(diào)節(jié)VICs成骨分化具有重要作用，這些關(guān)鍵分子DNA 的異常甲基化水平對(duì)下游分子表達(dá)產(chǎn)生不同影響，因此表觀遺傳學(xué)調(diào)控也是VICs成骨分化研究中又一值得關(guān)注的領(lǐng)域。

綜上所述，VICs 向肌成纖維樣細(xì)胞或者成骨樣細(xì)胞分化過(guò)程受多種因素調(diào)控，而2 種分化過(guò)程在CVD 患者病變瓣膜中往往共存，提示兩者之間存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)，針對(duì)分化機(jī)制的研究還需將兩者加以聯(lián)系。目前，已有大量有關(guān)VICs 分化機(jī)制的研究為CVD 的防治提供了多方向的策略與藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，但VICs體外實(shí)驗(yàn)存在局限性，結(jié)合動(dòng)物疾病模型以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究可能有助于VICs分化機(jī)制的完善。另外，關(guān)于脫離瓣膜微環(huán)境后的人工培養(yǎng)VICs，如何全面準(zhǔn)確地再現(xiàn)其在體內(nèi)的分化過(guò)程對(duì)今后的研究也是一個(gè)挑戰(zhàn)。