連天星 劉罡 李林濤 尹愚 常山 屈波 楊子萱

隨著世界人口結(jié)構(gòu)改變，老齡化人口越來越多，骨關(guān)節(jié)炎(OA)、骨質(zhì)疏松(OP)、關(guān)節(jié)退行性變等與年齡密切相關(guān)的骨科疾病發(fā)病率也逐年上升[1]。到2050年，全球髖部骨折的患者可能達到450萬人，而髖部骨折多發(fā)生于老年骨質(zhì)疏松患者，其高致殘、致死率已成為臨床面臨的一大難題[2]。

目前骨科疾病的診斷方法依賴于X線、CT檢查及病理活檢，當上述疾病出現(xiàn)陽性檢查結(jié)果時，已有明顯的器質(zhì)性損害。鑒于疾病進展過程中代謝異常比形態(tài)改變出現(xiàn)更早，快速獲取準確且全面的代謝物質(zhì)信息是目前診斷或篩查方法改進和創(chuàng)新的方向，其可以滿足早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的預(yù)防目標。

拉曼光譜檢測是一種高靈敏度、非破壞性的光學探測技術(shù)，當激光照射在樣本上時，樣本中的分子被激發(fā)出現(xiàn)更高的振動或轉(zhuǎn)動能級，并產(chǎn)生拉曼散射，該技術(shù)記錄了此樣本全部生化信息如蛋白質(zhì)、核酸及脂類等[3]。由于只需少量樣本、耗時短、精度高、不需要標記且不會破壞樣本原有性質(zhì)，拉曼光譜技術(shù)已成為多個領(lǐng)域的重要研究技術(shù)[4-5]。

1 拉曼光譜技術(shù)簡介

當光束與分子相互作用時，能量大多以與入射光相同的頻率進行彈性散射，稱為瑞利散射。少數(shù)入射光激發(fā)分子振動發(fā)生能量交換而出現(xiàn)非彈性散射，這種現(xiàn)象在1928年被印度科學家Raman發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)稱為拉曼散射。其中波長增加的光稱為斯托克斯光，波長減少的光稱為反斯托克斯光。入射前后的光子能量差異對應(yīng)于激發(fā)特定分子振動所需的能量，不同的波段對應(yīng)不同官能團的振動頻率，因此每個分子都有獨特的光譜，稱之為“指紋”[6]。根據(jù)拉曼散射原理，現(xiàn)已有超過25種不同類型的拉曼光譜技術(shù)應(yīng)運而生，目前常用拉曼光譜包括受激拉曼光譜、相干反斯托克斯拉曼光譜、表面增強拉曼光譜和尖端增強拉曼光譜等。

由于拉曼光譜技術(shù)可對分子大小的物質(zhì)進行探測，該技術(shù)具有監(jiān)測細胞代謝過程中物質(zhì)改變、快速定量檢測樣本中關(guān)鍵物質(zhì)的潛力，并可實時反映疾病動態(tài)演變和治療效果。

2 拉曼光譜技術(shù)在骨科疾病中的應(yīng)用

由于拉曼光譜技術(shù)具有快速、準確、樣本需要量小等特點，目前學者們應(yīng)用該技術(shù)研究引起骨科疾病的各種代謝物質(zhì)，并探討以此進行疾病早期篩查或診斷的可能性。學者們對細胞[7-8]、血液[9]、尿液[10-11]、關(guān)節(jié)液[12-14]、韌帶[15]、指甲[16-17]和骨組織[18-19]進行大量研究，發(fā)現(xiàn)各種疾病具有特有的代謝改變，因此光譜檢測數(shù)據(jù)結(jié)合多種優(yōu)秀算法建立診斷模型能快速實現(xiàn)疾病篩查、診斷和分期。

2.1 關(guān)節(jié)疾病

OA是一種關(guān)節(jié)軟骨退行性變及繼發(fā)性骨質(zhì)增生的慢性關(guān)節(jié)疾病，好發(fā)于老年患者大關(guān)節(jié)。在60歲以上的老年人中，男性患病率約10%，女性患病率約18%[20]。目前OA診斷依賴于X線檢查，CT和MRI檢查常用于鑒別診斷，而實驗室檢查指標一般在正常范圍內(nèi)[21]。當影像學表現(xiàn)滿足診斷標準時，患者已有明顯的器質(zhì)性改變[22]，因此探索出能盡早發(fā)現(xiàn)疾病初期病理變化的檢查方法是臨床急需解決的問題。

關(guān)節(jié)滑液是關(guān)節(jié)軟骨代謝、物質(zhì)交換場所，對關(guān)節(jié)滑液進行拉曼光譜檢測有助于發(fā)現(xiàn)OA早期代謝改變。朱永康等[12]構(gòu)建早期OA犬模型，抽取關(guān)節(jié)液進行拉曼光譜檢測，早期OA組光譜在901 cm-1(透明質(zhì)酸)、944 cm-1(透明質(zhì)酸/糖胺聚糖)、1 070 cm-1(硫酸多糖)、1 126 cm-1(吡喃糖環(huán)/透明質(zhì)酸)等多糖譜帶處信號強度比健康組明顯增強，提示多糖成分在OA早期就出現(xiàn)變化，軟骨內(nèi)部代謝異常早于結(jié)構(gòu)改變。Bocsa等[13]將OA患者分為低度和高度損傷，對關(guān)節(jié)滑液進行拉曼光譜檢測，自發(fā)拉曼光譜檢測和表面增強拉曼光譜檢測分別顯示兩組胡蘿卜素和苯丙氨酸出現(xiàn)差異，拉曼光譜檢測結(jié)合主成分分析(PCA)-線性判別分析(LDA)對兩類人群進行分類，準確率達到100%，證明拉曼光譜檢測可以捕捉到OA患者關(guān)節(jié)滑液中的物質(zhì)變化。拉曼光譜檢測對滑膜型關(guān)節(jié)炎同樣有較高的診斷準確率。董弦虎等[14]對滑膜型關(guān)節(jié)炎患者和健康人關(guān)節(jié)液進行實驗，表面增強拉曼光譜檢測顯示，滑膜型關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中多糖、DNA、鳥嘌呤等高于健康人，而糖原、磷脂酰肌醇、蛋白酪氨酸、葡萄糖等低于健康人，表面增強拉曼光譜檢測結(jié)合PCA-LDA的診斷靈敏度為80%，特異度為83.3%，顯示了該技術(shù)快速、高效檢測和區(qū)分關(guān)節(jié)炎患者的能力。

拉曼光譜檢測時間短，小型拉曼光譜儀只有鞋盒大小，很容易在常規(guī)診室中使用，因此臨床上有可能在標準的接診時間內(nèi)獲得患者關(guān)節(jié)液的成分信息，從而快速診斷骨與關(guān)節(jié)疾病。

2.2 OP

OP是骨科常見疾病，我國流行病學顯示50歲以上女性約20.7%患有OP，男性約14.4%患有OP，60歲以上患病率顯著升高[23]。OP與年齡密切相關(guān)[24]，所以必須加強對危險人群的早期篩查與識別。雙能X線吸收儀(DXA)是目前診斷OP的金標準，但由于其具有設(shè)備成本高、屬于輻射性檢查、檢測費用昂貴等問題，很難成為普惠性的篩查技術(shù)，所以尋找方便快捷、無輻射且基于OP早期代謝改變的篩查方法備受關(guān)注。

脆性骨折是OP的嚴重并發(fā)癥，骨骼抗骨折能力并不完全取決于骨密度，礦化程度、膠原組織、皮質(zhì)孔隙度等同樣會影響骨骼斷裂韌性。Paolillo等[18]對去卵巢OP大鼠股骨進行拉曼光譜檢測，發(fā)現(xiàn)OP組碳酸鹽/磷酸鹽值在長期絕經(jīng)后顯著增加。Ishimaru等[19]對切斷坐骨神經(jīng)的廢用性O(shè)P小鼠脛骨進行實驗，發(fā)現(xiàn)OP組碳酸鹽/磷酸鹽值較高，礦物/基質(zhì)值也明顯高于對照組。礦化水平過度增加，骨骼硬度增加，可能提高脆性，導(dǎo)致骨折風險增加，拉曼光譜檢測可全面闡明骨組織中礦物質(zhì)和基質(zhì)成分變化，是一種有前景的OP篩查工具。但臨床上對OP患者骨組織進行拉曼光譜檢測較為困難，所以尋找能替代骨組織的樣本，從而研究微創(chuàng)或無創(chuàng)的拉曼光譜檢測方法是未來的發(fā)展方向。

由于OP是一種全身性骨代謝異常疾病，指甲成分可能可為了解骨骼的健康狀況提供有價值的信息。Beattie等[16]對OP患者指甲進行拉曼光譜檢測，發(fā)現(xiàn)OP組指甲中角蛋白的二級結(jié)構(gòu)β-折疊比例升高，且有較多酸性基團被電離，這些基團對于形成骨礦物質(zhì)和骨膠原支架至關(guān)重要。人類指甲和骨骼中的蛋白質(zhì)需要硫酸化和二硫鍵形成來保證結(jié)構(gòu)的完整性。Towler等[17]研究發(fā)現(xiàn)，OP性骨折患者指甲二硫化物含量低于健康人，提示指甲中的二硫化物可作為骨組織中相關(guān)結(jié)構(gòu)基質(zhì)蛋白的替代標記物。然而，不同個體的指甲物理化學性質(zhì)和生長速度差異較大，限制了通過指甲測量骨礦含量及評估骨骼健康的應(yīng)用[25]。

骨代謝標志物存在于血液中，部分通過尿液排出，對尿液進行檢測，一定程度上可以反應(yīng)骨代謝是否正常。有研究對OP患者尿液進行拉曼光譜研究，發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)后婦女中骨量異常組與骨量正常組在723 cm-1、786 cm-1、1 000 cm-1處信號強度有統(tǒng)計學差異，拉曼光譜檢測結(jié)合PCA-LDA分析診斷OP總體準確度為79.3%，診斷骨量減少總體準確度為78.2%[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病患者中，骨量異常組與骨量正常組在1 377 cm-1、1 525 cm-1處拉曼光譜強度存在顯著性差異，此處代表物質(zhì)為脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，這與血液中膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白升高相一致，認為拉曼光譜檢測診斷骨量異常的靈敏度為65.5%，特異度為90%[10]。

拉曼光譜檢測是評估OP患者骨質(zhì)量和預(yù)測骨折風險的重要分析工具，且能提供豐富的關(guān)于骨材料特性和結(jié)構(gòu)的獨特信息，可以對OP患者各種組織成分和結(jié)構(gòu)變化進行分析，有助于進一步了解發(fā)病機制，評估骨折風險，并對骨量異?；颊哌M行初步篩查。由于OP是一種骨代謝疾病，大部分代謝物質(zhì)經(jīng)過血液循環(huán)，其中Ⅰ型前膠原氨基端前肽和β-膠原降解產(chǎn)物是國際骨質(zhì)疏松基金會推薦評估骨轉(zhuǎn)換水平的參考指標，若后續(xù)研究能針對患者血液樣本進行拉曼光譜檢測，發(fā)現(xiàn)更多與OP相關(guān)的代謝物質(zhì)，OP診斷或篩查準確率將得到進一步提高，從而使拉曼光譜檢測有望成為OP新的篩查手段。

2.3 骨腫瘤

骨轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最常見的并發(fā)癥之一，乳腺癌和前列腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)病率在65%以上[26]。腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥患者生活質(zhì)量下降的主要原因，且目前監(jiān)測腫瘤早期發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的能力有限。由于拉曼光譜檢測實時、精確的分子特性，它具備評估和量化早期發(fā)生骨轉(zhuǎn)移所引起的生化改變的能力。

乳腺癌通常會轉(zhuǎn)移至骨，并破壞骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而引起溶骨改變。Zhang等[27]對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠與正常小鼠的股骨和椎體進行拉曼光譜分析，結(jié)果顯示骨轉(zhuǎn)移組碳酸鹽取代、整體礦化及結(jié)晶度都呈增加趨勢，拉曼光譜檢測結(jié)合支持向量機開發(fā)算法診斷股骨腫瘤轉(zhuǎn)移準確率達到93.6%。這證明拉曼光譜檢測能識別腫瘤早期轉(zhuǎn)移部位和礦物變化，這種變化可能在骨骼形態(tài)改變之前就已存在，但目前尚缺乏完全無創(chuàng)的拉曼光譜檢測評估方法是限制其臨床應(yīng)用的主要問題。除了在骨組織中能檢測到腫瘤引起的礦物改變外，在不同的腫瘤細胞中也存在結(jié)構(gòu)差異。Marro等[8]對傾向于骨轉(zhuǎn)移的MDA-MB231和傾向于肺轉(zhuǎn)移的MDA-MB435乳腺癌細胞進行拉曼光譜分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸水平升高和線粒體水平降低是骨轉(zhuǎn)移細胞的特征，而肺轉(zhuǎn)移的細胞則以高脂質(zhì)和高線粒體水平為特征。

骨是前列腺癌通過血液途徑進行遠處轉(zhuǎn)移的最常見部位。Shao等[9]收集前列腺癌伴骨轉(zhuǎn)移和不伴骨轉(zhuǎn)移患者的血清并進行表面增強拉曼光譜檢測，發(fā)現(xiàn)卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合表面增強拉曼光譜檢測篩查骨轉(zhuǎn)移患者準確率為81.70%。表面增強拉曼光譜檢測血清可對前列腺癌、前列腺增生患者和健康人進行分類[28]，證明拉曼光譜檢測可能成為補充實驗室診斷并監(jiān)測前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的有效手段。

骨肉瘤是一種最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，全世界每年發(fā)病率約1～3/100萬，發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者5年生存率約20%[29]。骨肉瘤分級依賴于傳統(tǒng)的組織病理學，既耗時又需要一定數(shù)量的腫瘤標本，如何在術(shù)中快速、準確地判斷腫瘤惡性程度是亟待解決的問題。Chiang等[7]對高級別骨肉瘤細胞143B、SaOS2和低級別骨肉瘤細胞MG-63進行拉曼光譜檢測，不同惡性程度的細胞在960 cm-1(羥基磷灰石)處光譜強度有顯著性差異，提示羥基磷灰石水平與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)。拉曼光譜檢測是區(qū)分不同級別腫瘤細胞的潛在精確且靈敏的方法，有助于骨肉瘤或其他病理組織快速診斷。

2.4 韌帶疾病

韌帶在限制各個關(guān)節(jié)過度活動、維持全身骨骼穩(wěn)定等方面起著至關(guān)重要的作用。前交叉韌帶(ACL)位于膝關(guān)節(jié)內(nèi)，可限制脛骨過度前移，維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定。ACL損傷將會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，甚至OA發(fā)生[30]。目前診斷韌帶損傷主要依賴于MRI檢查，但該方法只能識別較為明顯的韌帶斷裂或黏液樣變性，觀察微觀結(jié)構(gòu)成分仍需要組織病理學分析。Matsunaga等[15]收集退變的ACL樣本進行拉曼光譜檢測，認為拉曼光譜檢測能清楚識別退變早期和晚期細胞、膠原、磷脂等物質(zhì)的差異，結(jié)合基于LDA建立的算法，對兩者分類準確率達到了91%，該技術(shù)使保留韌帶前提下研究其成分改變并診斷退變程度成為可能。

3 結(jié)語

目前對骨科眾多疾病的早期篩查或診斷技術(shù)的研究尚處于初級階段，在開展早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的實踐過程中，應(yīng)結(jié)合現(xiàn)有的先進科學技術(shù)，基于疾病發(fā)病機制進行研究。由于拉曼光譜技術(shù)對物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)的研究展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，有望在形態(tài)學還沒發(fā)生改變之前找到疾病在分子水平上的特征性改變。拉曼光譜檢測作為一種新技術(shù)可補充現(xiàn)有醫(yī)學上的不足，為醫(yī)學與工程技術(shù)結(jié)合提供廣闊的舞臺?？紤]到臨床實際應(yīng)用，對拉曼光譜檢測還應(yīng)進行更多的臨床試驗，開發(fā)更為先進的無損檢測技術(shù)，建立并優(yōu)化診斷模型，使之成為標準的臨床檢測技術(shù)。