沈仕君

對大多數(shù)多細胞動物來說，新生命起源于生殖細胞——精子和卵子，它們通過受精作用將遺傳信息從上一代傳遞到下一代，以維持種群的延續(xù)。精子和卵子都來自一類特殊的細胞——原始生殖細胞，它們是動物個體在胚胎發(fā)育過程中最先產(chǎn)生的生殖細胞群體，也是未來成熟精子或卵子的發(fā)源地。原始生殖細胞如果出現(xiàn)問題，將直接影響生殖細胞的發(fā)育、后代的健康，甚至種群的延續(xù)。所以，研究原始生殖細胞的命運決定尤為重要。

基本發(fā)育路線

以小鼠為例，原始生殖細胞的基本發(fā)育路線大致可分為4個階段（特化——遷移——增殖——分化）。

具體來說：在小鼠懷孕后大約7.25天（E7.25），早期胚胎中的一群細胞（約40個）會被誘導形成早期狀態(tài)的原始生殖細胞（即特化）；隨著胚胎發(fā)育，這些細胞將最終遷移進入生殖嵴中，這里是未來形成生殖器官的地方；一直到小鼠懷孕后大約13.5天（E13.5），原始生殖細胞都在生殖嵴中不斷分裂增殖；13.5天以后，原始生殖細胞開始雌雄分化，雌性原始生殖細胞在13.5天后迅速進行減數(shù)分裂，并最終停滯在第二次減數(shù)分裂時期等待受精（即卵子初步形成），而雄性原始生殖細胞則進入發(fā)育停滯階段，直到出生后才會進行減數(shù)分裂，形成成熟的精子[1]。

原始生殖細胞的高通量研究歷程

在很長一段時間，有關(guān)原始生殖細胞發(fā)育過程的研究結(jié)果大多來自形態(tài)學研究和少量特定基因的探索。隨著21世紀基因組測序計劃的完成和二代測序技術(shù)的興起，對于原始生殖細胞的觀察和研究已不再局限于低通量單個基因的研究，高通量研究開始成為一種新的趨勢。

在高通量研究中，科學家們首先選擇的突破口是轉(zhuǎn)錄組，因為它可以從全局范圍上反映所有基因的最終表達情況，直觀展示原始生殖細胞的分子生物學特征。目前科學家們已經(jīng)成功繪制小鼠原始生殖細胞各個階段的轉(zhuǎn)錄組圖譜（PRJNA214836），鑒定出原始生殖細胞發(fā)育過程中的諸多關(guān)鍵基因，如Blimp1、Prdm14、Tfap2c等，同時揭示了這些基因的動態(tài)表達模式，為深入研究原始生殖細胞發(fā)育中的基因調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

然而，由于轉(zhuǎn)錄組圖譜是眾多基因調(diào)控的最終結(jié)果，并不能及時反映上游的基因調(diào)控情況，所以僅僅依靠轉(zhuǎn)錄組來揭示細胞命運是不夠精確的。于是，科學家們轉(zhuǎn)而選擇從表觀基因組的角度對原始生殖細胞的命運進行更精準的研究。其實“表觀遺傳學”這一名詞由來已久，早在20世紀40年代，發(fā)育生物學和遺傳學家沃丁頓（C. Waddington）就提出了這一概念。形象地說，染色體DNA就像一本龐大的“百科全書”，而表觀遺傳學則是指導人們?nèi)绾稳ラ喿x這本“書”。

目前，科學家們已成功繪制出小鼠原始生殖細胞中的全基因組DNA甲基化圖譜（一種典型的表觀遺傳學研究方向）[2]。他們發(fā)現(xiàn)，在原始生殖細胞發(fā)育過程中會經(jīng)歷一次徹底的全基因組范圍的DNA甲基化清除過程，全基因組DNA甲基化水平最低時只有4%～5%。而隨后在形成精子和卵子的過程中，基因組的DNA甲基化又將重新建立。這種清除親代表觀遺傳信息，再為子代建立新的表觀遺傳信息的過程，對于維持種群的多樣性和環(huán)境適應(yīng)性是至關(guān)重要的。

染色質(zhì)開放狀態(tài)

相較于表觀遺傳學眾多的研究方向來說，目前對于原始生殖細胞的研究進展只局限于DNA甲基化這一方向，而對于原始生殖細胞發(fā)育過程中的染色質(zhì)動態(tài)變化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究更是鮮有報道。究其原因，主要是由于原始生殖細胞的數(shù)量過于稀少，在研究技術(shù)上存在瓶頸。早期的原始生殖細胞數(shù)量只有幾十個，到小鼠懷孕12.5天以后也不過是數(shù)萬個。而常規(guī)的高通量表觀遺傳學研究手段大多需要百萬級別的細胞數(shù)量才能獲得較好的實驗數(shù)據(jù)。因此，亟需開發(fā)基于微量細胞的高通量表觀遺傳學研究方法，以進一步對原始生殖細胞的命運進行探索。

2018年，有科學家開發(fā)了基于微量DNA的限制性內(nèi)切酶I （DNase I）建庫測序（Low-input DNase-seq）技術(shù)[3]，該方法通過減少反應(yīng)步驟和容器置換次數(shù)，配合建庫后切膠再回收策略，在微量細胞（最少可以達幾百個）中極大提升了測序效果。利用此項技術(shù)，他們首次在小鼠和人的原始生殖細胞中觀察到全基因組范圍的染色質(zhì)開放圖譜，極大地豐富了原始生殖細胞中的表觀遺傳研究類型。

科學家們進一步以不同樣本中特異的染色質(zhì)開放位點為依據(jù)，成功繪制出原始生殖細胞的發(fā)育路徑[3]。他們發(fā)現(xiàn)雖然原始生殖細胞的發(fā)育路徑在性別上有著明顯的差異，但其發(fā)育方向卻是趨同的，這體現(xiàn)了生物體發(fā)育過程中“和而不同”的特點。同時，科學家們還專門對全局范圍的染色質(zhì)開放圖譜與轉(zhuǎn)錄組圖譜進行了系統(tǒng)的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用染色質(zhì)開放狀態(tài)進行細胞命運預測要比轉(zhuǎn)錄組準確得多，這進一步驗證了染色質(zhì)開放狀態(tài)在研究細胞命運調(diào)控上的優(yōu)勢。

除了能宏觀地描繪整個發(fā)育路徑外，染色質(zhì)開放狀態(tài)研究還能從微觀上揭示關(guān)鍵調(diào)控蛋白的潛在DNA結(jié)合位點，從而揭示發(fā)育過程中的基因調(diào)控細節(jié)。而為了實現(xiàn)這一目標，科學家們需要找到染色質(zhì)開放區(qū)域富集的基序，即模體，是染色質(zhì)上出現(xiàn)的獨特DNA序列片段，具有較強的特異性，可以被染色質(zhì)開放探測技術(shù)所捕獲，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子蛋白潛在的結(jié)合位點。

全基因組同源重組位點探測

減數(shù)分裂與同源重組

對于多細胞生物來說，細胞分裂有兩種關(guān)鍵類型：有絲分裂和減數(shù)分裂。其中，減數(shù)分裂與生殖細胞的產(chǎn)生密切相關(guān)。減數(shù)分裂的全過程可大致劃分為4個階段：間期Ⅰ、減數(shù)分裂Ⅰ、間期Ⅱ和減數(shù)分裂Ⅱ。其中減數(shù)分裂Ⅰ尤為重要，因為其間會發(fā)生一個重要的生物學事件——同源染色體聯(lián)會，最終會使每對染色體形成一個緊密相伴的二價體，又稱四分體。每條染色體的兩條染色單體之間稱為姐妹染色單體，同源染色體的不同染色單體之間稱為非姐妹染色單體。同源染色體聯(lián)會后，非姐妹染色單體的之間可發(fā)生片段互換，即交換，從而使得同源染色體之間的基因產(chǎn)生部分重新組合，即重組。整個過程統(tǒng)稱為同源重組，交換染色體的位點就稱為同源重組熱點[4]。

同源重組過程使生殖細胞在繼承父母源基因的同時，又能使子代通過染色體片段交換獲得新的性狀，從而豐富DNA的多樣性。形象地說，這是一次生殖細胞的基因“大洗牌”，后代將擁有更多可能的基因組合。當然，凡事總有兩面，雖然從基因組入手豐富性狀是非常經(jīng)濟實惠的一種方法，但它也帶來了一定的風險。由于同源重組涉及DNA斷裂再修復的過程，一旦出現(xiàn)錯誤極易引起出生缺陷，所以科學家們一直致力于探尋同源重組過程背后的機制。

同源重組過程的分子機制研究

隨著對同源重組的深入理解，有關(guān)同源重組過程的研究也逐漸進入分子生物學層面。2012年，科學家們發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶PRDM9會在需要發(fā)生同源重組的位點附近標記特定的組蛋白修飾信號（H3K4me3，組蛋白第三亞基四號賴氨酸的三甲基化），這個信號會引導蛋白機器在這些指定位點進行雙鏈斷裂，為同源重組做準備[5]。而如果將PRDM9蛋白敲除，蛋白機器就會選擇其他帶有H3K4me3標記的位點進行雙鏈斷裂。而那些區(qū)域往往是啟動子等具有重要生物學功能的地方。這樣異常的操作不僅不能實現(xiàn)豐富DNA多樣性的目的，反而還會造成基因的損壞，是極其危險的。因此，PRDM9蛋白在同源重組中具有不可替代的作用。而科學家們恰好在晚期雌性原始生殖細胞的染色質(zhì)開放信號中發(fā)現(xiàn)了屬于PRDM9的特異基序[3]，這說明PRDM9蛋白可能在這一時期發(fā)揮著調(diào)控同源重組的功能。

那么PRDM9蛋白的基序為何特異出現(xiàn)在晚期雌性原始生殖細胞中，而晚期雄性原始生殖細胞中則沒有呢？這就涉及雄性和雌性同源重組發(fā)生時期的重大差異。以小鼠為例，雄性生殖細胞一般在出生后（大約產(chǎn)后12天）才進行同源重組，而雌性生殖細胞一般在出生前（大約懷孕后14.5天）進行同源重組[1]。所以當雌性生殖細胞發(fā)生同源重組時，雄性生殖細胞離同源重組開始還有很長一段時間。

此外，這種時期不同步現(xiàn)象也造成了有關(guān)雌性和雄性生殖細胞研究進展的巨大差距。正因為雄性生殖細胞可以在出生后獲得，取材相對容易，所以對于雄性生殖細胞的同源重組分析已經(jīng)拓展到全基因組位點的高通量研究。早在2012年和2016年，科學家們就曾利用同源重組中兩個至關(guān)重要的蛋白DMC1和SPO11，實現(xiàn)了雄性生殖細胞全基因組同源重組熱點的探測[6，7]。而對于雌性生殖細胞而言，由于在其出生前還處于原始生殖細胞階段，取材困難且細胞數(shù)量較少，尚沒有很好的關(guān)于其同源重組位點的全基因組范圍的報道。

基于染色質(zhì)開放狀態(tài)的全基因組同源重組位點探測

那么有沒有機會在雌性生殖細胞的同源重組研究上再進一步呢？目前已知：①雌性生殖細胞同源重組發(fā)生的時期是晚期雌性原始生殖細胞階段；②晚期雌性原始生殖細胞的染色質(zhì)開放信號中富集著PRDM9蛋白的基序；③同源重組過程中伴隨著DNA雙鏈斷裂，而這種裸露的DNA恰好是限制性內(nèi)切酶I（DNaseI）所青睞的區(qū)域。似乎這些證據(jù)都在暗示利用染色質(zhì)開放信號可以在全基因組范圍探測雌性生殖細胞的同源重組位點。那么事實是否如此呢？

科學家們通過大量實驗計算發(fā)現(xiàn)，利用Lowinput DNase-seq技術(shù)所得到的DNaseI超敏感位點（DNase I hypersensitive site， DHS，可代表染色質(zhì)開放程度較高的區(qū)域），配合同源重組過程中重要蛋白的已知全基因組坐標，如PRDM9、 DMC1等，可以很好地探測到雌性生殖細胞中全基因組范圍內(nèi)的同源重組位點[3]。同時，科學家們通過小鼠品系特異性證明實驗、DNaseI超敏感位點與同源重組熱點對應(yīng)證明實驗等，確認了上述探測方法的可靠性和高檢出效率。

此外，已知PRDM9蛋白會在同源重組過程中為即將進行雙鏈斷裂的基因位點標記組蛋白修飾信號H3K4me3。研究發(fā)現(xiàn)，在同源重組之前（E13.5），同源重組熱點上幾乎沒有H3K4me3信號，而只有當發(fā)生同源重組的時候（E14.5），同源重組熱點上才會迅速建立H3K4me3信號。該結(jié)果很好地建立了遺傳物質(zhì)交換和表觀遺傳調(diào)控的相關(guān)性，進一步強化了PRDM9蛋白在同源重組過程中的重要性。

對原始生殖細胞的染色質(zhì)開放狀態(tài)進行研究，不僅豐富了有關(guān)原始生殖細胞的研究類型和實驗方法，展現(xiàn)了整體發(fā)育過程中的諸多變化，同時也揭示了諸如同源重組等關(guān)鍵生物學事件的機制細節(jié)。其中，對于雌性原始生殖細胞全基因組同源重組位點的鑒定尤其具有重要意義，研究人員只需要1只胎鼠即可完成實驗，實現(xiàn)了個體水平上的位點檢測，而2018年其他研究者利用傳統(tǒng)方法操作時則需要約300只胎鼠才能完成實驗[8]。顯然，利用染色質(zhì)開放狀態(tài)的實驗策略更具推廣價值，特別是在人雌性原始生殖細胞樣本更難獲得的情況下。

關(guān)于原始生殖細胞還有很多未解之謎，但生命科學技術(shù)也同時在高速發(fā)展，期待在不久的將來，該領(lǐng)域會涌現(xiàn)更多新的探索成果。

[1]Saitou M， Yamaji M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor perspectives in biology， 2012， 4.

[2]Kobayashi H， Sakurai T， Miura F， et al. High-resolution DNA methylome analysis of primordial germ cells identifies genderspecifi c reprogramming in mice. Genome research， 2013， 23： 616-627.

[3]Li J， Shen S， Chen J， et al. Accurate annotation of accessible chromatin in mouse and human primordial germ cells. Cell Research， 2018.

[4]Baudat F， Imai Y， de Massy B. Meiotic recombination in mammals： localization and regulation. Nature reviews Genetics， 2013， 14： 794-806.

[5]Brick K， Smagulova F， Khil P， et al. Genetic recombination is directed away from functional genomic elements in mice. Nature， 2012， 485： 642-645.

[6]Khil P P， Smagulova F， Brick K M， et al. Sensitive mapping of recombination hotspots using sequencing-based detection of ssDNA. Genome research， 2012， 22： 957-965.

[7]Lange J， Yamada S， Tischfi eld S E， et al. The landscape of mouse meiotic double-strand break formation， processing， and repair. Cell， 2016， 167： 695-708 e616.

[8]Brick K， Thibault-Sennett S， Smagulova F， et al. Extensive sex diff erences at the initiation of genetic recombination. Nature， 2018， 561： 338-342.

關(guān)鍵詞：原始生殖細胞 染色質(zhì)開放狀態(tài) 同源重組 ■