王蒙蒙，張香宇，張 露，徐曉敏，王 琦，王長有，吉萬全,2，張 宏,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊陵 712100；2.農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制陜西科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，陜西楊凌 712100)

表皮毛是由表皮細(xì)胞發(fā)育而來，是植物表皮組織的一種特化結(jié)構(gòu)，可增加表皮層厚度，減少水分、熱量的散失，也會分泌某些化學(xué)物質(zhì)來防御病蟲、微生物的侵害，對植物生長發(fā)育具有重要保護(hù)作用[1-2]。表皮毛被認(rèn)為是研究植物細(xì)胞分化調(diào)控的理想模型[3]，同時(shí)也具有抗蟲、抗病、抗逆等功能[4]。因此，研究與植物表皮毛相關(guān)的基因不僅為細(xì)胞分化和植物發(fā)育提供參考，對小麥遺傳改良及育種工作也具有借鑒意義[5]。

近年來，隨著擬南芥表皮毛發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究的不斷深入，多個(gè)參與調(diào)控植物表皮毛發(fā)育的相關(guān)基因已被報(bào)道，如GL1[6]、TTG1[7]、GL3[8]、TTG2[9]和GL2[10]。其中，GL1是第一個(gè)被克隆到的與表皮毛發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因，其增強(qiáng)子序列對基因發(fā)揮功能具有重要作用[11]。研究表明，表皮毛細(xì)胞發(fā)育與其他形態(tài)建成類似，是一個(gè)嚴(yán)格受時(shí)空調(diào)控的過程，需要不同的轉(zhuǎn)錄因子相互作用完成[12-13]。GeBP(GLABROUS1-enhancer binding protein)型轉(zhuǎn)錄因子作為其中轉(zhuǎn)錄因子之一，通過識別并結(jié)合GL1基因增強(qiáng)子來調(diào)控GL1基因的表達(dá)，進(jìn)而控制表皮毛的生成[14]。GeBP是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[15]，截至目前，除了擬南芥、水稻等模式植物外，番茄中亦有GeBP轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道[14,16]，但在小麥中還未見到GeBP轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)報(bào)道。

擬南芥中GeBP轉(zhuǎn)錄因子是一種具有DNA結(jié)合活性的核蛋白，主要在葉原基、分生組織以及維管組織中表達(dá)[15]，GPL1、GPL2、GPL3在內(nèi)的GeBP/GPLs家族成員都含有保守中央?yún)^(qū)域和亮氨酸拉鏈C端區(qū)域，并且在體內(nèi)可形成二聚體[17]，但目前其功能未知。前人研究發(fā)現(xiàn)，GeBP蛋白與CPR5(Pathogenis-related gene 5)蛋白存在一定的聯(lián)系，暗示GeBP基因發(fā)揮其功能可能與CPR5基因有關(guān)[18]。CPR5是一個(gè)多效性基因，在細(xì)胞壁代謝[19]、細(xì)胞增殖[20]、細(xì)胞衰老[21]、細(xì)胞死亡[22]、植物抗病性[23-24]方面中發(fā)揮重要功能，而GeBP可通過調(diào)節(jié)CPR5基因來發(fā)揮作用[18]。此外，遺傳學(xué)分析也表明，GeBP發(fā)揮自身功能在一定程度上依賴于CPR5[18]。在病菌脅迫過程中，CPR5是調(diào)控植物細(xì)胞防御的重要因子之一[25]。Perazza等[18]對gebp gpl1,2,3缺失突變體轉(zhuǎn)錄組結(jié)果數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，GeBP/GPLs和CPR5轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)存在部分重疊，CPR5通路中發(fā)現(xiàn)了大量的GeBP/GPLs依賴基因，GeBP/GPLs基因控制著CPR5調(diào)控的部分基因，作用于CPR5通路下游，GeBP/GPLs的功能雖是CPR5功能的一個(gè)子集，但GeBP/GPLs和CPR5之間的轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)、表型和遺傳關(guān)系均表明，兩者參與了類似的過程。例如，gebp gpl1,2,3缺失突變體、VP16:GPL2過表達(dá)突變體、cpr5缺失突變體這三個(gè)株系接種丁香假單胞菌(Pseudomonassyringaepvtomato)DC3000后，三個(gè)株系中病原體的生長量較對照組野生型均明顯下降，說明有關(guān)基因激活了病原體的應(yīng)答通路，抑制病原體的入侵，并且gebp gpl1,gebp gpl2,gebp gpl3缺失突變體和VP16:GPL2過表達(dá)突變體株系中病原菌應(yīng)答標(biāo)記基因PR1和PR5的轉(zhuǎn)錄水平也高于對照組野生型，表明GeBP/GPLs是PR基因的抑制因子，由此也證明GeBP轉(zhuǎn)錄因子在病原菌防御途徑中發(fā)揮著一定作用[18]。

本課題組前期對小麥自發(fā)斑點(diǎn)細(xì)胞壞死RILs(N13039H/N)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，GeBP同源基因在兩個(gè)不同材料中的表達(dá)水平差異顯著[26]。鑒于小麥GeBP家族轉(zhuǎn)錄因子參與生物、非生物脅迫以及對病原菌的抵抗防御反應(yīng)尚不清楚，因此，本研究克隆了小麥中一個(gè)GeBP類基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、表達(dá)特性分析以及酵母轉(zhuǎn)錄激活活性驗(yàn)證，以期為研究小麥GeBP家族基因功能提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料西農(nóng)N13039H、抗白粉病近等基因系N9134R、感白粉病近等基因系N9134S、本氏煙草(Nicotianabenthamiana)以及小麥白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici，Bgt)E09菌株均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.2 材料處理

將均勻一致、成熟飽滿的N9134R和N9134S籽粒種于盆中，置于20 ℃/12 ℃(光照16 h/黑暗8 h)人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待小麥長至兩葉一心期時(shí)，接種E09菌株。在接種0、12、24、36、48和72 h后分別取適量葉片提取RNA，置-80 ℃保存。

1.3 基因組DNA、總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

利用Trizol法[27]提取西農(nóng)N13039H、抗白粉病近等基因系N9134R、感白粉病近等基因系N9134S各樣品的總RNA。用PrimeScriptTMⅡ 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa，大連)合成cDNA第一鏈。

1.4 目的基因的克隆

根據(jù)自發(fā)斑點(diǎn)細(xì)胞壞死RILs(N13039H/N)的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，利用Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(http://plants.enseml.org/index.html)將搜索到的候選基因(TraesCS3D02G037800)序列為參考序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)3D染色體上目標(biāo)基因特異引物TaGeBPL-F/R(表1)，并以西農(nóng)N13039H cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，38個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將與預(yù)期片段長度一致的目的條帶回收、純化，使用DNA連接酶將目標(biāo)片段插入pMD19-T載體(TaKaRa，大連)，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。平板過夜后，利用菌落PCR檢測陽性單克隆并測序驗(yàn)證。測序由奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

表1 本研究用到的引物信息Table 1 Primers used in the study

1.5 生物信息學(xué)分析

通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)和Ensembl Plants中BLAST程序?qū)aGeBPL基因的核酸序列及氨基酸序列進(jìn)行比對；用ExPASy(http://web.Expasy.org/protparam/)對TaGeBPL蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive/CKkukm/models/)對蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；用TMpred(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)進(jìn)行跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測；用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)和NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)對蛋白的親疏水性和磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；用Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件；用cNLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)和Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2)預(yù)測編碼蛋白的核定位信號和亞細(xì)胞定位；用MEME Suite(http://meme-suite.org/index.html)分析氨基酸保守motif；用NCBICD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；用MEGA 7.0軟件，采取最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000。

1.6 TaGeBPL基因的表達(dá)分析

1.7 亞細(xì)胞定位

1.8 酵母轉(zhuǎn)錄自激活活性驗(yàn)證

與GFP同源重組引物設(shè)計(jì)原理相同，用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物pGBKT7-TaGeBPL-F/R(表1)，以pMD19-T::TaGeBPL質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ對pGBKT7載體進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測后對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化和同源同組，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取陽性單克隆。根據(jù)奧科鼎盛生物科技有限公司測序結(jié)果，提取質(zhì)粒后獲得pGBKT7::TaGeBPL重組載體。

獲取重組載體后，以重組載體pGBKT7::TaGEBPL為試驗(yàn)組、共轉(zhuǎn)載體pGBKT7-53+pGADT7-T為陽性對照、空載體pGBKT7為陰性對照，分別轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2HGold中，取適量菌液涂布在SD/-Trp培養(yǎng)基上，封口倒置，置于30 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～96 h，觀察菌落生長情況。待菌長至2～3 mm，挑取單克隆于 1 mL的SD/-Trp液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)(220 r·min-1，30 ℃)至OD600約為0.1，以100、10-1、10-2和10-3倍數(shù)稀釋菌液，各取2 μL分別點(diǎn)涂在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基上，置于30 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48～96 h，觀察菌生長情況，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子自激活檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增

以小麥西農(nóng)N13039H的cDNA為模板，以TaGeBPL-F/R為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條與預(yù)期目標(biāo)相一致的條帶(圖1)，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，并進(jìn)行籃白斑篩選、PCR檢測和測序，最終獲得一條長度為1 527 bp的片段。利用Ensembl Plants基因組數(shù)據(jù)庫將所得序列進(jìn)行Blast比對分析，結(jié)果顯示與中國春TraceCS3D02G037800最接近，相似度高達(dá) 99.1%，位于小麥3D染色體上，而與小麥3A和3B染色體組上的TraceCS3A02G042900、TraceCS3B02G040600基因的相似度僅為 84.1%和91.6%。目的基因初步分析得出，該基因共編碼508個(gè)氨基酸(圖2)，推測其分子式為C2342H3835N695O811S10，理論分子量為55 025.98 Da，理論等電點(diǎn)為6.33。

2.2 TaGeBPL蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域分析

利用ExPASy對目的基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白氨基酸序列中賴氨酸和谷氨酸含量較高，脂肪指數(shù)為50.12，平均親水性為-1.153，屬于親水性蛋白，其不穩(wěn)定系數(shù)為49.31，同屬于不穩(wěn)定蛋白。利用SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測該蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白是由四種構(gòu)象組成。SignalP和TMpred預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白不含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。NetPhos預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白氨基酸序列含有較多的磷酸化位點(diǎn)。cNLS Mapper預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白含有兩個(gè)單一型NLS和一個(gè)雙分型NLS(圖2)。Cell-PLoc預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，與NIL預(yù)測結(jié)果一致。NCBI CD-Search保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白含有DUF573結(jié)構(gòu)域，位于氨基酸第164至247位點(diǎn)之間，屬于GeBP轉(zhuǎn)錄因子家族，因此將該基因命名為TaGeBPL。

M：DL2000；1～2：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M:DL2000;1-2:PCR amplification products.圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results

黑色下劃線表示DUF573結(jié)構(gòu)域；方框部分表示核定位信號區(qū)。Black underline represent DUF573 domain;Boxes indicate the region of nuclear localization signal.圖2 TaGeBPL蛋白的氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of TaGeBPL protein

2.3 蛋白同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用PlantTFDB、RGAP、TAIR等數(shù)據(jù)庫檢索GeBP家族轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)在已被鑒定的擬南芥和水稻中，絕大多數(shù)GeBP家族成員氨基酸序列的中央?yún)^(qū)域均含有DUF573結(jié)構(gòu)域。將小麥西農(nóng)N13039H的TaGeBPL轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥和水稻中的GeBP轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果(圖3)顯示，TaGeBPL與AT2G20613.1、AT4G00130.1、AT5G41765.1、LOC_Os01g14720.1的保守域氨基酸序列長度有較大差異性，而與其他氨基酸的序列長度相近，結(jié)構(gòu)域相似性也較高。

圖3 TaGeBPL與擬南芥、水稻GeBP蛋白的氨基酸序列比對Fig.3 Sequence alignment of TaGeBPL and GeBP of Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

為進(jìn)一步了解小麥TaGeBPL的進(jìn)化關(guān)系，從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫下載擬南芥和水稻中的GeBP轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖4)表明，TaGeBPL與水稻LOC_Os02g18660.1、LOC_Os02g53150.1處于同一分支，親緣關(guān)系較近，相似性較高。

圖4 TaGeBPL與擬南芥、水稻GeBP蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogeny analysis of TaGeBPL and GeBP of Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

2.4 啟動(dòng)子區(qū)序列結(jié)構(gòu)分析

利用Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫分析TaGeBPL基因起始密碼子上游約2 000 bp的序列，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，TaGeBPL的啟動(dòng)子區(qū)域含有與逆境、植物激素相關(guān)的順式作用元件。如在起始密碼子上游1 163～1 168 bp處含有MBS干旱應(yīng)答元件，在上游402～407 bp處含有LTR低溫應(yīng)答元件，在上游1 864～1 868 bp處含有as-1植物激素應(yīng)答元件，在上游158～162 bp處含有ABRE脫落酸應(yīng)答元件。此外，啟動(dòng)子區(qū)域還含有多個(gè)光應(yīng)答元件(I-box、G-box、Sp1)，其位置和數(shù)量均不同。啟動(dòng)子分析結(jié)果表明，該基因可能受多種植物激素信號調(diào)控，參與生物和非生物脅迫途徑。

表2 TaGeBPL基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件Table 2 Cis-acting elements of TaGeBPL gene in the promoter regions

2.5 小麥TaGeBPL基因的表達(dá)模式

研究TaGeBPL基因在小麥中的表達(dá)模式有利于挖掘其潛在功能，將白粉菌菌株E09接種于抗病近等基因系N9134R和感病近等基因系N9134S中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對接種白粉菌E09 0、12、24、36、48和72 h后TaGeBPL基因的相對表達(dá)量進(jìn)行測定。結(jié)果(表3)表明，接種E09后TaGeBPL基因在N9134R和N9134S兩個(gè)材料中的表達(dá)模式不同。TaGeBPL基因在N9134R中的表達(dá)量呈現(xiàn)“降-升-降”的變化趨勢，接種12、24和72 h時(shí)TaGeBPL基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)，分別為0 h時(shí)的61%、68%和74%；接種36和48 h時(shí)TaGeBPL基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，分別為0 h的1.23和 1.19倍。而TaGeBPL基因在N9134S中的表達(dá)量呈現(xiàn)“升-降-升-降”的變化趨勢，在12 h時(shí)TaGeBPL相對表達(dá)量顯著上調(diào)，36 h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到峰值，約為對照組的2倍，差異顯著，72 h時(shí)恢復(fù)至未接種對照相同的水平。小麥TaGeBPL基因在N9134S中的表達(dá)量始終高于在N9134R中的表達(dá)量，推測TaGeBPL基因可能響應(yīng)白粉菌的侵染，參與了病原菌響應(yīng)的相關(guān) 途徑。

表3 TaGeBPL基因的qRT-PCR分析Table 3 qRT-PCR analysis of TaGeBPL gene

2.6 小麥TaGeBPL的亞細(xì)胞定位

NLS Mapper和Cell-PLoc預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白具有3個(gè)核定位信號，定位在細(xì)胞核上。為驗(yàn)證TaGeBPL的亞細(xì)胞定位結(jié)果，利用本氏煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，以PYJ::GFP空載體為對照組，以PYJ:TaGeBPL:GFP融合載體為試驗(yàn)組，注射生長良好的煙草植株，結(jié)果(圖5)顯示，在綠色熒光通道下，PYJ:TaGeBPL:GFP融合蛋白僅在細(xì)胞核內(nèi)有綠色熒光信號，說明該蛋白定位于細(xì)胞核中。

A：對照PYJ::GFP空載體定位；B：PYJ:TaGeBPL:GFP融合載體定位。A:Localization of control PYJ::GFP empty vector;B:Localization of PYJ:TaGeBPL:GFP fusion vector.圖5 小麥TaGeBPL的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of wheat TaGeBPL protein

2.7 TaGeBPL的轉(zhuǎn)錄激活活性

轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性對其發(fā)揮生物學(xué)功能具有重要作用，為檢測TaGeBPL轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性，將試驗(yàn)組pGBKT7::TaGeBPL、對照組pGBKT7-T+pGBKT7-p53和pGBKT7分別轉(zhuǎn)至酵母Y2HGold菌株中，發(fā)現(xiàn)它們均能在SD/-Trp營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上正常生長(圖6)，說明外源載體pGBKT7::TaGeBPL成功轉(zhuǎn)入酵母菌中。為檢驗(yàn)pGBKT7::TaGeBPL融合蛋白對其下游報(bào)告基因的激活情況，將含有pGBKT7::TaGeBPL、pGBKT7-T+pGBKT7-p53、pGBKT7的酵母菌株分別涂布于SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-His/-Ade營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基上，結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn)，含pGBKT7::TaGeBPL的Y2HGold菌株不能激活LacZ報(bào)告基因表達(dá)，使X-α-Gal發(fā)生顯色反應(yīng)，說明誘餌載體pGBKT7::TaGeBPL無法激活Y2HGold酵母菌株中指示基因的表達(dá)。在SD/-Trp/-His/-Ade營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上，pGBKT7::TaGeBPL酵母菌株不能正常生長，證實(shí)了TaGeBPL在酵母細(xì)胞中無轉(zhuǎn)錄自激活活性。

100、10-1、10-2、10-3為4種不同稀釋濃度酵母菌液；pGBKT7::TaGeBPL為試驗(yàn)組；pGBKT7-T+pGBKT7-p53為陽性對照組；pGBKT7為陰性對照組。100,10-1,10-2 and 10-3are four different dilution concentration of yeast solution;pGBKT7::TaGeBPL is experimental group,pGBKT7-T+pGBKT7-p53 is positive control group;pGBKT7 is negative control group.圖6 小麥TaGeBPL轉(zhuǎn)錄激活活性分析Fig.6 Transactivation activity assay of TaGeBPL in wheat

3 討 論

本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，利用RT-PCR技術(shù)克隆得到小麥TaGeBPL基因。該基因僅存在于染色體第3同源群，且與現(xiàn)階段已知的小麥唯一GeBP基因(TraesCS1D02G132000)同源性低于30%。擬南芥中，GeBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基因結(jié)構(gòu)較簡單，在染色體上隨機(jī)分布，含有DUF573結(jié)構(gòu)域[14]，與前人研究相同，TaGeBPL蛋白也含有DUF573結(jié)構(gòu)域，但其功能未知。對擬南芥、水稻和小麥GeBP基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)它們具有較高的相似性，TaGeBPL同水稻LOC_Os02g18660.1、LOC_Os02g53150.1親緣關(guān)系較近，而LOC_Os02g18660.1和LOC_Os02g53150.1在植株頂端分生組織和種子中的表達(dá)量較高，在生殖生長階段發(fā)揮重要功能[16]，推測小麥中TaGeBPL蛋白可能具有相似功能。在利用生物信息學(xué)分析TaGeBPL的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行了基因時(shí)空特異性表達(dá)檢測，qRT-PCR結(jié)果表明，白粉菌接種后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)該基因在抗感材料中的相對表達(dá)量不相同，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)感病材料中TaGeBPL基因的表達(dá)量始終高于抗病材料中的表達(dá)量，推測小麥中TaGeBPL基因參與了病原菌響應(yīng)途徑，與GeBP基因在擬南芥中的研究結(jié)果[17]一致，這不僅為后期研究小麥GeBP基因作用與機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為探究擬南芥等其他物種GeBP同源基因的功能提供參考。此外，擬南芥GeBP蛋白可在體內(nèi)形成二聚體[17]，可從與之互作的蛋白為出發(fā)點(diǎn)，間接地研究目標(biāo)蛋白在植物體中的更多功能[28]。需要注意的是，擬南芥中二聚體的形成與亮氨酸拉鏈區(qū)域的最后四個(gè)氨基酸有密切的關(guān)系，而小麥TaGeBPL蛋白C端沒有亮氨酸拉鏈特殊區(qū)域，可能不同物種或同一家族的不同成員之間有差異，總的來說，研究蛋白二聚體為分析GeBP轉(zhuǎn)錄因子家族提供了思路，對其功能挖掘也具有重要意義[29]。

功能分析是研究基因的一個(gè)方面，探究其作用機(jī)理可更加深刻地認(rèn)識該基因。本研究利用cNLS Mapper發(fā)現(xiàn)，TaGeBPL轉(zhuǎn)錄因子位于細(xì)胞核中，具有兩種類型的核定位信號，這一特征表明TaGeBPL轉(zhuǎn)錄因子不需要依靠其他具有NLS轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)，可以直接被受體蛋白識別進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)[30]。這與擬南芥GeBP/GPLs不同，擬南芥GPL3蛋白雖然定位于細(xì)胞核內(nèi)，但并未發(fā)現(xiàn)其具有核定位信號[17]，這表明不同物種GeBP進(jìn)入細(xì)胞核的方式可能不同。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，TaGeBPL僅在細(xì)胞核中有綠色熒光信號，進(jìn)一步驗(yàn)證了其在核中發(fā)揮作用。在擬南芥中GeBP也位于植物細(xì)胞核中，而水稻中GeBP家族成員不僅存在于細(xì)胞核中，還存在于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體類囊體薄膜上[16]，原因可能是在不同物種GeBP參與了不同的生理過程。

植物中眾多轉(zhuǎn)錄因子參與植物激素調(diào)控途徑[31]，GeBP轉(zhuǎn)錄因子也不例外。如在模式植物中，Chevalier等[17]發(fā)現(xiàn)，擬南芥GeBP/GPLs基因通過對A型ARR基因的調(diào)控，進(jìn)而參與細(xì)胞分裂素反應(yīng)，且對細(xì)胞分裂素的響應(yīng)具有冗余作用[17]；而石 蕾[16]研究表明，水稻LOC_Os06g10710在乙烯處理后表現(xiàn)出敏感響應(yīng)，說明不同物種的GeBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員可能參與不同的植物激素信號調(diào)節(jié)途徑。在模式植物中，GeBP/GPLs對細(xì)胞分裂素的作用僅發(fā)生在特定的組織和器官中，而并非整個(gè)植株中都能發(fā)揮此作用[17]。此外，此方面的研究對象是具有亮氨酸拉鏈的GeBP家族成員，無亮氨酸拉鏈的其他成員是否參與植物激素調(diào)節(jié)是未知的。而在小麥中該蛋白不含有明顯特征的亮氨酸拉鏈，所以TaGeBPL能否響應(yīng)細(xì)胞分裂素調(diào)控途徑還需要下一步的研究。值得注意的是，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控功能基因的表達(dá)通常是由相同或不同轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用的結(jié)果，本研究對TaGeBPL的轉(zhuǎn)錄激活活性試驗(yàn)為后續(xù)互作蛋白的篩選研究奠定了基礎(chǔ)。