陳詩梅，韋芳

(上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院上海市第一人民醫(yī)院眼科 國家眼部疾病臨床醫(yī)學研究中心 上海市眼底病重點實驗室上海市眼視覺與光醫(yī)學工程研究中心 上海市眼科疾病精準診療工程技術研究中心，上海200080)

糖尿病是一組以糖代謝異常為特征的全身代謝性疾病，由胰島素分泌缺陷、胰島素敏感性降低或兩者共同作用導致;據(jù)2019年國際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)顯示，全球有4.63億成人糖尿病患者［1］，中國成人糖尿病患者數(shù)量高達1.14億，占全球成人糖尿病患者總數(shù)的1/4以上，患病率高達35%左右，患者數(shù)量居世界第1位［2］。糖尿病易累及微血管及大血管病變，導致腎、眼、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等的并發(fā)癥，是糖尿病患者致死致殘的主要原因。2013年全球因糖尿病及其并發(fā)癥死亡人數(shù)約510萬，糖尿病相關醫(yī)療保健支出達到5 480億美元，造成嚴重的社會及經(jīng)濟負擔［3］。

高血糖與活性氧類(reactive oxygen species，ROS)相關氧化應激在堿基、核苷酸、單鏈和雙鏈等水平導致DNA損傷，產(chǎn)生大量DNA損傷標志物8－羥基鳥嘌呤和8－羥基脫氧鳥嘌呤，在糖尿病大鼠的組織和血漿中均有發(fā)現(xiàn)［4］。糖尿病高ROS致細胞核DNA損傷，伴隨DNA修復酶多腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly(ADP－ribose)polymerase，PARP］的過度激活，兩者不僅降低沉默信息調節(jié)因子(silence information regulator，SIRT)、過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1和AMP活化蛋白激酶(adenosine monophosphate－activated protein kinase，AMPK)等活性，引起線粒體生物合成減少，還進一步加劇了糖脂代謝的異常［5］。研究表明，氧化應激統(tǒng)一機制學說在糖尿病心肌病、心臟電活動傳導、心血管意外事件以及微血管病變的發(fā)病中占據(jù)核心地位［5－6］。因此，DNA損傷修復作為糖尿病并發(fā)癥統(tǒng)一機制學說的上游致病環(huán)節(jié)受到廣泛關注?，F(xiàn)就糖尿病與其氧化應激造成的DNA損傷修復之間的研究進展予以綜述。

1 高血糖下氧化應激與DNA損傷

糖尿病并發(fā)癥源于高血糖誘導的細胞損傷的統(tǒng)一機制:β細胞功能障礙引起的異常代謝狀態(tài)與其他因素(對損傷的遺傳易感性、環(huán)境因素等)的相互作用，伴有氧化應激和ROS產(chǎn)生［7］，即細胞長期暴露于高血糖的環(huán)境，引起線粒體產(chǎn)生更高水平的ROS［8］。ROS引起胰島β細胞損傷，破壞線粒體結構，誘導細胞凋亡，核因子κB信號通路，引起炎癥反應，抑制胰十二指腸同源盒因子1的核質易位和能量代謝，減少胰島素合成與分泌［9－10］;另一方面，ROS可引起核DNA鏈的斷裂，從而激活PARP。PARP是存在于多數(shù)真核細胞中的多功能蛋白質翻譯后修飾酶，通過識別結構損傷的DNA片段而被激活，被認為是DNA損傷信號中最早被激活的蛋白質之一;PARP1是主要協(xié)同修復蛋白，與DNA損傷位點結合后被激活，通過調節(jié)底物和自身活性產(chǎn)生多聚ADP核糖鏈，在DNA損傷部位周圍發(fā)生聚ADP核糖基化，以修飾其他蛋白質，包括組蛋白和染色質重塑酶，從而促進DNA修復因子的招募［11］。在高血糖環(huán)境下，為了維持基因組的穩(wěn)定性，各種靶器官和靶細胞均存在PARP的過度激活，其所導致的負性效應包括:①細胞內(nèi)NAD+大量消耗，胰島素受體磷酸化水平顯著下降，同時煙酰胺單核苷酸腺嘌呤轉移酶1、SIRT和AMPK下調，細胞內(nèi)抗氧化劑大量消耗，導致細胞處于氧化與抗氧化失衡的應激狀態(tài)，加速細胞凋亡;②PARP可修飾葡萄糖糖酵解途徑中的甘油醛－3磷酸脫氫酶，從而降低其活性，導致其上游代謝產(chǎn)物淤積并進入以下旁路:a.多元醇通路活性增高;b.晚期糖基化終末產(chǎn)物形成增多;c.蛋白激酶C激活;d.己糖胺通路活性增高，上述4種通路的激活均導致慢性炎癥過程［12］，通過誘導轉錄因子、基因轉錄以及表觀遺傳修飾導致靶器官或組織中的細胞肥大、增殖、重塑和凋亡信號轉導，在生理學上表現(xiàn)為冠狀動脈疾病、外周動脈疾病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變和腎臟微血管損害等一系列糖尿病并發(fā)癥。

ROS在堿基、核苷酸、單鏈和雙鏈等水平損傷DNA。氧化應激時，DNA損傷加重炎癥反應，細胞再生能力下降、代謝受損以及內(nèi)分泌系統(tǒng)功能受到抑制，繼而破壞全身代謝穩(wěn)態(tài)，引發(fā)糖尿病。ROS可引起DNA損傷，而DNA損傷也可誘導ROS產(chǎn)生，兩者相互作用形成惡性循環(huán)，加重了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。

為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，細胞積極通過DNA修復來避免有害的基因組不穩(wěn)定性，包括堿基切除修復(base excision repair，BER)、核苷酸切除修復、同源重組和非同源末端連接［13－14］。其中，p53、SIRT、PARP、共濟失調性毛細血管擴張癥突變基因(ataxia telangiectasia mutated，ATM)等重要的調控分子同時參與DNA修復和細胞內(nèi)物質代謝過程，并在上述過程中發(fā)揮匯聚點作用［15－16］，其可能成為調節(jié)高血糖下氧化應激所致DNA損傷反應、阻斷糖尿病代謝異常及血管功能障礙的關鍵靶點。

2 DNA損傷修復相關機制

DNA損傷時，傳感器至各種效應分子之間的信息傳遞使信號放大，引起多條細胞通路激活，其中ATM蛋白以及磷脂酰肌醇－3－激酶β是重要的調節(jié)蛋白。持續(xù)高糖暴露條件下，DNA修復受損導致了糖尿病的發(fā)生。

ATM是一種高分子量(350 000)蛋白激酶，是磷脂酰肌醇－3－激酶家族的成員，其他家族成員包括DNA依賴蛋白激酶催化亞單位(catalytic sunbunit of the DNA－dependent protein kinase，DNA－PKcs)、共濟失調－毛細血管擴張相關蛋白與Rad3相關(Rad3－related，ATR)蛋白、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/雷帕霉素相關蛋白等［17］。ATM－細胞周期監(jiān)測點激酶(checkpoint kinase，Chk)2和ATR－Chk1是經(jīng)典的檢查點通路起始，能夠協(xié)調DNA修復過程和細胞周期進程［18］。

MRN(Mre11－Rad50－Nbs1)復合物與DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSB)點結合時，ATM作為傳感器被激活。ATM被招募時，磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)聚集在損傷部位，從而協(xié)調與DNA雙鏈斷裂修復相關的下游因子［19］。γH2AX已成為監(jiān)測DNA損傷起始或終止的具有高度特異性和敏感性的分子標記［20］。

當DNA雙鏈受損時，暴露的單鏈DNA被結合復制蛋白A覆蓋，招募并激活ATR/Chk1復制檢查點。Chk1的有效活化和下游磷酸化依賴于介質蛋白DNA拓撲異構酶Ⅱ結合蛋白1和Claspin的作用。DNA拓撲異構酶Ⅱ結合蛋白1通過9－1－1復合物招募單鏈DNA－復制蛋白A，進而激活ATR激酶［21］;而Claspin可結合Chk1并作為ATR介導的磷酸化和活化的平臺［22］。

DNA受損時，ATM磷酸化細胞周期蛋白依賴性激酶2，使細胞分裂周期蛋白(cell－division－cycle protein，Cdc)25A磷酸酶失活，導致細胞周期蛋白依賴性激酶2持續(xù)磷酸化，從而阻滯G1～S期;ATM磷酸化乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)、范可尼貧血互補群基因D2、Nbs1、染色體結構維持蛋白1上的絲氨酸位點，以引起S期阻滯。Cdc25C(一種雙特異性蛋白磷酸酶)使Cdc2自由形成Cdc2－細胞周期蛋白B復合物。若G2期發(fā)生DNA損傷，Cdc25C被泛素化降解，從而激活p53依賴性途徑，以停滯細胞周期。BRCA1也介導G2～M期阻滯。BRCA1通過BRCT結構域與CtIP相互作用，催化CtIP的泛素化;DNA損傷后，CtIP的泛素化形式與染色質相互作用，并參與G2～M檢查點［23］。

Chk1和Chk2將DNA損傷修復與細胞周期聯(lián)系起來，Chk2可誘導下游p53發(fā)生磷酸化并激活一系列修復分子，p53是一種腫瘤抑制基因，也是DNA損傷修復相關蛋白，決定著細胞衰老、凋亡或腫瘤發(fā)生。由DNA損傷誘導的G1～S/S/G2～M期檢查點的終點均通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶的活性阻滯細胞周期，以為啟動DNA修復爭取更長的時間;參與細胞周期停滯的蛋白質的激活可誘導DNA修復和凋亡相關基因。

3 DNA修復對糖尿病及其并發(fā)癥的影響

BER利用DNA糖基化酶去除DNA損傷，特異性切除受損核苷酸上的N－β－糖苷鍵，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點，稱AP位點。AP核酸內(nèi)切酶將受損核苷酸的糖苷－磷酸鍵切開并移去小片段DNA，由DNA聚合酶Ⅰ合成新的片段。一般哺乳動物核苷酸切除修復途徑可去除DNA螺旋扭曲的大體積DNA損傷，而小體積損傷則通過BER進行修復。為了維持基因組的完整性，核內(nèi)存在多種修復途徑，BER途徑是修復受損線粒體DNA的主要途徑［24］。受損線粒體DNA的累積可能導致線粒體功能障礙和疾病，如老化相關的退行性疾病、惡性腫瘤［25］。糖尿病的病理生理過程與線粒體代謝功能相互干擾，糖尿病導致線粒體DNA突變、線粒體密度及其ATP產(chǎn)量下降、線粒體信使RNA水平降低，導致氧化應激產(chǎn)物增加;當上述線粒體改變發(fā)生在胰腺時，可引發(fā)2型糖尿病的胰島素抵抗;若上述線粒體改變發(fā)生在對氧化損傷高度敏感的內(nèi)皮細胞，可引發(fā)繼發(fā)性血管疾病，并引起心臟、腎臟、眼部和神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥［26－27］。

DNA依賴性蛋白激酶(DNA－dependent protein kinase，DNA－PK)是非同源末端連接的關鍵蛋白分子。DNA－PKcs的主要作用是介導DNA－PK的催化，Ku蛋白與雙鏈DNA的斷端連接，促進雙鏈斷裂的重接。Ku蛋白招募Artemis，DNA－PKcs結合到DNA末端并磷酸化Artemis。Artemis使DNA－PKcs與Ku－DNA復合體分離，隨后與X線修復交叉互補基因4共同形成連接酶Ⅳ－X線修復交叉互補基因4－XRCC4類似因子復合物，起到類似支架的作用，完成DNA修復［28］。DNA－PK是DSB的核心參與者，其在代謝調節(jié)中顯示出新的作用，Park等［28］對DNA－PK負性調節(jié)AMPK分子機制的研究發(fā)現(xiàn)，DNA－PK抑制劑可通過激活多個AMPK靶點保護機體免受肥胖和2型糖尿病的影響。持續(xù)的DNA損傷信號不僅通過基因突變導致細胞衰老和功能下降，還可導致代謝失調，因此可通過消除衰老細胞或單獨抑制DNA－PK或改善DNA修復策略來調節(jié)持續(xù)DNA損傷的有害作用。

在同源重組中，MRN復合物對DNA雙鏈斷裂的修復和信號轉導至關重要［29］。Mre11與CtIP共同啟動切除過程，CtIp絲氨酸－327磷酸化作為細胞進入S期和BRCA1募集功能的分子開關，可同時促進單鏈DNA末端切除。Rad51－單鏈DNA聯(lián)會前核蛋白纖維介導同源序列的尋找和DNA鏈侵入，是HR修復的核心反應;修復過程以3＇端為引物進行DNA合成，使Rad51與雙鏈DNA分離;此外，Rad50、Rad51和γH2AX的募集過程也依賴BRCA1［30］。二甲雙胍可通過刺激同源末端連接、同源重組和核苷酸切除修復途徑中的DNA損傷反應減少DNA損傷，維持基因組穩(wěn)定性［31］。

4 DNA損傷修復相關蛋白與糖尿病

許多調控蛋白可同時影響DNA損傷修復與細胞內(nèi)物質代謝。缺乏ATM細胞的氧化應激增加，抗氧化反應低下，對氧化劑處理敏感［32］;ATM對腫瘤抑制因子p53、AMPK、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和缺氧誘導因子－1均有作用，表明ATM具有調節(jié)線粒體功能及控制代謝的作用［33］。Claudia等［34］研究發(fā)現(xiàn)，ATM通過調節(jié)磷酸戊糖途徑促進抗氧化反應。葡萄糖－6－磷酸脫氫酶是磷酸戊糖途徑的限制酶，可產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(一種必需的抗氧化輔助因子)，激活ATM可誘導葡萄糖－6－磷酸脫氫酶的活性，依賴ATM的磷酸戊糖途徑使核苷酸產(chǎn)生增加，進而導致葡萄糖－6－磷酸脫氫酶缺陷細胞的DSB修復能力受損，即ATM通過刺激還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生成和促進修復DSB所需的核苷酸合成來保護細胞免受ROS積累的影響。Armata等［35］證實，調控胰島素抵抗的ATM通路是由p53磷酸化介導，同時也是葡萄糖穩(wěn)態(tài)生理調控的重要機制。

共濟失調是一種由ATM蛋白缺失引起的單基因常染色體隱性遺傳性疾病。共濟失調患者的2型糖尿病發(fā)病率較高，表現(xiàn)為胰島素抵抗和葡萄糖不耐受等典型癥狀［36］。葡萄糖轉運蛋白4負責胰島素介導的骨骼肌葡萄糖攝取，而ATM的失活可抑制葡萄糖轉運蛋白4功能，影響胰島素信號的轉導［37］。二甲雙胍是2型糖尿病的一線治療藥物，而ATM的變異可改變二甲雙胍對血糖的反應［38］。綜上，ATM基因與DNA損傷修復、細胞周期進程相關，并與糖尿病發(fā)生發(fā)展緊密聯(lián)系，可作為治療糖尿病及其并發(fā)癥的新靶點。

p53是細胞周期和細胞凋亡的關鍵調節(jié)因子，決定了細胞衰老、凋亡或腫瘤的發(fā)生。p53及其家族成員p63和p73參與了細胞代謝的許多方面，包括AMPK和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號轉導、碳水化合物和脂質代謝、自噬的調節(jié)以及線粒體完整性和氧化還原平衡的維持［39］。研究發(fā)現(xiàn)，Δ40p53(一種p53突變體，缺少部分激活域)小鼠表現(xiàn)為葡萄糖不耐受、低胰島素血癥以及β細胞質量和增殖缺陷，表明p53在β細胞增殖調節(jié)中起作用，可影響年齡依賴性糖尿病的發(fā)展［40］。

SIRT作為一種NAD+依賴性酶，是各種代謝途徑的重要調節(jié)因子。SIRT1在DNA修復中起關鍵作用，大多數(shù)SIRT1缺陷小鼠胚胎的死亡原因為DNA損傷和染色體異常［41］。SIRT1和SIRT6缺陷細胞修復DNA雙鏈斷裂的能力下降;SIRT6通過整合DNA修復和應激信號通路調節(jié)DNA修復［42］。SIRT可通過與同源重組修復、非同源末端修復、核苷酸切除修復等途徑中的核心蛋白質p53/叉頭框轉錄因子O/過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1/核因子κB/Ku70等相互作用參與修復DSB等DNA損傷，從而在維持基因組穩(wěn)定性、壽命以及細胞能量代謝調節(jié)等一系列生物學作用中發(fā)揮至關重要的作用。

高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是一種高度保守的核蛋白，在胞核中主要與DNA結合并作為核因子參與損傷修復。當組織受到一定損傷(高糖、高血脂等)代謝異常信號刺激后，HMGB1轉移釋放至胞質并發(fā)揮炎癥細胞因子的作用。HMGB1與糖尿病的某些慢性并發(fā)癥緊密相關。Abu El－Asrar等［43］發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠和小鼠的視網(wǎng)膜HMGB1顯著上調，且玻璃體內(nèi)注射HMGB1可誘導正常大鼠視網(wǎng)膜的炎癥信號通路，提高視網(wǎng)膜通透性。另有研究顯示，HMGB1與不同受體(Toll樣受體2、Toll樣受體4、晚期糖基化終產(chǎn)物等)結合引發(fā)的相關炎癥通路激活均與糖尿病心肌病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變相關［44－45］。

PARP蛋白是DNA的損傷感受器，在不同情況下，PARP蛋白可調節(jié)DNA損傷和代謝能力。PARP抑制劑可促進糖尿病患者的創(chuàng)面愈合，還可通過降低炎癥、氧化應激、纖維化水平等改善糖尿病腎病的進展［46－48］。

8－羥基脫氧鳥苷是DNA氧化損傷的標志物，糖尿病患者心臟中8－羥基脫氧鳥苷水平升高、線粒體DNA損傷增加［49］。人MutT同源物1、人類8－羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶和人類MutY DNA糖基化酶是構成8－羥基脫氧鳥苷修復通路的重要元件，其基因多態(tài)性變異與2型糖尿病密切相關［50］。此外，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶與2型糖尿病大血管病變也具有相關性［51］。

高糖環(huán)境下ROS及代謝的變化導致DNA損傷，造成基因組不穩(wěn)定，而DNA損傷修復進一步影響代謝;DNA損傷修復相關蛋白與代謝調節(jié)的聯(lián)系有待進一步研究，隨著研究的不斷深入，將有更多上述兩條途徑相關的蛋白質被發(fā)現(xiàn)。

5 小 結

DNA氧化損傷在糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一發(fā)病機制中占據(jù)重要地位，深入揭示和闡明其確切的分子機制有重要意義。糖尿病代謝紊亂所致的DNA氧化應激損傷具有明顯的特征，但其具體分子機制尚未明確。DNA修復與細胞代謝息息相關，兼具DNA損傷修復和細胞代謝調控雙重功能的蛋白分子的突變或失活在體內(nèi)外水平均可導致糖代謝或糖耐量的異常，研究此類蛋白在上述兩種功能間達到平衡的機制有望為糖尿病及其并發(fā)癥的預防和治療提供新方法。