吳珍 趙微 戴鈺 陳良安

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京100853

肺癌作為病死率最高的惡性腫瘤[1]，極大地危害了人類的健康和影響了社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。肺癌傳統(tǒng)的診斷手段以組織病理活檢為金標(biāo)準(zhǔn)，但由于腫瘤異質(zhì)性、患者自身不耐受等原因使得組織活檢在臨床應(yīng)用中具有一定的局限性。液體活檢則能較好地彌補(bǔ)上述不足，從早期篩查到指導(dǎo)個(gè)體化診療，應(yīng)用廣泛且意義重大。

一、液體活檢的發(fā)展史

液體活檢指應(yīng)用來源于人體循環(huán)的體液樣本進(jìn)行疾病相關(guān)分子的檢測(cè)來指導(dǎo)疾病的診療，其不僅用于腫瘤疾病的輔助診療，還在產(chǎn)前診斷、心血管疾病、慢性腎病、腦卒中等疾病的診治中發(fā)揮重要作用[2-5]。在腫瘤的液體活檢中應(yīng)用最廣泛的為循環(huán)游離DNA (cell free DNA，cf DNA)。cf DNA由Mandel和Metais于1948年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，是一種存在于人體體液中且游離于細(xì)胞之外的核酸，主要由凋亡或壞死細(xì)胞釋放而成[6]。而后，腫瘤患者外周血中被證實(shí)含有更多的cf DNA。1994 年，Vasioukhin等[7]在腫瘤患者cf DNA 中發(fā)現(xiàn)了腫瘤相關(guān)的RAS基因突變。這部分含有腫瘤相關(guān)突變的cf DNA 稱為循環(huán)腫瘤DNA (circulating t u mor DNA，ct DNA)，來源于凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞釋放、循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (circulating tu mor cell，CTC)或外泌體等[8]。隨后更多的研究發(fā)現(xiàn)ct DNA 可反映腫瘤組織基因組變異和表觀遺傳學(xué)等改變，進(jìn)一步提升了液體活檢在腫瘤診療領(lǐng)域的應(yīng)用與進(jìn)展[9-10]。

CTC是另一種常見的液體活檢技術(shù)，1869年由Ash wort h發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中存在與腫瘤細(xì)胞相似的細(xì)胞，提出了CTC的概念[11]。直到2003年，CTC才被完全定義：一方面為來源于原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞通過毛細(xì)血管入侵血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入血管形成，另一方面為腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化使得細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)入侵基底膜而形成[12]。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，CTC 所具有的基因組信息被深入挖掘，被證實(shí)與腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶存在相似的基因譜，其在腫瘤疾病診治中的作用越來越突出，有望成為補(bǔ)充和替代腫瘤組織的體液樣本。且CTC 獲取方便，可實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，有助于腫瘤診療過程中的個(gè)體化動(dòng)態(tài)指導(dǎo)[13-14]。

二、液體活檢在肺癌診治中的應(yīng)用

液體活檢以其安全、無創(chuàng)和可重復(fù)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于肺癌臨床診療，為肺癌的早診提供了安全有效的方法，給不能耐受組織活檢的患者提供了靶點(diǎn)檢測(cè)的機(jī)會(huì)，對(duì)治療過程中的隨訪和監(jiān)測(cè)也提供了一定的便利，并且減少了耐藥后不必要的再活檢，貫穿于肺癌患者的全程診療過程。

(一)肺癌患者的早期診斷

大多數(shù)肺癌患者早期時(shí)無明顯癥狀，且目前缺乏有效的早期診斷方法，使得多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期。盡管美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院于2011年發(fā)表研究結(jié)果證實(shí)低劑量CT 篩查可以降低20%的肺癌病死率以及6.7%的總死亡率，但是低劑量CT中高達(dá)96.4%的假陽性率導(dǎo)致不必要的過度醫(yī)療和輻射暴露[15]。液體活檢技術(shù)通過對(duì)其中cf DNA、微小RNA (micro RNA，mi RNA)、CTC 和腫瘤血小板進(jìn)行檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)肺癌的早期診斷，有望成為將來肺癌早診的又一大策略。早在20世紀(jì)，研究中就發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中的cf DNA 含量比普通健康者更多[16]。Chabon 等[17]利用深度測(cè)序的方法，再結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)，將早期肺癌患者血漿中的cf DNA 與風(fēng)險(xiǎn)匹配對(duì)照組血漿中的cf DNA 進(jìn)行差異分析，前瞻性地建立并驗(yàn)證了一種稱為“血漿中肺癌可能性” (Lung-CLi P)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法用于早期肺癌的篩查。研究者們從TCGA 數(shù)據(jù)庫中篩選出3個(gè)與肺癌相關(guān)性高的mi RNA：mi R-21-5p、mi R-103-3p、mi R-126-3p，聯(lián)合這3個(gè)mi RNA 在肺結(jié)節(jié)患者中進(jìn)行肺癌篩查的敏感度可達(dá)到81.2%，而與胸部CT 聯(lián)合診斷可使得肺癌早診的敏感度上升到89.9%[18]。對(duì)mi RNA 的聯(lián)合應(yīng)用還可進(jìn)一步區(qū)分早期肺癌的病理分型，Lu等[19]研究表明應(yīng)用3 個(gè)mi RNA 分子 (mi R-17、mi R-190b、mi R-375)可區(qū)分小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌，敏感度和特異度可分別達(dá)到82%和84%。肺癌特異性抗體聯(lián)合胸部CT 進(jìn)行肺癌早期篩查的陽性預(yù)測(cè)值可達(dá)95%，高于單獨(dú)應(yīng)用胸部CT(69%)或特異性抗體 (85.2%)的陽性預(yù)測(cè)值[20]。借助于液體活檢，能夠以更加安全、易于接受的方法提高肺癌早診的普及性，并且與目前已有的影像學(xué)篩查結(jié)合具有更高的敏感度，可進(jìn)一步提高肺癌早診的陽性率，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，進(jìn)而改善肺癌患者的整體生存質(zhì)量，并延長(zhǎng)生存期。

(二)肺癌患者的靶點(diǎn)檢測(cè)

目前指南推薦非小細(xì)胞肺癌確診后應(yīng)首先進(jìn)行驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)以明確下一步治療方案[21]。盡管靶點(diǎn)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)仍是組織分子檢測(cè)，但由于患者身體的耐受性以及腫瘤異質(zhì)性導(dǎo)致的單次活檢的局限性使得組織活檢在臨床的應(yīng)用受限[10，22-23]。采用全身外周體液中的cf DNA、CTC、外泌體、TEP 等進(jìn)行分子靶點(diǎn)的檢測(cè)，以安全簡(jiǎn)便、易于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于臨床以指導(dǎo)個(gè)體化精準(zhǔn)診療。從Bai等[24]用高性能液相質(zhì)譜檢測(cè)外周血ct DNA 中EGFR 突變，到后來實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的應(yīng)用，液體活檢在非小細(xì)胞肺癌患者靶點(diǎn)檢測(cè)中的應(yīng)用越來越廣泛。而基于熒光定量PCR 平臺(tái)的Cobas檢測(cè)技術(shù)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于液體活檢檢測(cè)EGFR 已知突變位點(diǎn) (19 外顯子缺失、L858 R 點(diǎn)突變和T790 M 突變)[25]。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，使得液體活檢在分子檢測(cè)中的敏感度能夠進(jìn)一步提升，更好地滿足臨床診療需求。目前二代測(cè)序進(jìn)行液體活檢在驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)中的一致性可以達(dá)到90%以上，且轉(zhuǎn)移灶數(shù)目越多的患者血漿檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因的敏感度和一致性越高[26-27]。目前液體活檢所覆蓋的分子譜也越來越廣泛，既滿足了非小細(xì)胞肺癌臨床診療中的常見分子靶點(diǎn)EGFR和ALK 等基因的檢出，也能發(fā)現(xiàn)更多驅(qū)動(dòng)基因的未知位點(diǎn)，還能進(jìn)一步進(jìn)行耐藥機(jī)制的深入探討[28-30]。

(三)肺癌患者的耐藥監(jiān)測(cè)

耐藥是肺癌患者治療過程中不可避免的結(jié)局。耐藥后的分子檢測(cè)仍然以組織檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)。由于多數(shù)患者耐藥后身體狀況無法耐受有創(chuàng)的耐藥后再活檢，使得多數(shù)患者在耐藥后失去進(jìn)行分子檢測(cè)的機(jī)會(huì)。安全微創(chuàng)的液體活檢再次解決了這一難題。研究發(fā)現(xiàn)，與組織樣本相比，耐藥患者血漿樣本檢出T790 M 的一致性可達(dá)70%以上，且胸腔外轉(zhuǎn)移患者血漿檢出T790 M 突變的陽性率更高[31-32]。一代EGFR-TKI耐藥患者的血漿中能夠早于影像學(xué)進(jìn)展2個(gè)月檢出T790 M 的存在，有助于患者的耐藥監(jiān)測(cè)，以便盡早發(fā)現(xiàn)耐藥[33]。由于腫瘤的異質(zhì)性導(dǎo)致單次組織活檢檢出的耐藥基因譜不全，而來自外周循環(huán)的體液樣本同時(shí)包含了腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的腫瘤分子背景，能夠較全面地檢出耐藥基因譜[34]。Tho mpson等[35]研究表明耐藥患者外周血能檢測(cè)到腫瘤組織無法檢出的T790 M 耐藥突變，進(jìn)一步為耐藥患者提供有效的治療方案。液體活檢再次為耐藥患者提供了安全便利的分子檢測(cè)方法，不僅有助于檢出耐藥基因，還能早于臨床影像學(xué)評(píng)估就監(jiān)測(cè)到耐藥的出現(xiàn)，并且還能彌補(bǔ)腫瘤組織異質(zhì)性導(dǎo)致的腫瘤耐藥譜不全，更好地指導(dǎo)耐藥患者的后續(xù)治療。

(四)肺癌患者的預(yù)后評(píng)估

越來越多的研究還證實(shí)利用液體活檢進(jìn)行疾病監(jiān)測(cè)，可以評(píng)估和預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。在早期肺癌患者術(shù)后，外周血中檢測(cè)ct DNA 或CTC陽性組的患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)率和術(shù)后2年復(fù)發(fā)率均高于陰性組[36]。TRACERx研究納入了100 例早期肺癌術(shù)后的患者通過ct DNA 來監(jiān)測(cè)驅(qū)動(dòng)基因數(shù)目的變化，結(jié)果表明，以ct DNA 監(jiān)測(cè)驅(qū)動(dòng)基因數(shù)目大于等于2個(gè)作為復(fù)發(fā)的標(biāo)志，其敏感度和特異度可達(dá)到93%和90%，并且可早于影像學(xué)進(jìn)展之前預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的出現(xiàn)[37-39]。液體活檢對(duì)靶向治療的預(yù)后同樣具有一定作用，BENEFIT 研究證實(shí)血漿檢測(cè)EGFR突變陽性患者接受一代EGFR-TKI的客觀緩解率為72.1%，中位無進(jìn)展生存期為9.5個(gè)月。同時(shí)在接受治療后的第8周，血漿EGFR 轉(zhuǎn)陰的患者可獲得更長(zhǎng)的無進(jìn)展生存期[40]。初治時(shí)EGFR 突變的頻率也被認(rèn)為與一代EGFR-TKI治療的預(yù)后相關(guān)：突變頻率大于5.15%的患者接受一代EGFRTKI治療獲得的無進(jìn)展生存期長(zhǎng)于EGFR 突變頻率小于5.15%的患者 (15.4個(gè)月比11.1個(gè)月)[41]。血漿中ALK 突變頻率的動(dòng)態(tài)變化同樣可以評(píng)估ALK 抑制劑的療效[28]，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)BRAF突變頻率的降低也可提示相關(guān)的靶向治療有效[42]。

三、液體活檢在肺癌診治中的挑戰(zhàn)

(一)檢測(cè)樣本的選擇

作為臨床檢測(cè)最常見的標(biāo)本之一，外周血樣本是最早應(yīng)用于肺癌患者液體活檢的樣本，其獲取方便，檢測(cè)敏感度高，在肺癌診療中的應(yīng)用也最為廣泛。但是，研究者發(fā)現(xiàn)，來自于多數(shù)肺癌患者外周血中的ct DNA 量占總體cf DNA 的比值小于1%，且受腫瘤分期、患者病灶部位、腫瘤負(fù)荷等因素影響而使外周血ct DNA 檢測(cè)存在一定的局限性[43-45]。近些年來，除外周血以外的其他樣本也逐漸被用于肺癌患者的液體活檢中。痰液樣本作為呼吸系統(tǒng)疾病最常見的標(biāo)本之一，其中含有大量的cf DNA[46]。研究證實(shí)，肺癌患者cf DNA 可以用于驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)，盡管在驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)中的一致性不如外周血，但是其可以檢測(cè)到外周血無法檢測(cè)到的基因突變，兩者聯(lián)合可以檢測(cè)到更多的腫瘤分子靶點(diǎn)，且吸煙患者的痰液cf DNA 檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因的一致性高于非吸煙患者[47]?；谀蛞簶颖镜囊后w活檢也被證實(shí)與組織樣本具有較好的一致性[48]，與血液樣本的聯(lián)合可以檢出更多的驅(qū)動(dòng)基因變異[49]。尿液樣本cf DNA 進(jìn)行T790 M 的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)還可以評(píng)估奧希替尼的早期療效[50]。胸腔積液作為肺癌患者的常見標(biāo)本之一，在檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因中的價(jià)值較外周血更勝一籌。胸腔積液上清液中的cf DNA 檢測(cè)到的腫瘤突變負(fù)荷 (tu mor mutation bur den，T MB)與腫瘤組織中檢測(cè)到的T MB相似，高于外周血cf DNA檢測(cè)到的T MB。在檢出的EGFR 突變頻率比較中也是胸腔積液cf DNA 高于外周血cf DNA[51]。而腦脊液在肺癌腦轉(zhuǎn)移患者驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)中的敏感度和一致性也要高于外周血樣本，并且腦脊液cf DNA能夠檢出更多的驅(qū)動(dòng)基因拷貝數(shù)變異[52]。越來越多的體液樣本用于液體活檢，在樣本選擇中我們應(yīng)該根據(jù)患者臨床特點(diǎn)和疾病特征，結(jié)合標(biāo)本獲取的可行性來有針對(duì)性的選擇最適合的樣本，提高液體活檢在肺癌診療中的應(yīng)用價(jià)值。

(二)檢測(cè)成分的取舍

大量研究表明cf DNA 是液體活檢中應(yīng)用最多的生物標(biāo)志物，其次是CTC。CTC 來源于原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶并具有通過循環(huán)系統(tǒng)傳播到遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移灶的潛能，攜帶腫瘤相關(guān)分子譜，可以用于腫瘤診斷和評(píng)估預(yù)后。與健康對(duì)照組相比，早期肺癌患者外周血中能檢測(cè)到一定數(shù)目的CTC[53]。利用二代測(cè)序技術(shù)可以進(jìn)行CTC 全基因組擴(kuò)增測(cè)序或單細(xì)胞全外顯子測(cè)序，了解腫瘤特異性的分子變異，評(píng)估耐藥和分析表型轉(zhuǎn)化[13]。另外，CTC 在融合基因檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)。利用CTC 中的RNA 測(cè)序進(jìn)行ALK 等融合基因變異檢測(cè)，與組織分子檢測(cè)相比具有較高的一致性，并且能夠根據(jù)其動(dòng)態(tài)變化預(yù)測(cè)ALK 抑制劑的療效[54]。但CTC 由于其在外周血中的稀缺性、CTC表型的變異性以及單個(gè)CTC 下游分子分析的局限性，使得其在臨床中的應(yīng)用有待進(jìn)一步提高和改善[55]。外泌體是一種具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡，其在腫瘤患者外周體液中含量豐富，其內(nèi)含有大量的核酸分子，由于外泌體表層的脂膜結(jié)構(gòu)使得包含其中的DNA 和RNA 較cf DNA 更加穩(wěn)定，且外泌體由活細(xì)胞分泌，具有很好的腫瘤特征代表性[56]。二代測(cè)序檢測(cè)外泌體DNA 中的驅(qū)動(dòng)基因變異，可達(dá)到95%的敏感度，并且外泌體DNA 中所檢測(cè)的驅(qū)動(dòng)基因頻率還可進(jìn)一步指導(dǎo)肺癌患者的預(yù)后[26]。應(yīng)用外泌體中的DNA 和RNA 分子進(jìn)行T790 M 耐藥檢測(cè)，可獲得92%的敏感度，而傳統(tǒng)的液體活檢應(yīng)用ct DNA 檢測(cè)T790 M 突變的敏感度僅為58%。應(yīng)用外泌體核酸可以使得一代EGFR-TKI耐藥患者不必要的再活檢率從42%下降到8%[57]。但目前外泌體的獲取和鑒定方法尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，其臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步驗(yàn)證和推廣[58]。除此之外，循環(huán)RNA 和腫瘤教育血小板在肺癌早期診斷中也有一定的價(jià)值，為肺癌患者的液體活檢提供了更多的選擇方式[59-60]。

(三)檢測(cè)方法的權(quán)衡

目前多種方法用于液體活檢，基于熒光定量PCR 平臺(tái)的Cobas、數(shù)字PCR 和二代測(cè)序是常見的3種檢測(cè)方法。Cobas是目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床患者液體活檢的檢測(cè)方法，其檢測(cè)周期短，成本低，覆蓋EGFR 基因的臨床常見和已知位點(diǎn)，但是多中心的研究顯示其敏感度只有72.1%[61]。數(shù)字PCR 是一種絕對(duì)定量方法，其敏感度高于普通PCR[62]，且檢測(cè)閾值能覆蓋低頻突變位點(diǎn)，對(duì)于肺癌患者治療過程中已知靶點(diǎn)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)意義顯著，有助于治療過程中的療效預(yù)測(cè)和耐藥監(jiān)測(cè)[33]。二代測(cè)序是一種高通量測(cè)序方法，可一次檢測(cè)包括點(diǎn)突變、缺失、融合、拷貝數(shù)變異等多個(gè)基因的多種已知和未知變異類型，節(jié)約樣本，一次檢測(cè)覆蓋所有待檢測(cè)的基因[63]，尤其對(duì)耐藥基因的探索有重要意義，且具有較高的敏感度[64]，但檢測(cè)周期往往需要1～2周，價(jià)格成本較昂貴。針對(duì)不同患者的臨床需求，應(yīng)選擇不同的檢測(cè)方法使液體活檢更好地服務(wù)臨床，指導(dǎo)患者的精準(zhǔn)診療。

(四)免疫治療中的應(yīng)用價(jià)值

免疫治療是肺癌診治領(lǐng)域繼靶向治療后又一里程碑式的進(jìn)展，給許多肺癌患者帶來新的希望。在免疫治療獲益人群的挑選上，NCCN 指南依然推薦 在PD-L1 陽 性 且 EGFR、ALK、ROS1 和BRAF陰性或突變狀態(tài)未知的晚期非小細(xì)胞肺癌患者使用免疫治療[21]。PD-L1 表達(dá)以組織檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)，但部分晚期患者由于不能耐受組織活檢而無法進(jìn)行PD-L1 表達(dá)的檢測(cè)。研究者發(fā)現(xiàn)外周血CTC同樣可以用于PD-L1表達(dá)的檢測(cè)，并且能夠進(jìn)行免疫治療的療效預(yù)測(cè)，但是其與組織PD-L1表達(dá)的一致性有待進(jìn)一步提高[65]。除PD-L1表達(dá)以外，T MB是免疫治療另一熱門標(biāo)志物[66]，利用外周血進(jìn)行T MB可以通過界定閾值實(shí)現(xiàn)免疫治療的療效評(píng)估[67]。但無論是組織檢出還是液體活檢，目前對(duì)于T MB的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)仍然沒有統(tǒng)一定論。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)也為實(shí)體瘤免疫治療的療效評(píng)估提供了一定的依據(jù)[68]，液體活檢同樣為其檢測(cè)帶來了新的途徑，并且經(jīng)外周血檢測(cè)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與組織相比具有98.4%的一致性[69]。

毫無疑問，液體活檢為肺癌患者的診治提供了有力幫助，讓更多的患者從中獲益。基于檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)展，液體活檢在靶點(diǎn)檢測(cè)中已經(jīng)與組織分子檢測(cè)有很好的一致性，為后續(xù)治療過程中的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和耐藥檢測(cè)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。作為一項(xiàng)新興技術(shù)，液體活檢仍然存在一定的挑戰(zhàn)。外周循環(huán)中ct DNA、CTC等物質(zhì)的量和穩(wěn)定性受腫瘤分期和腫瘤負(fù)荷的影響，會(huì)影響液體活檢在臨床應(yīng)用中的敏感性。CTC、外泌體的分離和獲取也是限制其臨床應(yīng)用的重要因素。另外，如何更好地利用液體活檢輔助免疫治療也是其未來的發(fā)展方向。借助于科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)展，未來液體活檢必將以其安全、便捷的優(yōu)勢(shì)更好地應(yīng)用于肺癌患者的臨床診療實(shí)踐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突