張 蘋(píng)，翟建昭，劉在栓，趙旭東 綜述，武永康△ 審校

四川大學(xué)華西醫(yī)院：1.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科；2.腫瘤動(dòng)物模型創(chuàng)制及應(yīng)用研究室，四川成都 610041

嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(CAR-T)是過(guò)繼性免疫治療方法之一，通過(guò)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行修飾，使T細(xì)胞表達(dá)靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體(CARs)，從而特異性識(shí)別腫瘤抗原，清除癌細(xì)胞，達(dá)到臨床緩解甚至是根治腫瘤的目的[1]。CAR-T細(xì)胞制造中，CARs的設(shè)計(jì)和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)是兩個(gè)重要方面，前者著重于CARs本身的構(gòu)造，不同的CARs結(jié)構(gòu)在誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)、發(fā)揮細(xì)胞效應(yīng)等方面不同，通過(guò)CARs結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，可以達(dá)到特異性、親和性及毒性之間的平衡，增加抗腫瘤效應(yīng)[2]。后者強(qiáng)調(diào)基因轉(zhuǎn)移的效率、安全性，并與CAR-T的治療成本相關(guān)。CAR-T產(chǎn)品的制造昂貴、費(fèi)時(shí)，并且復(fù)雜多樣。完整的CAR-T細(xì)胞制造流程如下：首先，對(duì)患者或捐獻(xiàn)者外周血中T細(xì)胞分離、富集及激活;其次，將編碼目的基因的CARs在體外與T細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得CAR-T細(xì)胞，然后對(duì)CAR-T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增以達(dá)到臨床治療所需劑量;最后,再應(yīng)用于臨床治療[3]。

1 CARs的基本構(gòu)造及演變

CARs這一概念在1989年由GROSS等[4]在研究中首次提出，它是一個(gè)合成受體蛋白，由識(shí)別并結(jié)合靶抗原的單鏈可變片段(scFv)的胞外區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)及CD3ζ鏈組成的胞內(nèi)區(qū)4部分組成[5]。根據(jù)胞內(nèi)區(qū)的結(jié)構(gòu)不同，CARs分為4代[6]：第1代CARs只有傳導(dǎo)活化信號(hào)的CD3ζ鏈或FcεRIγ，缺乏持久性及增殖能力；第2代CARs在第1代的基礎(chǔ)上添加了共刺激分子CD28、4-1BB、OX40、ICOS等，滿(mǎn)足T細(xì)胞活化的2種信號(hào)，是應(yīng)用最廣泛的CARs；第3代CARs將共刺激分子增加到2個(gè),在研究中顯示出了更強(qiáng)的體外激活及增殖能力[7]；第4代CARs在第2代基礎(chǔ)上添加了白細(xì)胞介素-12，增強(qiáng)CAR-T療效的同時(shí)也避免了全身使用細(xì)胞因子帶來(lái)的不良反應(yīng)。

2 治療靶點(diǎn)選擇及優(yōu)化

合理地選擇和利用靶點(diǎn)是決定CAR-T療效的關(guān)鍵之一。與T細(xì)胞受體不同，CAR-T利用抗原與抗體、受體與配體結(jié)合的特異性，通過(guò)T細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸釋放顆粒酶/穿孔素破壞細(xì)胞，不依賴(lài)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原呈遞識(shí)別，不僅可以用于下調(diào)MHCⅠ類(lèi)分子導(dǎo)致免疫逃逸的腫瘤疾病治療，也能夠識(shí)別除蛋白質(zhì)以外的糖類(lèi)、脂類(lèi)等靶向物質(zhì)[8]。CAR-T治療中，理想的靶點(diǎn)應(yīng)該是對(duì)腫瘤有高特異性、廣泛的腫瘤覆蓋范圍且抗原表達(dá)穩(wěn)定，以此保證腫瘤清除的安全性和效能[9]。

獲取理想的靶點(diǎn)非常困難，通過(guò)對(duì)靶點(diǎn)選擇及CARs結(jié)構(gòu)的優(yōu)化可以增強(qiáng)靶點(diǎn)的性能[10]：使用2個(gè)靶抗原構(gòu)建雙CARs或者在一個(gè)CARs上連接2個(gè)scFv，通過(guò)靶點(diǎn)的識(shí)別互補(bǔ)，可以擴(kuò)大靶點(diǎn)覆蓋范圍；將CD3和胞內(nèi)共刺激分子分開(kāi)構(gòu)建2個(gè)CARs，或者將正常結(jié)構(gòu)CARs聯(lián)合一個(gè)抑制性CARs[胞內(nèi)區(qū)連接抑制性分子如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)或程序性死亡受體1(PD-1)]構(gòu)建雙CARs,前者僅在雙靶點(diǎn)共同表達(dá)時(shí)完全激活，后者通過(guò)非腫瘤細(xì)胞的結(jié)合導(dǎo)致正常CARs激活的抑制，均可提高治療靶點(diǎn)的特異性。同時(shí)，基因突變產(chǎn)生的新抗原具有腫瘤特異性，它主要以肽/HLA復(fù)合物的形式存在，因此，靶向肽/HLA復(fù)合物構(gòu)建CARs是治療的理想靶點(diǎn)。研究中，利用親和素、熒光素、亮氨酸拉鏈等標(biāo)記的scFv制造的通用型CAR-T，能識(shí)別多種靶抗原，可用于治療高異質(zhì)性實(shí)體腫瘤。

3 scFv的合成技術(shù)及研究進(jìn)展

獲取針對(duì)靶抗原的scFv基因序列，是構(gòu)建CARs的重要前提。scFv是具有抗原結(jié)合能力的免疫球蛋白分子的最小單位，通過(guò)基因工程將抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)以VH-linker-VL或者VL-linker-VH的順序連接形成(前者使用頻率更高)[11]，并決定了CARs的特異性。目前，獲取scFv的方法很多，并且技術(shù)成熟度較高。

1975年研究者發(fā)展了雜交瘤技術(shù)，通過(guò)將抗原免疫的小鼠脾臟B細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生永生并大量擴(kuò)增的單克隆抗體細(xì)胞群[12]?，F(xiàn)在，雜交瘤細(xì)胞也被用于篩選Fab、scFv等單克隆抗體片段。在靶向CD19的CAR-T治療中， 多采用FMC63小鼠雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)對(duì)其總RNA進(jìn)行抽提并反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，并針對(duì)可變區(qū)不同序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后對(duì)重鏈和輕鏈可變區(qū)DNA測(cè)序，成功構(gòu)建scFv[13]。由于單克隆抗體多為鼠源性，會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)[14]。采用基因工程技術(shù)對(duì)小鼠抗體進(jìn)行嵌合、人源化及去免疫改造，可降低其免疫原性[11]。但是，采用雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體費(fèi)力且耗時(shí)，小鼠為小型哺乳動(dòng)物，靈敏度不高，并不能夠?qū)μ禺愋钥乖a(chǎn)生高親和抗體反應(yīng)，在一定程度上限制了該技術(shù)的使用[15]。

隨著重組DNA技術(shù)和抗體工程技術(shù)的發(fā)展，1990年，MCCAFFERTY等[16]研究發(fā)現(xiàn)，scFv能夠作為一個(gè)功能性蛋白在噬菌體表面展示并保持其抗原結(jié)合域的活性，以此為基礎(chǔ)發(fā)展的噬菌體展示技術(shù)是第一個(gè)也是最廣泛使用的抗體體外篩選技術(shù)[17]，它可以產(chǎn)生包含數(shù)百萬(wàn)甚至數(shù)十億種不同肽或蛋白質(zhì)的抗體庫(kù)[18]，幾乎可以篩選出任意抗原對(duì)應(yīng)的特異性抗體。大多數(shù)噬菌體展示技術(shù)使用M13絲狀噬菌體[19]，重組抗體基因首先插入到噬菌體外殼蛋白中，然后導(dǎo)入受體菌(如大腸桿菌)中增殖、成熟，重組抗體的基因就與噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式展示在了噬菌體表面，使用靶抗原經(jīng)過(guò)多輪淘選就能獲取特異性抗體[17,20]。噬菌體篩選技術(shù)不依賴(lài)于體內(nèi)免疫反應(yīng),能獲得傳統(tǒng)方法不能獲取的人類(lèi)抗體或者抗自身抗原的抗體，它在細(xì)菌中增殖、培養(yǎng)，速度快、成本低，且噬菌體本身具有穩(wěn)定保存的特性[15,21]，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

除了噬菌體展示技術(shù)，核糖體展示技術(shù)[22]、酵母表面展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠、單個(gè)B細(xì)胞分離[23]等技術(shù)都可用于獲取抗體片段。

4 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)

4.1病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程中，需要一種運(yùn)載工具，將CARs基因插入整合，以促進(jìn)或抑制某種基因的表達(dá)。病毒具有進(jìn)入細(xì)胞并傳遞遺傳信息到細(xì)胞內(nèi)的能力，在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)上應(yīng)用廣泛[24]。目前，最常使用的病毒載體是反轉(zhuǎn)錄病毒科的γ-反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的復(fù)制缺陷載體系統(tǒng)[25]。結(jié)構(gòu)上，所有的反轉(zhuǎn)錄病毒都有編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的gag基因、編碼病毒復(fù)制的反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的pol基因及編碼病毒包膜糖蛋白的env 3種基因，對(duì)于慢病毒，還有tat、rev 2個(gè)調(diào)節(jié)基因及vif、vpr、vpu、nef 4個(gè)輔助基因，負(fù)責(zé)編碼對(duì)病毒復(fù)制、結(jié)合、感染和釋放起重要作用的蛋白質(zhì)[26]?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)一般分為4步：(1)病毒編碼蛋白被目的基因替換，形成表達(dá)載體；(2)通過(guò)外源性補(bǔ)充gag、pol、env、rev(慢病毒所需)基因，提供合成病毒顆粒所需蛋白，形成包裝質(zhì)粒；(3)表達(dá)載體、包裝質(zhì)粒及env包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(如293T細(xì)胞)進(jìn)行培養(yǎng)；(4)對(duì)培養(yǎng)液上層細(xì)胞進(jìn)行過(guò)濾并濃縮獲得高滴度病毒顆粒[27]，儲(chǔ)存在-80 ℃穩(wěn)定保存4—9年[25]。病毒包裝系統(tǒng)是不斷優(yōu)化的，通過(guò)將編碼基因分離構(gòu)建包裝質(zhì)粒、自身滅活長(zhǎng)末端重復(fù)序列、去除所有不必要的序列和輔助基因等方式，可以避免病毒發(fā)生重組產(chǎn)生具有復(fù)制活性的病毒顆粒，增加病毒載體的安全性[28-29]。

慢病毒載體和反轉(zhuǎn)錄病毒載體都有很高的包裝容量，允許基因長(zhǎng)期表達(dá)，并且都會(huì)導(dǎo)致整合位點(diǎn)的插入突變[30]，同時(shí)也各具特點(diǎn)。γ-反轉(zhuǎn)錄病毒載體是最早使CD19 CARs穩(wěn)定表達(dá)的病毒載體[31]，具有很高的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并且可以使用多種穩(wěn)定的包裝系統(tǒng)，但只轉(zhuǎn)錄分裂期細(xì)胞[32]。相比之下，慢病毒載體應(yīng)用更為廣泛，它具有高效的基因轉(zhuǎn)移效率和在目的基因穩(wěn)定表達(dá)的特性，可以轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期的細(xì)胞(不包括處于G0期的細(xì)胞)[33]，并且插入突變風(fēng)險(xiǎn)較反轉(zhuǎn)錄病毒低，表現(xiàn)出更安全的整合特性，但慢病毒缺乏廣泛使用的穩(wěn)定包裝系統(tǒng)，也存在多質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染帶來(lái)的批間差等問(wèn)題[34]，因此，獲得慢病毒載體的方法復(fù)雜且昂貴。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要優(yōu)勢(shì)是相對(duì)容易制造、生產(chǎn)并且有穩(wěn)定的基因整合能力。為了服從臨床安全標(biāo)準(zhǔn)，病毒載體必須證明無(wú)復(fù)制能力、低基因毒性及低免疫原性[27]。

除了逆轉(zhuǎn)錄病毒科，腺病毒相關(guān)病毒、腺病毒、單純皰疹病毒也用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。腺病毒相關(guān)病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂期和非分裂期細(xì)胞，在轉(zhuǎn)導(dǎo)劑量下，一般沒(méi)有致病性或細(xì)胞毒性，其低基因整合率降低了插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，最大的缺點(diǎn)是包裝容量小(<5 kb)；腺病毒也能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂期和非分裂期細(xì)胞，插入突變風(fēng)險(xiǎn)小，包裝容量大(最高達(dá)30 kb)，但存在輔助病毒的污染問(wèn)題及在第1代載體系統(tǒng)中產(chǎn)生先天免疫反應(yīng)等問(wèn)題[35]；單純皰疹病毒是一個(gè)大容量載體(≥30 kb)，具有多個(gè)外源性基因插入位點(diǎn)，具有高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但在腦部等組織中轉(zhuǎn)基因不能長(zhǎng)期表達(dá)，并且存在載體靶向困難等問(wèn)題[36]。

4.2非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)座子是一種自然、可移動(dòng)的遺傳因子，能夠改變自身在基因組中的位置，以一種非病毒的方法修改細(xì)胞基因組[37]。轉(zhuǎn)座子由轉(zhuǎn)座酶基因的DNA片段及兩側(cè)包含轉(zhuǎn)座酶結(jié)合位點(diǎn)的反向末端重復(fù)序列(TIRs)兩部分組成，轉(zhuǎn)座酶與TIRs結(jié)合，可切斷轉(zhuǎn)座子并改變其原有位置。CAR-T治療中，以睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。以基于質(zhì)粒的睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)為例，首先在TIRs之間引入CARs目的基因，將其轉(zhuǎn)入宿主基因組，然后將含目的基因的轉(zhuǎn)座子傳遞到細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座子的TIRs連接，催化轉(zhuǎn)座子的切除與隨后的基因整合，從而轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因[38]。與病毒載體相比，轉(zhuǎn)座子對(duì)基因的負(fù)載能力更強(qiáng)，操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，在臨床試驗(yàn)中也表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且轉(zhuǎn)座子是無(wú)病毒的不連續(xù)的DNA片段，作為核酸載體，它的免疫原性可忽略不計(jì)，也不具有致病性，但具有相對(duì)安全的整合特性，不需進(jìn)行昂貴的生物安全檢測(cè)，可以降低CAR-T治療成本[39]。但是，由于轉(zhuǎn)座子可隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因，帶來(lái)了臨床安全和效率問(wèn)題，天然轉(zhuǎn)座子允許轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因重復(fù)改變基因位置，增加了質(zhì)量控制難度[40]。

mRNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)提供了一個(gè)基于細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)，它突破了人們認(rèn)為mRNA穩(wěn)定性差，無(wú)法作為治療分子的固有思維。mRNA具有高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止或緩慢增殖的細(xì)胞，體外轉(zhuǎn)錄的mRNA可通過(guò)電穿孔或內(nèi)吞等方式進(jìn)入細(xì)胞，不需進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)其功能，因此，mRNA不能整合到基因組中，插入突變的可能性非常低。但是，mRNA由于本身具有不穩(wěn)定和存活時(shí)間相對(duì)較短的特性，會(huì)導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)短暫的表達(dá)[41]。

5 符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)標(biāo)準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品制造

CAR-T細(xì)胞制造的失敗率在2%～14%[42]，主要是由于患者T細(xì)胞數(shù)量少、單核細(xì)胞/粒細(xì)胞等對(duì)白細(xì)胞分離產(chǎn)物的污染及難以獲得足量的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行治療等問(wèn)題造成。作為細(xì)胞免疫療法中的一種，CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)必須符合GMP，并且進(jìn)行完整詳盡的質(zhì)量控制以保證其治療的安全性及有效性。在獲取T細(xì)胞時(shí)，選取合適時(shí)間點(diǎn)采集患者T細(xì)胞(如化療前)、使用健康捐獻(xiàn)者外周血構(gòu)建通用型CAR-T來(lái)優(yōu)化T細(xì)胞產(chǎn)量[43]；在T細(xì)胞富集過(guò)程中，通過(guò)去除潛在的抑制細(xì)胞群(如單核細(xì)胞和粒細(xì)胞)及選取特定的T細(xì)胞亞群，提升標(biāo)本純度以達(dá)到最佳的細(xì)胞終產(chǎn)量；在T細(xì)胞增殖中，選取封閉、自動(dòng)化儀器進(jìn)行T細(xì)胞擴(kuò)增[44]，避免污染的同時(shí)也保證了細(xì)胞質(zhì)量。CAR-T細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)產(chǎn)品鑒別、純度、生存能力、效力等方面的測(cè)試，包括對(duì)表達(dá)目的基因細(xì)胞系的細(xì)胞毒性檢測(cè)及純度檢測(cè)，以及在產(chǎn)品冷凍前進(jìn)行存活率檢測(cè)等[42]。

6 總結(jié)及展望

構(gòu)建效能強(qiáng)、安全性高的CAR-T細(xì)胞是CAR-T精準(zhǔn)高效治療的基礎(chǔ)，選取最優(yōu)的靶點(diǎn)，構(gòu)建效能最佳的CARs結(jié)構(gòu)，獲取最符合特定疾病治療所需的T細(xì)胞，進(jìn)行安全高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及充分的細(xì)胞擴(kuò)增，并且在制造全程進(jìn)行質(zhì)量控制，是CAR-T作為藥物治療疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雖然CAR-T價(jià)格高昂、自動(dòng)化程度不高，很難將CAR-T應(yīng)用于更廣泛的治療人群，但隨著研究進(jìn)展，結(jié)構(gòu)缺陷及技術(shù)短板等方面的難題逐漸解決，無(wú)疑會(huì)有更多安全、高效的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生并應(yīng)用于臨床，CAR-T細(xì)胞治療的潛力是值得期待的。